动物实验技术：人类疾病动物模型

人类疾病动物模型第一节概述一、定义 人类疾病动物模型(Animalmodelsofhumandiseases）是指为阐明人类疾病的发生机理及建立预防、诊断和治疗而制作的具有人类疾病模拟现的实验动物二、建立人类疾病动物模型的意义意义： 人类的替难者，避免了在人身上进行实验所带来的风险； 可按研究者的需要获得实验； 缩短研究周期； 可控制各种实验条件，结果可比性强，重复性好； 可提供发病率较低的疾病材料 有助于更全面认识疾病的本质 药物的药效学研究和安全性评价 为教学服务，提供直观生动的教学效果三、人类疾病动物模型的设计原则：一个好的动物模型应具有以下特点1、相似性：动物模型应与相应的人类疾病有类似之处，尽可能再现所要研究的人类疾病的病理变化。2、重复性：理想的模型应是可重复、可化的。标准的动物、标准的环境、标准的饲养管理、标准的实验器材、标准的实验操作。3、可靠性：复制模型应特异地、可靠地反映该种疾病或某种机能、代谢、结构变化，同时应具备该种疾病的主要症状和体征，并经受一系列检测得以证实。 4、适用性：复制模型应尽量考虑今后临床能应用和便于控制其疾病的发展，动物背景资料要完整，生命史能满足实验需要。5、易行性和经济性：动物经济而来源充足，便于转运，易于关养。在同等条件下，优先使用标准化的实验动物。6、安全性：动物模型应不对实验人员和其它人员的生命安全产生威胁。 第二节动物模型分类按产生原因分类 1、诱发性动物模型（experimentalanimalmodel） 2、自发性动物模型（spontaneousanimalmodel） 3、抗疾病型动物模型（negativeanimalmodel） 4、生物医学动物模型（Biomedicalanimalmodel） 按产生原因分类1、诱发性动物模型（experimentalanimalmodel）又称为实验性动物模型，指通过使用物理、化学、生物等致病手段，人为制造的疾病模型。优点：制作方法简便，实验条件比较简单，其他因素容易控制，短时间内可大量复制。缺点：诱发的疾病模型与自然产生的疾病在某些方面有所不同。而且有些人类疾病不能用人工方法诱发出来。物理因素诱发：如手术致骨折、放射线致免疫抑制化学因素诱发：如高油脂饲料致兔动脉粥样硬化、化学毒物中毒生物因素诱发：如微生物感染复合因素诱发：如豚鼠慢支用致病菌加寒冷或加SO2生物技术制作的动物模型：如嵌合体动物、转基因动物、克隆动物等2、自发性动物模型（spontaneousanimalmodel）指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自然产生的疾病，或者由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。以肿瘤遗传性疾病居多。优点：是在一定程度上减少了人为的因素，更接近自然的人类疾病。缺点：种类有限，疾病动物饲养条件要求高，发病率低，发病时间长。自发肿瘤模型因动物种系、品种不同，其肿瘤所发生的类型和发病机制有差异。 自发性动物模型应用价值很高，特别是在遗传性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等的研究上得到了广泛应用。近几十年来科学界十分重视自发性动物模型的开发。如与人类疾病相似的心脏病的加拿大犬；与儿童碳水化合物、氨基酸代谢失调相似的猫；自发性高血压和脑中风大鼠；青光眼兔；自发性糖尿病地鼠；肥胖症小鼠；裸鼠：肺癌、淋巴肉瘤、白血病等等。3、抗疾病型动物模型（negativeanimalmodel）是指特定的疾病不会在某种动物身上发生。因此可借以探讨为何该种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳类动物均感染血吸虫病，而洞庭湖流域的东方地鼠却不能复制血吸虫病，故可用于血吸虫感染和抗病的研究。4、生物医学动物模型（biomedicalanimalmodel）是指利用健康正常的动物生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型。鹿的正常红细胞是镰刀形的，多年来一直用于镰刀形红细胞贫血研究。如沙鼠缺乏完整的脑基底Willis动脉环，动脉环后交通支，可用来结扎一侧颈动脉制备脑梗塞、脑缺血模型（三）按模型对象分：整体动物模型、离体组织器官模型、细胞株模型、数学模型（四）按中医药体系分中医证候动物模型：阴虚、阳虚、气虚、血虚、脾虚、肾虚动物模型，厥脱症动物模型三、影响动物模型的因素1、致模因素①研究目的②人类疾病的致病因素，临床症状和发病机理在动物上的区别2、动物因素（种类、品系、年龄、性别、生理状态等）3、实验技术因素（昼夜、麻醉深度、手术技巧、给药途径、对照组）4、环境和营养因素（温度、湿度、噪音光照、饲料等）第三节肿瘤动物模型 一、诱发性肿瘤模型诱发性肿瘤模型是使用致癌因素(Carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型，原理是利用外源性致癌因素引起细胞遗传特性异常而呈现出异常生长和高增殖活性，形成肿瘤。外源性致痛因素主要有化学性、物理性及生物性致癌物，其中化学性致癌物(Chemicalcarcinogens)最常见：化学性致癌物(Chemicalcarcinogens)苯并芘（benzpyrene）甲基胆蒽（MC）联苯胺（benzidine）亚硝胺类（nitrosamine）黄曲霉素类（aflatoxin）物理性方法主要是放射性物质致瘤，用放射线照射或局部注射放射性同位素。生物学方法是用能诱发动物肿瘤的病毒致癌，如：小鼠白血病病毒（Murineleukovirus，MLV），Rous鸡肉瘤病毒，SV40病毒。以及用转基因的方法诱发动物产生肿瘤，可根据启动子类型的不同选择不同的发瘤器官，如用乳球蛋白启动子的SV40T抗原的转基因小鼠，可诱发乳腺癌或胰腺癌。MMTV-Wnt-1转基因小鼠高发乳腺癌 用于诱发实验性肿瘤的动物种类很多，以啮齿动物的使用最多、应用最广，包括各种大鼠、小鼠、豚鼠等 （一）诱发方法诱发性动物肿瘤的诱发方式包括原位诱发和异位诱发。原位诱发是指将致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤。异位诱发是将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而产生的该组织或器官的肿瘤。 1.涂抹法（皮肤癌） 2.经口给药法（消化道或消化腺) 3.注射法 4.气管灌注法（肺癌） 5.穿线法 6.埋藏法（二）常见的诱发性肿瘤动物模型 1.肺癌（Carcinomaofthelung) [简述]：在实验动物身上诱发肺癌，要比诱发其他肿瘤困难得多，诱癌率低，呼吸道给药的方法常常诱发多种肺外肿瘤而不是肺肿瘤。 [方法]：①二乙基硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌：小鼠每周皮下注射1％DEN水溶液1次，每次剂量为56mg／kg；②乌拉坦诱发肺腺癌：小鼠(A系，1-1.5月龄)每次每只腹腔注入马拉坦生理盐水液0.1-0.3ml，间隔3-5日再注，共注2-3个月每只小鼠用量约为100mg [特点]：①DEN总量达868mg，观察时间为100天，发癌率可达40％，DEN总量达1176mg，观察时间为半年时，发癌率可达94％，其中支气管鳞状细胞癌占41％。 ②乌拉坦注后3个月肺腺癌发生率为100％，且多数为多发性，诱发肺肿瘤的部位和组织分型与人类肺肿瘤相近似。 2.食管癌（Carcinomaofesophagus) [简述]：亚硝胺在体内经过代谢，产生烷类化合物，使核酸或其他分子发生烷化而致癌．不对称亚硝胺口服或胃肠道给药，均能诱发大鼠食管癌。 [方法]：①甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱发食管癌：将1％MBNA溶液加在少量的粉末状饲料中，搅拌均匀，出1月龄以上Wistar大鼠自由摄食．结药量每天0.75～1.5mg/kg②二烃黄樟素诱发大鼠食管癌模型：在大鼠饲料中加入微量（1/2500～1/10000）黄樟素喂养大鼠诱发率达20％一70％ [特点及应用]：甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发的食管癌可见食管鳞状细胞癌的组织，但很少发生转移；亚硝胺致癌性较强，大剂量1次给药，即可致癌。 3.肝癌（Carcinomaoftheliver) [简述]：常用口服致肝癌的物质有乙基亚硝胺(DEN)，4-2甲基氨基偶氮苯(DBA)、2-乙酰氨基酸(2AAF)．亚胺基偶氮甲苯OAAT和黄曲霉素。 [方法]：①DEN诱发大鼠肝癌：取体重250g左右的封闭群大鼠给与0．25％DEN水溶液0．25-1mL灌胃或稀释10倍放在饮水瓶中自由饮水，剂量为每天2-10ml/kg，喂养半年左右②黄曲霉素诱发大鼠肝癌：每月饲料中含0．001～0.015mg/kg混入饲料中喂6个月左右。 [特点及应用]： DEN诱发大鼠致癌率为70％．DBA诱癌率为60％，黄曲霉素诱发大鼠肝癌发生率为80％，此种方法从病因学角度，与人体肿瘤较为近似，故此类模型常用于肿瘤特点的深入研究。 4.宫颈癌（Carvicalcarcinoma)用穿线法将附有0.1mg二甲基胆蒽（DMC）的棉沙线结穿入雌性小白鼠的宫颈部，并固定缝线。观察半年左右处死动物，取宫颈组织。二、动物自发性肿瘤模型及移植瘤株 （一）各类动物自发瘤 （1）小鼠肿瘤 ①小鼠乳腺肿瘤：在各品系小鼠中，C3H系雌性小鼠乳腺肿瘤发生率最高，达99％～100％；A系经产雌鼠乳腺肿瘤发生率约为60％～80％ 参照Dunn分类，小鼠乳腺肿瘤分为A、B、C三型：A型为典型乳腺腺瘤。B型包括乳头状囊腺瘤、单纯瘤及导管内瘤等。C型又称纤维瘤和腺纤维瘤。 ②小鼠肺肿瘤：小鼠自发性肺肿瘤主要见于18月龄以上的A系、SWR系小鼠其肺自发瘤发生率分别达90％和80％。经产PRA小鼠发生率也很高（77％）。 病理学类型主要是腺瘤，有良性和恶性之分。 ③小鼠白血病：C58、AKR、Afb等品系小鼠的白血病多发，8～9月龄的AKR小鼠白血病发生率高达80％～90％。形成的白血病以淋巴细胞性白血病为主。 （2）其它动物自发瘤 ①大鼠内分泌肿瘤和恶性淋巴瘤，跟品系和年龄有关。 ②金黄仓鼠是实验性肿瘤研究中常用的一种动物，自发瘤发生率的（0.5％～17％），主要发生于神经系统和膀胱以外的组织和器官。 ③兔类自发瘤发生率很低，仅为0.8％～2.6％，以乳头状瘤和子宫腺瘤最为常见。 ④两栖类自发瘤：以蛙的实验性肿瘤最常用。如豹蛙肾肿瘤（发生率约2.7％） ⑤鸟类的自发性肿瘤也比较常见，特别是鸡肿瘤最常见，发身率约10％～20％，且多属恶性，以肌原性肉瘤和白血病为多。如发生上皮源性肿瘤，则几乎均为鳞状上皮瘤。 （二）动物移植瘤 动物自发瘤可移植性肿瘤就是将动物自发性肿瘤移植到同系、同种或异种动物体内生长并经传代后组织学类型稳定，生长特性(包括接种成活率、生长速度、自动消退率、宿主寿命与宿主反应等)已趋稳定，其侵袭和转移的生物学特性．以及对化疗药物的敏感程度均已确定；能在同种或异种动物体内继续传代形成可移植性肿瘤即瘤株。 1．小鼠可移植性乳腺癌 2．小鼠可移植性肺腺癌 3.小鼠可移植性肝癌 4．小鼠可移植性宫颈癌 5.小鼠可移植性淋巴造血系肿瘤三、人体肿瘤的免疫缺陷动物移植模型Rygaard和Povlson1969年首次将人结肠癌在裸鼠上移植成功。迄今为止，世界上建立的人体肿瘤免疫缺陷动物移植模型达400种以上。第四节各系统疾病动物模型 一、消化系统疾病动物模型 （1）四氯化碳肝硬化（hepatocirrhosis）动物模型：Wistar或SD大鼠，皮下注射40％～50％四氯化碳（CCl4），同时饲以玉米面（混入0.5％胆固醇） （2）胆石症病动物模型（Animalmodelofcholelithiasis） ①食饵法：选叙利亚仓鼠、大鼠、犬或猴，食饵配方为蔗糖74％，酪蛋白21％，食盐4.4％，胆碱0.1％，鱼肝油0.5％，数月内形成结石，成石率高达100％ ②感染法：兔或大鼠，无菌条件下剖腹，露出十二指肠，从十二指肠乳头逆行插入一塑料管进入胆囊，从中注入蛔虫卵或大肠杆菌悬液。 ③胆总管结扎法 ④切除迷走神经干（食管下端）法 ⑤异物植入法（蛔虫碎片、线结、橡皮等） （3）溃疡病动物模型（Animalmodelofpepticulcer） 应激法：用饥饿、刺激寒冷等方法造成溃疡，大小鼠采用水浸法造成的胃溃疡模型较为稳定。 幽门结扎法：大鼠较为适宜，结扎幽门18小时后使用。 乙醇损伤法：大鼠禁食48小时后灌服无水乙醇 药物法：可给大鼠或小鼠，注射一定量的组胺、皮质激素、利血平或水杨酸等 根据不同的要求选择不同的方法。二、呼吸系统疾病动物模型 （1）慢性支气管炎动物模型（Animalmodelofchronicbronchitis） 二氧化硫吸入法：选择小鼠，SO22％，每天10S 烟雾吸入法：选择大鼠，强、弱，香烟吸入法 （2）肺气肿动物模型 给予水解酶类（猪胰弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶） ①雾化吸入法 ②气管内滴入法 （3）支气管哮喘模型（Animalmodelofbronchialasthma） 一般使用豚鼠，氯化乙酰胆碱和磷酸组胺溶液混合，喷雾吸入，可用鸡蛋白先行致敏。 犬多次暴露于过敏源，也可引起哮喘。 （4）肺炎动物模型（Animalmodelofpneumonia） 微生物接种兔或豚鼠的气管和肺部 大肠杆菌 克雷伯杆菌 支原体（金黄地鼠） 仙台病毒（小鼠） 腺病毒 （5）肺结核动物模型（Animalmodelofpulmonarytuberculosis） 注射弗氏佐剂后感染结核杆菌（采用雾化吸入的方法），常用动物是豚鼠三、心血管系统疾病动物模型 （1）动脉粥样硬化动物模型（Animalmodelofatheromatous） 在动物饲料中加入过量的胆固醇和脂肪，饲养一段时间后，其主动脉及冠状动脉内逐渐形成粥样硬化斑块，常用大小鼠、兔和小型猪。小型猪是最理想的模型。 （2）心肌缺血和心肌梗塞动物模型（Animalmodelofmyocardialischemiaandinfarction） ①电刺激法：雄性家兔，用不锈钢钢针定向插入右侧下丘脑背侧核，以强弱电流分别刺激，每次5min，间隔1～3min ②药物法：大鼠和家兔注射异丙基肾上腺素，犬注射麦角新碱。 ③冠状动脉阻断法： 闭胸式选择性冠状动脉插管法（犬颈动脉插管注入汞） 开胸结扎冠状动脉法 离体心脏灌注冠状动脉结扎缺氧法 冠状动脉血栓法 （3）高血压动物模型（Animalmodelofhypertension） ①自发性高血压大鼠（Spontaneoushypertensiverat，SHR）由日本学者Okamoto培育的突变系大鼠，该鼠自发性高血压的变化与人相似，是目前应用最广泛的高血压模型，它可产生脑血栓、梗塞、出血、肾硬化、心肌梗塞和纤维化等变化。三、泌尿系统疾病动物模型 （1）IgA肾炎动物模型（AnimalmodelofIgAnephritis） ①小鼠口服牛γ球蛋白，同时口服环磷酰胺和雌二醇 ②小鼠口服乳白蛋白，同时以胶状碳封闭小鼠的单核-巨噬系统 ③口服BSA，加部分肝切除 结扎大鼠胆管 （2）慢性肾功能衰竭动物模型（Animalmodelofchronicrenalfailure） ①用物理方法减少或破坏肾组织 部分肾切除 液氮冷冻、电热灼伤、或结扎肾动脉分支以造成大部分肾单位损毁 ②用肾毒性药物破坏肾组织 常用的肾毒性药物有嘌呤霉素（Puromycin）、阿霉素（Adriamycin）和重金属盐类 ③用免疫方法破坏肾组织 用含有针对肾脏组织的抗体的血清或蛋白，注射大鼠或小鼠 ④自发性慢性肾衰模型（AmimalmodelofspontaneousCRF） 老龄大鼠和FH大鼠比较明显四、神经系统疾病动物模型 （1）脑血管疾病动物模型（Animalmodelofcerebralvasculardisorders） ①局灶性脑缺血模型（Animalmodelofregionalcerebralischemia） 沙鼠结扎一侧颈总动脉 家兔阻断大脑中动脉法 犬大脑中动脉栓塞法 ②全脑缺血动物模型（Animalmodelofwholecerebralischemia） 沙鼠结扎双测颈总动脉 大鼠4血管关闭法 （2）癫痫动物模型（Animalmodelofepilepsies） ①大鼠部分简单性癫痫模型：电极在脑皮层表面，模拟外伤性癫痫。 ②大鼠复杂部分性癫痫模型：电极在双测海马CA1区，也可在双侧杏仁核团，属点燃效应模型，术后可自发癫痫。 （3）Parkinson病（PD）动物模型（Animalmodelofparkinsondisease） ①旋转大鼠模型：利用神经毒剂6-羟基多巴胺破坏黑质的多巴胺神经原。 ②灵长类动物Parkinson病模型：恒河猴颈动脉注甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)五、造血系统疾病动物模型 （1）再生障碍性贫血动物模型（Animalmodelofaplasticanemia） ①药物诱发动物再障模型：家兔或小鼠口服马利兰，皮下注射纯苯。 ②放射性同位素内照射动物：32P静脉注射小鼠。 ③免疫介导法引起再障模型：BALB/c小鼠经γ射线亚致死量全身照射后，尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴结混合细胞 （2）白血病动物模型（Animalmodelofleukemia） Ｔ淋巴细胞白血病小鼠（L615）动物模型：由白血病病毒诱发，在615小鼠连续传代，30代后建成的稳定的白血病模型。六、内分泌及代谢性疾病动物模型 （1）糖尿病动物模型（Animalmodelofdiabetesmellitus） 糖尿病专家估计，中国大陆的糖尿病患者已有二千五百万名。若加上潜在人群，受糖尿病威胁的总数达到四千万人，并且每年以百分之一的速度增长。每年消耗的社会资源约五百亿元人民币。糖尿病是一种常见的慢性疾病，由于遗传因素和多种环境因素联合作用使胰岛素分泌绝对或相对分泌不足，引起糖类，蛋白质，脂肪的代谢紊乱，临床表现为高血糖的一组全身性代谢紊乱的疾病。自发性糖尿病模型 KK糖尿病小鼠：2型 NOD/LtJ小鼠:1型 BBWistar大鼠：1型 肥胖性糖尿病Wistar大鼠：2型 糖尿病地鼠：2型七、骨骼系统疾病动物模型 （1）长骨干骨折动物模型（Animalmodeloflongboneshaftfracture） （2）长骨干缺损动物模型（Animalmodelofbonedefects） （3）兔膝关节软骨缺损动物模型（AnimalmodelofArticularcartilagedefectsoftheknee）第五节传染性疾病动物模型 复制传染性疾病的动物模型可以采用生物、物理和化学等因素人工诱发，也可利用自然状态下感染的动物即自发性感染模型。 一、病毒性肝炎动物模型(Animalmodelofviralhepatitis） （1）狨猴、红面猴、黑猩猩等灵长类动物人工感染人类肝炎病毒。 （2）用动物肝炎病毒模拟人类肝炎病毒（鸭肝炎病毒DHBV、旱獭肝炎病毒WHV） 二、SARS感染动物模型 恒河猴和食蟹猴等灵长类动物接种SARS病毒，可以引起所有实验猴发生间质性肺炎其病理学改变与人类感染SARS病毒后肺部病变近似，但病变的严重程度比较人类轻得多 三、甲型HINI动物模型小型猪？恒河猴？其它动物？第六节创伤动物模型 一、烧伤动物模型（Animalmodelofburninjury） 实验前准备：选择动物，精确计算 （1）体表烧伤： 沸水或热水浸烫 火焰烧灼 热金属烤灼 电光源烧伤 （2）吸入性损伤： 蒸汽吸入（小型高压锅） 烟雾吸入（发烟材料） 二、辐射伤动物模型 需精确计算辐射量，一般为Co60γ射线照射 光辐射 三、冲击伤动物模型（Animalmodelofblastinjury） （1）常用冲击伤模型 需用激波管，可造成脏器和组织受损 （2）减压或负压伤动物模型 用负压舱和真空泵 四、高速投射物致伤动物模型（Animalmodelofhighvelocityprojectileinjury） 常用犬和猪，用滑膛枪致伤，研究弹丸对动物的损伤，观察弹道形状特点，测量生物学数据。 五、撞击伤动物模型（Animalmodelofimpactinjury） 用兔、犬、猪等大动物，生物撞击机致伤，常见部位为颅脑，胸部和脊柱。作业 1.WhatisAnimalmodelsofhumandiseases?2.动物模型按产生原因分哪些类？分别是什么？