土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法) 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖,在纤二糖酶作用下,纤维二糖分解成葡萄糖。所以,纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1)甲苯 2)1%羧甲基纤维素溶液:1g 羧甲基纤维素钠,用50%的乙醇溶至100ml。 3)pH5.5醋酸盐缓冲液: 0.2mol/L 醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L; 0.2mol/L 醋酸钠溶液16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L; 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液。4)3,5-二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸钾钠,用水稀释至250ml(保存期不过7天)。 5)葡萄糖标准液(1mg/mL) 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线:分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中,再补加蒸馏水至1mL,加DNS溶液3ml混匀,于沸腾水浴中加热5min,取出立即泠水浴中冷却至室温,以空白管调零在波长540nm处比色,以OD值为纵坐标,以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中,加入1.5ml甲苯,摇匀后放置15min,再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液,将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后,过滤并取1ml滤液,然后按绘制标准曲线显色法比色测定。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照;如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。) 四、结果计算 纤维素酶活性以72h,1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=(a样品-a无土-a无基质)×n/m 其中:a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数;n为分取倍数; m表示烘干土重 继续阅读