香菇多糖提取工艺

香菇多糖提取工艺的研究 1  引言 多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中,是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子,尤其是一类重要的信息分子[1]。到目前为止，已有近300种的多糖化合物从天然产物中分离出来，其中植物提取水溶性多糖最为重要。从植物中提取多糖主要根据不同溶解度来选择溶剂进行。香菇多糖的提取一般有热水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法和微波助提法等方法[2]，本文进行了浸提香菇多糖的工艺条件研究，以期获得香菇多糖的最佳提取条件，为其产业化生产提供有效的方法和技术参数。本实验采用各种溶剂和酶的处理,提取香菇多糖,保持多糖的生物活性，效果是明显的。 1.1  香菇多糖的组成与药理价值 香菇多糖(LentinanLNT) 是一种β—1,3—葡聚糖，系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的均一组分的多糖。多糖以甘露糖为主，含少量的葡萄糖、微量的岩藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等；肽链由天冬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等18种氨基酸组成。LNT的化学结构是一种以β—D—[1~3]葡萄糖残基为主链，侧链为(1—6)葡萄糖残基的葡聚糖，平均分子量约为50万道尔顿[3]。 香菇多糖1969年在日本首先发现，自此，国内外学者对LNT作了许多深人的研究。近年来， LNT广泛药理作用研究取得了很大进展。主要的药理价值有：免疫调节作用；抗肿瘤作用[4]；抗病毒作用；对寄生虫、霉菌、细菌等感染均有治疗作用；有抗衰老、抗辐射作用，还具有预防实验性高脂血症和高血糖作用。在临床上LNT还用于治疗小儿反复呼吸道感染，糖尿病，寻常型银屑病，硬皮病，面部扁平，尖锐湿疹等。此外，硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV作用，香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面有良好疗效[5]。作为免疫辅助药物，香菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生、发展和转移，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，延长其寿命。香菇多糖有如此神奇的生物活性，科学家们已经开始在基因水平探讨香菇多糖生物活性的机制。总之，香菇多糖具有广泛的药理作用，而且其疗效好，毒副作用小，是一种应用前景广阔的天然药物。 1.2  香菇多糖提取的现状分析 目前国内对香菇多糖的提取分离有了很大发展，主要采用的方法有传统热水提取法、酸提取法、碱提取法，这些方法都有其优点，也有其难以克服的不足之处。传统热水浸提方法存在能耗高，提取时间长的缺点，其工业化应用和发展受到限制。酸碱处理香菇，反应条件剧烈，提取液又需经过中和反应，很可能破坏多糖的结构，会使香菇多糖的分子量降低，致使药用价值下降。 微波辅助提取法具有设备简单、快速、高效、安全等特点，可供选择的溶剂较多。利用微波强化固液浸取过程是颇具发展潜力的一种新型辅助提取技术[6]。微波 (Microwave) 是频率介于300MHz 和 300GHz 之间的电磁波，频率很高，能够透入物体的深处。微波射线辐射于溶剂并透入细胞内部，可使溶剂及细胞液吸收微波能而温度升高，压力增大。当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，细胞内容物释放出来，转移并溶解于溶剂中，提高了多糖提取率。 近年来生物酶广泛应用于各个领域，在国内也开始将其应用于中草药提取中。多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白多糖的形式存在。试验发现木瓜蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。 1.3  香菇多糖提取的研究意义 多糖是近年来研究最为活跃的高分子化合物，真菌糖由于具有多种生物活性，其研究进展则尤为迅速。目前，从各类生物中提取的具有生物活性的多糖已经成为天然药物的一个新来源。香菇是一种食用和药用真菌，自古以来就被当作健脾益气、调和阴阳、补虚扶正、行气活血的上品。其主要有效成分香菇多糖，经二十多年的研究和应用，证实其具有显著提高免疫力、抗癌、抗病毒、降血脂、防止动脉硬化、抗衰老等多种功能[7]。此外，香菇多糖还具有诱发干扰素和保肝等作用。因此，近年来在国内外形成了一股研发香菇多糖的热潮。 目前，国内的香菇多糖产品有两种，即“口服香菇多糖”和“肌肉注射香菇多糖”，国外的香菇多糖产品有“粉针静脉注射香菇多糖”，由日本独家生产。由于香菇多糖是高分子化合物，分子量大，不易透过血管壁而被吸收，致使口服和肌肉注射的疗效远不如静脉注射。为此，我国和世界其他国家均向日本进口该产品。国内目前有数家单位在致力于静脉注射香菇多糖的开发，虽然现已取得较大进展，但是由于静脉注射香菇多糖要求的纯度高，一般实验室水平达不到要求，因此,研发高效、经济的香菇多糖的提取方法具有重要的现实意义。 1.4  香菇多糖的应用前景 我国是食用菌生产大国, 其中香菇的产量在世界居首位[8]。20 世纪 70 年代以来, 食用菌多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期, 香菇多糖的研究已成为一个热点, 但目前主要集中在香菇中 β-( 1→3) - D- 葡聚糖的研究上, 而其它多糖组分与生物活性之间的关系还有待进一步的明确。香菇多糖不仅是一种比较理想的药物, 也是一类重要的保健食品功能因子, 具有广阔的应用前景, 是当今医药和食品工业共同关注的焦点。但目前多糖的提取率普遍不高, 因此, 提高香菇多糖的提取率已成为进行多糖产品开发需要解决的关键问, 不仅可以考虑将多种提取手段结合起来优化提取工艺, 还可以通过遗传育种、基因重组、物种诱变等手段选育出高产多糖的香菇菌株, 提高香菇中的多糖含量, 以提高香菇多糖的提取率, 降低生产成本。 2  实验仪器、材料及试剂 2.1  主要实验仪器 电热恒温水浴锅                  北京市长风仪器仪表公司 低速自动平衡离心机              上海安亭科学仪器厂 电子天平（精确度为0.0001g）    北京赛多利斯仪器系统有限公司 SHD—Ⅲ型循环水式多用真空泵    保定高新区阳光科教仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱            上海博讯实业有限公司医疗设备厂 SP-2100型分光光度计          上海光谱仪器有限公司 分析用研磨机                  德国IKA Galanz WD800B型微波炉  佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司 2.2  主要实验材料与试剂 干香菇                                                  超市 95%乙醇溶液                                            分析纯 氢氧化钠（NaOH）                                      分析纯 浓硫酸 （H2SO4）                                        分析纯 葡萄糖（C H O ）                                      分析纯  盐酸（HCl）                                            分析纯 氯仿(CHCl3)                                            分析纯  苯酚                                                  分析纯正丁醇                                                分析纯 活性炭                                                分析纯 木瓜蛋白酶                                  酶活力 》50万单位 3  工艺及测定方法 3.1  工艺流程                                        3.1.1 微波辅助工艺方法 原料        烘干      粉碎         称重    热水抽提 微波辐射                                  香菇多糖    干燥        sevag法脱蛋白      醇析、复溶    滤液脱色    抽滤 3.1.2  采用酶解工艺的改进方法 原料        烘干      粉碎         称重    酶水解 活性炭脱色 灭 酶                                  香菇多糖    干 燥        浓缩          复 溶      滤液醇析      抽滤 3.2  多糖的提取方法 将干香菇后粉碎，准确称取2克香菇粉加入一定比例的蒸馏水，在一定温度下浸提数小时，用真空泵减压抽滤，将滤液加入乙醇进行沉淀，离心得沉淀物，将沉淀物溶解后脱蛋白，定容，测吸光度值，然后将溶液浓缩，加入一定体积乙醇进行沉淀，离心，烘干，得到香菇多糖粗品。 3.2.1  除蛋白的方法的选择 香菇中除含大量的多糖外，还含有一定量的蛋白质和其他杂质。目前用于多糖除蛋白的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸法（TCA），其中前两种方法用于微生物多糖，后一种方法用于植物多糖。另外TCA法与Sevag法比较具有蛋白质去除效果高、多糖损失率低、可同时除去大量色素等优点，所以本研究采用Sevag法除蛋白，即将离心分离得到的粗多糖沉淀溶于适量蒸馏水中，加入20%体积的氯仿和7%体积的正丁醇生成絮状凝聚物，3500r/min离心15min除去沉淀。重复上述操作，直至无凝聚物生成。 3.2.2  香菇多糖的脱色及测定方法 活性炭为黑色颗粒, 无臭、无味，具有无毒和脱色、脱臭效果良好的特点, 可以反复使用, 成本低, 适合工业化生产的需要。颗粒活性炭具有惊人的比表面积(800～2000m2/g)[9], 当被脱除的有色物质的分子直径小于或等于活性炭孔的入口直径时, 可被活性炭吸附而起到脱色的效果[10]。活性炭的脱色效率高、速度快、成本较低, 但也存在一些问题, 如再生困难、多肽和氨基酸损失率较高。吸附剂是酶解液脱色的主要影响因素，从液体中脱除颗粒活性炭较容易，所以选择颗粒活性炭并优化其脱色工艺。 用SP-2100分光光度计在色素的最大吸收波长处测其吸光度值[11]。分析表明: 香菇多糖酶解液的吸收峰在350-380nm之间, 最大吸收峰360nm, 故选360nm为测定波长。酶解液原色为棕黄色或褐色, 测其在360nm处的吸光度值1.987[12], 记脱色前OD360nm=1.987。 脱色率(%)=(1.987- OD360nm)/1.987×100 3.3  香菇多糖测定方法 3.3.1  香菇多糖提取率的测定方法 本实验采用苯酚硫酸法测定香菇多糖提取率[13]，并在需要的部分做恒重实验，具体做法如下： 称取烘干的香菇粉2克，加水于一定温度下提取若干时间，冷却后减压抽滤，取滤液，加无水乙醇沉降，脱蛋白，然后再次离心分离即为粗多糖，在水中溶解一定倍数后测吸光度查葡萄糖曲线即得得率。 恒重法是指[14]，经过提取、醇沉、脱蛋白和离心得粗多糖后，将其洗入蒸发皿中，放入电热恒温鼓风干燥箱中，60℃烘干至恒重，并粗算得率。 3.3.2  标准葡萄糖曲线的绘制 采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。准确移取0.6000 mg/ml的葡萄糖标准溶液1.5ml、2.5 ml、3.5 ml、4.5 ml、5.5 ml，分别转移到50 ml容量瓶中定容、摇匀得系列对照品溶液。准确移取上述葡萄糖标准溶液2.0 ml置于25ml具塞试管中，加入4.0%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸4.0 ml摇匀，沸水浴保温15 min后放入冷水中冷却。以试剂空白为参比，选用1cm比色皿在最大吸收波长490 nm处测定其吸光度[15]，得标准曲线。 图 1  苯酚-硫酸法的葡萄糖标准曲线 用最小二乘法进行回归，得标准曲线方程为：A=0.0076x+0.0105，线性相关系数R=0.9972。 3.3.3  提取率的测定 量取纯化后的定量样品，加无水乙醇离心分离，取沉淀，加蒸馏水溶解后转移至50 ml容量瓶中定容,再称取1 ml转移至另一个50 ml容量瓶中定容。准确移取2.0 ml于25ml具塞试管中后按上述方法操作，并根据标准曲线计算多糖提取率。 3.3.4  多糖提取率的计算 多糖提取率(%)＝ ×100% ＝ ×0.9×100% 4  实验方法 4.1  微波辅助热水浸提法的单因素实验 称取香菇干粉移入锥形瓶中按一定料液比加水搅匀，在设定温度的水浴锅中恒温浸提设定时间，转入微波专用杯在额定功率一定的微波炉中处理一定时间，将处理液抽滤，滤液浓缩至一定体积，加3倍体积的95%乙醇醇析[16]，待产生的沉淀物沉淀30min后再离心，将沉淀进行溶解测定，测定完后将其粗多糖干燥至恒重。 以下实验分别是就不同因素对香菇多糖提取的影响进行的讨论。 4.1.1 料液比的选择 香菇多糖提取率随着浸提溶剂的增加呈上升趋势，但是当料液比[香菇干粉质量(g) ：浸提剂体积(ml)]超过1：20时，香菇多糖的提取率增长缓慢。单因素实验中选择料液比水平为  1：10、1：15、 1：20、1：25、1：30。 4.1.2 浸提温度的选择 温度高有利于香菇多糖的浸出，随着温度的升高，提取率增加，但当温度高于80℃时，提取率未见提高；温度高于90℃时，提取率明显降低。这可能是温度过高影响了多糖的溶出，使其得率降低。故单因素实验中选择温度水平为70℃、75℃、80℃、85℃、90℃。 4.1.3  浸提时间的选择 香菇多糖的浸提时间并非越长越好，在一定温度范围内延长浸提时间有利于香菇多糖的浸出。随着提取时间的增加，多糖提取得率也随之增加。但浸提时间大于4h后，提取得率增加不明显，这说明提取4h后溶液中的多糖浓度变小，扩散速度减慢， 达到平衡状态。单因素实验中选择时间水平为1h、2h、3h、4h、5h 。 4.1.4  微波辐射时间的选择 随微波处理时间的延长，提取率上升，而后又下降。这可能由于岁随微波的辐射时间延长，提取率温度升高，香菇多糖发生变性，提取率降低。单因素实验中选择微波辐射时间水平为1min、2min、3min、4min、5min。 4.2  酶解法的单因素实验 香菇处理物在50℃水中浸泡1小时，加热升温至90℃,提取0.5小时后，降至40℃,加入酶制剂,酶促反应80min，中和，补水至1: 100，升温至90℃灭酶并保温浸提2小时，降至室温，真空抽滤，滤液浓缩，乙醇沉淀。 以下实验分别是就不同因素对香菇多糖提取的影响进行的讨论。 4.2.1  浸提温度的选择 当酶解温度不同时酶活力也不同，多糖的提取率也不同，因此实际生产中也可根据需要选择温度。温度太高,就可能使酶蛋白失去活性，降低酶的分解能力。单因素实验中选择温度水平为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。 4.2.2  浸提pH值的选择 当酶解pH值不同时酶活力也不同，多糖的提取率也不同，pH值对酶解提取效果有很大影响，pH值在6～7之间时，多糖提取率最高。考虑生产实际，可选用自然条件下的pH值。单因素实验中选择pH值水平为4、5、6、7、8 。 4.2.3  浸提时间的选择 随着酶解时间的延长，多糖提取率逐渐增加，但香菇多糖的提取率并不随酶促反应时间的延长而显著增加。当酶解时间超过60 min时，多糖提取率变化很小。单因素实验中选择时间水平为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 。 4.3  香菇多糖提取工艺参数的优化 4.3.1  微波辅助热水提取法的正交实验 根据微波辅助热水提取法单因素实验的结果，在单因素实验的基础上，设计4因素（料液比、浸提时间、微波处理时间、浸提温度）3水平L9（34）正交实验，考察因素及水平见表1。 表 1  微波辐助热水提取法因素水平表 水平 因素 A料液比 /(g/ml) B浸提时间 /h C微波处理时间/min D浸提温度 /℃ 1 1:15(A1) 2(B1) 2(C1) 75(D1) 2 1:20(A2) 3(B2) 3(C2) 80(D2) 3 1:25(A3) 4(B3) 4(C3) 85(D3)           4.3.2  酶提取法的正交实验 根据酶提取法单因素实验的结果，在单因素实验的基础上，设计3因素（温度、pH值、时间）3水平L9（33）正交实验，考察因素及水平见表2。 表 2  酶提取法因素水平表 水平 因素 A温度（℃） B时间（min） C pH值 1 45(A1) 30(B1) 5.0(C1) 2 50(A2) 60(B2) 6.0(C2) 3 55(A3) 90(B3) 7.0(C3)         5  结果与分析 5.1  单因素实验结果 5.1.1 微波辅助热水浸提法的单因素实验结果 5.1.1.1  浸提温度对香菇多糖提取率的影响 料液比对香菇多糖提取率的影响设定料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，于80℃水浴锅中浸提4h，然后微波辐射3min，进行抽滤、浓缩、醇析、脱蛋白、测定、干燥至恒重。实验结果如下图2： 图 2  料液比对香菇多糖提取率的影响 由图2看出，随料液比的增大，提取率增加。这可能是因为多糖分散存在于由纤维组成的骨架中，溶剂对多糖的提取必须先使多糖扩散到骨架内部将多糖溶解，然后才能扩散出来。同时，当料液比高于1:20时继续提高料液比，多糖提取率增幅较小，可能是因为多余的提取剂也可以破坏香菇细胞，使得细胞膜受到损害，造成细胞液或者其它的成分溶出，这样溶液的颜色会发生不应该的改变而致使测定结果降低。同时，加水量过大，会使提取液中多糖浓度偏低，而且会增加后续工艺中的提取液的浓缩成本和醇析中的酒精用量，为减轻后续工序负荷，提取剂用量不宜过大，初步选定料液比为1:20。 5.1.1.2  浸提温度对香菇多糖提取率的影响 浸提温度对香菇多糖提取得率的影响设定料液比1:20，浸提时间4h，分别于水浴锅中70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下保温浸提，然后微波辐射3min，进行抽滤、浓缩、醇析、脱蛋白、测定、干燥至恒重。实验结果如下图3： 图 3  浸提温度对香菇多糖提取率的影响 由图3看出，随浸提温度升高，提取率增加，随着温度的升高，多糖在溶剂中的溶解度及扩散系数均会增大，也就是说多糖从香菇中被提取出来的速度将变快，这是有利于多糖提取的。但当温度高于80℃时，提取率未见提高；温度高于90℃时，提取率明显降低。由于高温同样会加速多糖的氧化，当浸提温度超过一定值后，扩散速度的增加已经比不上多糖被损害的速度，多糖的提取率反而会随温度升高而下降。因此，浸提温度应选择80℃。 5.1.1.3  浸提时间对香菇多糖提取率的影响 浸提时间对香菇多糖提取率的影响设定料液比1:20，于80℃水浴中分别浸提1h、2h、3h、4h、5h，然后微波辐射3min，进行抽滤、浓缩、醇析、脱蛋白、测定、干燥至恒重。实验结果如下图4： 图 4  浸提时间对香菇多糖提取率的影响 由图4看出，随浸取时间的延长，提取率增大。但浸提时间大于4h后，提取得率增加不明显。这是因为提取实际上是一个扩散的过程，扩散的原理是梯度差，随着时间的延长这个差也就越来越小，扩散的速度也就越来越慢，所以一定温度范围内延长提取时间有利于多糖的充分浸出。但是因为香菇多糖的还原性又比较强，容易被空气中的氧气氧化，若提取时间过长反而会造成多糖的氧化加重或发生降解反应，导致含量下降，提取出的多糖的量自然也就少了。所以选定最佳浸提时间4h。 5.1.1.4  辐射时间对香菇多糖提取率的影响 微波辐射时间对香菇多糖提取得率的影响设定料液比1:20，在80℃恒温水浴锅中浸提4h，转入微波炉中进行辐射处理，时间分别设定为1min、2min、3min、4min、5min，然后进行抽滤、浓缩、醇析、脱蛋白、测定、干燥至恒重。实验结果如下图5： 图 5  微波处理时间对香菇多糖提取率的影响 由图 5 看出，随微波处理时间的延长，提取率上升，而后又下降。这可能由于随微波辐射时间延长，提取液温度升高，香菇多糖发生变性，提取率降低。因此，微波辐射时间应选择 3min。 5.1.2 酶提取法的单因素实验结果 5.1.2.1  酶解温度对香菇多糖提取率的影响 不同温度对香菇多糖提取率的影响（pH值为7.0、酶水解90min），实验结果如下图6： 图 6  酶解温度对香菇多糖提取率的影响 由图6可知,当酶解温度在50℃时酶活力较高,多糖的提取率最高，与不加酶的香菇空白相比，多糖提取率增加7.74%。但在45～50℃范围内，提取结果无显著差异，因此实际生产中也可根据需要选择温度。温度过低，生物酶活性较低，温度过高,就可能使生物酶受热变性而使其活性降低,降低酶的分解能力。 5.1.2.2  酶解pH对香菇多糖提取率的影响 不同pH值对香菇多糖提取率的影响（温度50℃、酶水解90min），实验结果如下图7： 图 7  酶解pH值对香菇多糖提取率的影响 图7显示，pH值对酶解提取效果有很大影响，这是由于酶对pH值比较敏感，pH值的改变可以改变酶的空间构象而引起酶活性的降低。pH值在6～7之间时，多糖提取率最高。考虑生产实际，可选用自然条件下的pH值。 5.1.2.3  酶解时间对香菇多糖提取率的影响 不同酶解时间对香菇多糖提取率的影响（pH值为7.0、温度50℃），实验结果如下图8： 图 8  酶解时间对香菇多糖提取率的影响 由图8可知，随着酶解时间的延长，多糖提取率逐渐增加，但香菇多糖的提取率并不随酶促反应时间的延长而显著增加。当酶解时间超过90 min时，多糖提取率变化很小，因此酶解时间可确定为90 min。 5.2  正交实验确定最佳提取工艺 5.2.1  正交实验确定微波辅助热水浸提法最佳提取工艺 影响微波辅助热水提取香菇多糖提取率的因素主要料液比、浸提时间、微波处理时间、浸提温度等，以下采用正交法确定微波辅助热水提取香菇多糖的最适条件，结果见表3。通过以下正交实验可以得出微波辅助热水浸提法的最佳工艺条件。 表 3  微波辅助热水提取香菇多糖正交实验结果 实验 号 A料液比/(g/ml) B浸提时间 /h C微波处理时间/min D浸提温度 /℃ 多糖百分比 (%) 1 1 1 1 1 3.96 2 1 2 2 2 7.56 3 1 3 3 3 4.28 4 2 2 3 1 5.44 5 2 3 1 2 4.36 6 2 1 2 3 5.36 7 3 3 2 1 6.02 8 3 1 3 2 5.74 9 3 2 1 3 4.52 K 15.8 15.42 15.06 12.84   K 15.16 17.66 17.52 18.94   K 16.28 14.16 14.66 15.46   k 5.27 5.14 5.02 4.28   k 5.05 5.89 5.84 6.31   k 5.43 4.72 4.89 5.15   R 0.38 0.75 0.95 2.03               由极差分析结果，影响香菇多糖提取率因素的主次顺序为：D>C>B>A，即浸提温度>微波处理时间>浸提时间>料液比，最优水平为A3B2C2D2。 微波辅助提取香菇多糖的最佳提取条件为：料液比1:25，浸提温度80℃，浸提时间3h，微波辐射3min。在此条件下香菇多糖提取得率可达7.70%。 5.2.2  正交实验确定酶解法最佳提取工艺 影响酶解提取香菇多糖提取率的因素主要是酶解时间、酶解温度、酶解pH值等，以下采用正交法确定酶解提取香菇多糖的最适条件，结果见表4。通过以下正交实验可以得出酶解法提取香菇多糖的最佳工艺条件。 表 4  酶解法提取香菇多糖正交实验结果 实验 号 A浸提温度 /℃ B 浸提时间 /min C pH值 多糖百分比 (%) 1 1 1 1 2.56 2 1 2 2 4.67 3 1 3 3 3.12 4 2 1 2 3.31 5 2 2 3 6.51 6 2 3 1 2.25 7 3 1 3 5.45 8 3 2 1 4.60 9 3 3 2 3.25 K 10.35 11.32 9.41   K 12.07 11.11 11.23   K 13.30 8.62 13.24   k 3.45 3.78 3.14   k 4.02 3.70 3.74   k 4.43 2.87 4.41   R 0.98 0.91 1.27             根据极差R值大小知，影响木瓜蛋白酶水解工艺各因素的主次顺序为： C＞A＞B，即pH＞温度＞时间，最佳的工艺条件为　A2B2C3，而正交的试验最佳工艺条件为A3B1C3，经过验证实验，得出最佳酶解条件为A3B1C3 ，得率为6.7%。木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为：时间30min、温度55℃、pH7.0。 6  讨论 6.1  酶解法与微波辅助热水法的比较 6.1.1  提取率的比较 由正交结果可以看出在最佳工艺条件下两种方法的香菇多糖提取率不同，结果见图9： 图 9  不同浓度活性炭对脱色的影响 （图中1表示微波辅助热水法，2表示酶解法） 从图9可知，微波辅助热水法的提取率高于酶解法，可能是因为微波射线辐射于溶剂并透入细胞内部，可使溶剂及细胞液吸收微波能而温度升高，压力增大。当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，细胞内容物释放出来，转移并溶解于溶剂中，提高了多糖提取率。 6.1.2 其它方面的比较 虽然微波辅助热水法的提取率高于酶解法，但是微波辅助热水法浸提时间长，耗费的能量较多，且多糖的纯度不高。酶解法不仅可以使可溶性多糖的提取率增加，并且反应条件温和，能保持天然产物的构象，较好地保持了多糖的药用价值。经木瓜蛋白酶作用后，蛋白酶将与多糖结合的蛋白质酶解，将多糖释放出来,在提高多糖的提取率的同时降低了蛋白质的含量。因此该工艺不仅提高了产率，同时增大了多糖的纯度，简化了多糖的纯化工作，大大增大了经济效益。 6.2  活性炭用量对的脱色效果的影响与多糖损失率的研究 由于香菇菌丝体在80℃烘干后颜色加深, 提取到的粗多糖也有较深的颜色, 因此脱色在多糖的进一步纯化过程中是非常重要的一步。活性炭具有多孔结构, 它能吸附糖液中的色素物质, 具有脱色、脱臭的良好效果。但是, 要得到满意的结果, 必须选择质量好、可溶性灰分和杂质少的试剂, 并注意控制温度、pH值、搅拌与脱色时间等条件。以下讨论活性炭用量对脱色效果的影响。 将香菇多糖酶解液的pH值调至3.5，分别加入不同百分含量的活性炭，在20℃温度下脱色100min，比较活性炭用量对酶解液脱色效果的影响及对多糖含量的影响，结果见图10。 图 10  不同浓度活性炭对脱色的影响 较高浓度的活性炭比低浓度的活性炭的脱色效果要好，但是随着活性炭的浓度的升高脱色率提高，但同时香菇多糖的损失率增加。综合考虑，在允许的多糖损失率范围内，所以应选择适当的活性炭浓度范围，大约1%的活性炭用量最为合适。 6.3  香菇粉粒度对提取率的影响 根据提取理论，样品粒度的大小对提取有一定的影响。香菇粉粒度在80～120目和大于200目时，多糖提取率较高。香菇粉粒度在120～200目之间时，提取率反而较低[17]。这可能是由于粒度较小后，由于多糖对样品颗粒的吸附效应增加，导致溶解于溶液中的多糖量减少。当粒度大于200目后，可能由于一部分的样品细胞结构被破坏，使细胞内多糖的溶出量增加，这一效应大于吸附效应，因此多糖提取率又增加。由此可见，如果采用超微粉碎技术对香菇进行处理，则有可能使多糖提取率大大增加。考虑实际情况，我们在进行提取时，选择的是80～120目的香菇粉。 7 结论 通过微波辅助热水提取法浸提香菇多糖的单因素实验表明，当浸提的料液比为1:20－1:30，浸提时间为3h－5h，浸提温度为80℃－85℃，微波辐射时间为3min－4min，提取次数为1次时，香菇多糖的提取效果较好。在此基础上，用L9（34）正交实验法对香菇多糖提取工艺参数进行优化，对料液比、浸提时间、微波处理时间、浸提温度4个因素在3个水平上进行了实验。结果表明，微波辅助提取香菇多糖的最佳提取条件为：料液比1:25，浸提温度80℃，浸提时间3h，微波辐射3min。在此工艺条件下香菇多糖提取得率可达7.70%。 通过酶解法提取香菇多糖的单因素实验表明，当pH为6－7，温度为50－55℃，浸提时间为30－60min时，香菇多糖的提取效果较好。在此基础上，用L9（33）正交实验法对香菇多糖提取工艺参数进行优化，对pH值、浸提时间、温度3个因素在3个水平上进行了实验。结果表明，酶提取香菇多糖的最佳提取条件为：时间为30min，温度为55℃、pH为7.0。 通过用上述两种方法提取香菇多糖的实验结果表明，微波辅助热水法的提取率高于酶解法，但是微波辅助热水法浸提时间长，耗费的能量较多，且多糖的纯度不高。酶解法不仅可以使可溶性多糖的提取率增加,并且反应条件温和,能保持天然产物的构象,较好地保持了多糖的药用价值。经木瓜蛋白酶作用后,蛋白酶将与多糖结合的蛋白质酶解,将多糖释放出来,在提高多糖的提取率的同时降低了蛋白质的含量。因此该工艺不仅提高了产率,同时增大了多糖的纯度,简化了多糖的纯化工作,大大增大了经济效益。 参考文献 [1]  张惟杰,等.糖复合物生化研究技术[M].浙江:浙江大学出版社,1994,      15-16. 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[17]  李波.酶法提取香菇多糖工艺研究[J].食品科学,2007,28(9):275. 致    谢 本课题是在指导教师吕惠丽老师的精心指导和王颖等同学的帮助下完成的。实验过程中我得到了实验室老师给我提供的良好的实验环境，并对我提出了许多建设性的意见，在此谨对他们表示我由衷的感谢！ 在论文的修改过程中，我的诸位同学和朋友给予了我多方面的帮助，不断地提出修改意见，在此向他们表示衷心的感谢！ 马燕燕 2008年5月19日