最新植物生理指标测定方法

实验一  植物叶绿素含量的测定（分光光度法） (张宪政，1992) 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。 二、材料、仪器设备及试剂 试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮） 三、实验步骤 称取剪碎的新鲜样品 0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。       四、实验结果按计算 丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】 叶绿素a的含量（mg/g） =（12.71OD663 – 2.59OD645）V/1000*W 叶绿素b的含量（mg/g） =(22.88OD645 – 4.67OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g） =(8.04OD663 +20.29OD645) V/1000*W 按Inskeep公式 叶绿素a的含量（mg/g） =（12.63OD663 – 2.52OD645）V/1000*W 叶绿素b的含量（mg/g） =(20.47OD645 – 4.73OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g） =(7.90OD663 + 17.95OD645) V/1000*W 注：1、叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用率 【1】 比如阳生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较大 【2】阴生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较小 2、丙酮-------熔点:-94℃ ；沸点:56.48℃；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂. 下一步实验方法比较 【1】95%乙醇直接提取（√） 【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985） 【3】无水酒精和80%丙酮等体积混合提取 实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（(张宪政，1992)） 一、 原理 植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗透的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。 二、方法步骤 1、取样及处理 采用电导法(张宪政，1992)：将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒中带回实验室。将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲洗1~2次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称0.2～0.3 g并剪成切段，放入50 mL带塞试管中，加入20 mL 去离子H2O，浸没样品4~5 h，各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温下进行，用DDs?11型电导仪测其电导率，然后沸水浴15 min，冷却至室温再测一次总电导率值。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。 2、计算： 植物组织浸泡的电导率，特称外渗电导率，此测定方法称外渗电导率法。 （1）外渗电导率 K（us/cm*g) =SQ=测定电导率/称取质量 或    K（us/cm*g*ml）=SQ=测定电导率/称取质量*量取体积 （2）相对电解质渗出率. 电解质渗出率（%）= L1（浸泡液电导率）/ L2（煮沸后电导率）×100 电解质渗出率(%)= L1(浸泡液电导率)-本底电导率/[ L2（煮沸后电导率）-本底电导率]×100 式中：L1：组织杀死前外渗液的电导值；L2组织杀死后外渗液的电导值。 注：1、事先测定水的电导率 2、用吸水纸吸干探头的水分 实验三 植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1.试剂及配制： （1）2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中（原液稀释2.3倍），搅拌加热（70℃）溶解，贮于4℃冰箱中，2-3日有效。 （2）3％磺基水杨酸配配制：3.496g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 （3）10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml， 加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 四、实验步骤 1、脯氨酸标准曲线的制作 1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却。以去离子水溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。 试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 3%磺基水杨酸 2.5﹪酸性茚三酮（ml） 0 2 2 2 4 0.2 1.8 2 2 4 0.4 1.6 2 2 4 0.6 1.4 2 2 4 0.8 1.2 2 2 4 1.0 1.0 2 2 4 每管脯氨酸含量（μg） 0 2 4 6 8 10               1.3标准曲线的绘制 以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的测定 2.1脯氨酸的提取 称取0.2～0.3g叶片于20ml试管 + 10ml 3％磺基水杨酸溶液→沸水浴10min（提取过程中要经常摇动）→冷却过滤于干净的试管中→脯氨酸提取液。 2.2测定 吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸 + 4ml 2.5﹪酸性茚三酮→沸水浴30min→溶液呈红色→冷却→取上层液于比色杯520mm处测定吸光度（A）值。 五、计算结果 从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量： X×提取液总量（ml） 脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝ ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（ml） 公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg） 实验四  植物体内丙二醛含量的测定 一、原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。 二、实验步骤 （1）提取 采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。称取0.2～0.3 g样品，加10%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心10min。 （2）显色 取上清液5 mL，加0.6% TBA 5 mL，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532 nm和600 nm处的吸光度值， 方法一：    MDA质量摩尔浓度(nmol/g)=( A532-A600)×VZ×V1/(0.155×W×V2) 式中：VZ: 反应液总量(4 mL)；        V1: 提取液体积(10 mL)；    V2: 测定用用提取液量(2 mL)；  W: 取样叶鲜重(g) 0.155:为MDA的消光系数（nmol/l） 方法二： 方程组： A450=（85.4×10－3）·C糖 （A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖 解得： A450 C糖= —————— = 11.71A450（mmol·L－1） 85.4×10－3 CMDA= 6.45（A532－A600）－0.56A450（μmol·L－1） 公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值 A532—在532nm波长下测得的吸光度值 A600—在600nm波长下测得的吸光度值 ﹡ —1.55×105为摩尔比吸收系数 C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。 1.  按下式计算提取液中MDA浓度 反应液体积（ml） CMDA × ————————— 1000 提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）= ———————————————