MDA测定方法

植物生理学实验 丙二醛(MDA)的测定方法 一、实验原理 植物在逆境下遭受伤害(或衰老)与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关,膜脂过氧化的产物有丙二醛、二烯轭合物、乙烷等。其中丙二醛(MDA:Malondialdehyde)是膜脂过氧化最重要的产物之一,因此可以通过检测MDA了解膜脂过氧化程度,以间接测定膜脂受损程度以及植物的抗逆性。 丙二醛在高温条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮),该物质在532nm处有一吸收高峰,并且在660nm处有较小光吸收。根据其532nm处的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。醛、可溶性糖对此反应有干扰,在450nm处有以吸收峰,可用双组分分光光度法加以排除。二、仪器设备 紫外可见分光光度计; 离心机; 电子天平; 研钵; 恒温水浴锅; 试管; 剪刀。 三、主要试剂 1、10%三氯乙酸(TCA) 2、0.5%硫代巴比妥酸(用10%的三氯乙酸溶解); 3、石英砂。 四、实验材料 正常生长以及受逆境胁迫的小麦叶片 五、实验步骤 1. 取小麦不同部位的叶片3~5片,洗净擦干,剪成0.5 cm长的小段,混匀。 2. 称取叶片切断0.3 g,放入冰浴的研钵中,加入2 ml 10%TCA 和少量石英砂,研磨至匀浆, 植物生理学实验 4. 然后在 4℃,12, 000 g 离心 15 min,取上清。 5. 吸取离心的上清液1.5 ml(对照加1.5 ml 10% TCA),加同 体积 0.5% TBA溶液,混匀物于沸水浴上反应30 min,迅速冷却后 再离心。 6. 取上清液测定532nm、450nm和600nm波长下的消光度。 六、计算含量 根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量: MDA浓度(μmol L-1) = 6.45*(OD535-OD600)-0.56*OD450 MDA含量(μmol/g FW)= (MDA浓度(umol/L)*提取液体积(ml)) / 植物组织鲜重(g) 七、注意事项 1. MDA-TBA显色反应的加热时间,最好控制沸水浴15-30 min之内。 时间太短或太长均会引起532 nm下的光吸收值下降。 2. 如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机 离心。 3. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收(最大吸收在 450 nm),当植物处于干旱,高温,低温等逆境时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干扰。