蛋白质化学在秸秆酶解糖化中的应用

蛋白质化学在秸秆酶解糖化中的应用 摘要:本文从酶的分离存化、化学修饰、性质研究和蛋白质上讲述了蛋白 质化学课程对纤维素酶研究过程中提供的帮助,同时总结了纤维素酶当前的研究情况。另外本文也说明了蛋白质化学的研究内容和对学生以后的研究工作中的帮助。 关键词:纤维素酶,性质研究,改造, 正文: 引言:《蛋白质化学》课程在从分子水平上为我们了蛋白质的结构、功能及相互作用关系,以对比形式介绍了很多蛋白质研究及改造方法。作为生物科学专业普通本科生,这门课使我具备了在蛋白质化学领域应拥有的知识储备。同时,这门课对我的生物学科研究方向——秸秆酶解糖化大有帮助。 秸秆酶解糖化关键瓶颈是酶的水解效率及活性保持问题。蛋白质化学从酶的修饰,蛋白质工程,蛋白质结构分析,酶的分离纯化方法上为这两个问题的解决提供思路及研究基础。 有关纤维素酶的研究工作开展前期,研究者通常经盐析、琼脂糖凝胶电泳和离子交换层析对纤维素粗酶液多级纯化[1-4]。如葛飞等带领的研究团队借用硫酸铵盐析、Sephadex G-100 凝胶过滤、DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析柱和CM-Sepharose FF 阳离子交换层析等分离纯化技术,以康氏木霉诱变菌株SG0026 10L菌液为粗酶液,纯化出纤维素酶,并分离三类主要组成酶,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,从而测定了各自的酶活、分子量及各种动力学参数[1]。各研究者对酶分子量的鉴定普遍运用的为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,盐析用盐也多为硫酸铵。另外有的研究者在酶的分离纯化中运用到了透析,超滤等辅助。 在提高纤维素酶的活性和稳定性方面,有的研究者尝试运用固定化技术对酶进行修饰[5]。除传统固定方法之外,王振斌等还尝试使用超声波来对固定化纤维酶进行再次处理,取得一定效果,活性与未加超 声波预处理相比较提高了9.75 %,为酶的修饰改造提供了新思路[6]。郭锐选择球状壳聚糖和经聚乙二醇改性后的球状壳聚糖作为载体,利用共价结合法固定化纤维素酶,以固定化酶活力、比活力、蛋白载量、固定化率作为指标,系统研究了载体活化戊二醛浓度、固定化时间、pH、酶的用量等因素对纤维素酶固定化的影响[7]。 Bund 等[8]采用小分子试剂修饰酶,将马来酸酐连接到酸性纤维素酶上,得到的修饰酶在碱性条件下的稳定性提高。另外,有人尝试利用磁性固定方法对纤维素酶进行固定。但总体来看,利用修饰方法提高酶活性的研究成果还不多。多数化学修饰降低了酶活性,从而确定了纤维素酶活性中心的敏感试剂。韩鸿鹏等利用多种试剂对放线菌所产粗酶液修饰。纤维素酶与修饰前相比,乙酰丙酮和巯基乙醇修饰后的酶活力基本不变,但甲醇和聚乙二醇的修饰导致酶活力明显降低。乙酰丙酮和ME的修饰对纤维素酶活性中心影响较小,而甲醇和PEG 的修饰对纤维素酶的活性中心影响较大[9]。利用化学试剂的修饰同样可以研究纤维素酶的性质。蔡凤等以绿色木霉分泌的纤维素酶为研究材料,用甲基进行修饰。 结果表明,甲基修饰使纤维素酶活性降低。经红外光谱判断,甲醇所修饰的纤维素酶的侧链基团为羧基,是纤维素酶的活性基团[10]。除上述修饰方法外,常见的酶的化学修饰还有交联修饰、定点突变修饰等[11]。 在研究纤维素酶的性质时,除化学修饰外,目前的研究主要集中在酶活测定,离子稳定性,动力学参数,最适酶催化温度及pH,热稳定性等较浅层面。不过也完成了对纤维素酶的的序列测定,以及作用机制。但纤维素酶三大类功能酶均存在两个以上的同工酶。当前对同工酶的分离工作缺乏进展,这是研究纤维素酶研究的一大难题之一。另外,在酶活测定上,全世界缺乏统一可靠且高效的手段,也是制约纤维素酶研究进程的因素之一。 在纤维素酶的基因改造方面,随着分子生物学相关技术的飞速发展,截至到目前,已分离到几十条碱性纤维素酶编码基因,其中大部分来源于芽孢杆菌。之后将碱性纤维素酶基因克隆和表达,并成功构建了碱性纤维素酶的基因工程菌株,从而使酶产量大大提高。Fukumori等从菌株中成功分离到个碱性纤维素酶基因,并将这些基因进行了克隆和测序,根据测序结果确定了幵放读码框的核苷酸序列,从而推断出相应的氨基酸序列,又对菌株分离得到的基因进行了同样的研究,确定了氨基酸序列,之后将种基因克隆至大肠杆菌表达系统中,成功表达。但是,目前建立在基因改造上的蛋白质工程研究结果还较少。 结论 总体来说,蛋白质化学在蛋白质方面为我打下的基础知识,使我可以自如理解国内外论文的研究思想和方法,在我对纤维素酶的学习研究工作中帮助很大。 [1]葛飞,石贝杰,唐尧,朱龙宝,李婉珍,陶玉贵.康氏木霉诱变菌株纤维素酶系的分离纯化与酶学特性研究.2015, Vol.31, No.12 [2]林元山,刘晨辉,王继瑞,陈桂光,梁智群.绿色木霉内切纤维素酶的分离纯化及酶学性质的研究.湖南农业科学2007,(5) 59~ 62 [3]于兆海.里氏木霉的分离纯化及性质研究.南京林业大学 [4]朱年青,夏文静,勇强.里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质.生物加工过程,2010.03.008 [5]刘海洲,张嫒嫒,张广柱,等.固定化酶制备技术的研究进展.化学工业与工程技术,2009,30(1):21-23. [6]王振斌,张杰,王世清,等.超声波预处理对固定化纤维素酶活性的影响.农业机械学报,2011,43(3):150-155. [7]郭锐.固定化纤维素酶的制备及其性质研究性质研究 .2009,天津大学. [8]Bund R K,Singhal R S.An alkali stable cellulase by chemical modification using maleic anhydride.Carbohydrate Polymers,2002,47(2). [9]韩鸿鹏,张丽琴,郝青梅,杨雪,付瑞敏.放线菌产纤维素酶的化学修饰.安徽农业科学.2012,40(4) [10]蔡凤,解彦刚,何晓春.绿色木霉产纤维素酶的分离纯化及化学修饰. 广东农业科学 2010, 7 . [11] 刘军平. 聚乙二醇修饰对去折叠胰蛋白酶的影响,南昌: 南昌大学, 2012.