大肠杆菌O_157_H_7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子_cropped

大肠杆菌O_157_H_7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子_cropped (1. 成都军区联勤部军事医学研究所 ,云南昆明 650032 ; ) 2 昆明市疾病预防控制中心 ,云南 650034 ;3 中国人民解放军 77296 部队卫生队 ,云南 650500 ( ) 〔目的〕对驻滇部队感染性腹泻患者 、猪和污水进行大肠杆菌 O?HE O?H的分离鉴定 。〔〕用 157 7 157 7 摘 要 O免疫磁珠富集后 ,接种 S - MAC 琼脂平板培养 ,用 MUG 试验初筛 ,VIATEK全自动微生物鉴定仪鉴定 ,应用复合 PCR 15732 法同时检测其三个毒力因子 。〔结果〕从腹泻患者和猪中检出 E coli O?H,该菌具有三个毒办因子 。〔结论〕云南战区 157 7 部队存在 E coli O?H感染 。复合 PCR 法的建立 ,为腹泻研究领域的病原学监测和流行病学调查提供了新手段 。 157 7 关键词 大肠杆菌 O?H;免疫磁珠 ;复合聚合酶链反应 ;毒素基因 157 7 Isolation and identif ication of E coli O?Hand simultaneous detection of its 3 toxin genes with multiplex PCR 157 7 Zhu Yuanyuan , Xu Qing , Li Gangshan , et al . Institute of Military Medicine of Chengdu Command , Kunming 650032 , China Abstract 〔Objective〕To isolate and identify E coli O157 : H7 in sufferers of diarrhea ,pigs and sewage in the army in Yunnan Province .〔Methods〕E coli O?Henriched by immune magnetic beads was inoculated into S - MAC plate ,filtrated by MMG test and 2i 157 7 dentified by KITEKmicroorganism automatic identifier. Meanwhile ,3 kinds of its toxin genes were simultaneously detected by multiplex 32 PCR. 〔Results〕 E coli O?Hcontaining the 3 kinds of toxin genes were detected in diarrhea sufferers and pigs.〔Conclusions〕Infec2 157 7 tion of E coli O?Hexists in the army in Yunnan Province . The multiplex PCR is a new means for detection and epidemiological inves2 157 7 tigation of diarrhea pathogens. Key words E coli O?H; Immune ma gnetic be a d ;Multiplex PCR ; To xin ge ne 157 7 + 〔中图分类号〕R378. 2 1 〔文献标识码〕A ( ) 近年来大肠杆菌 O?HE coli O?H引发的食物中毒 GNI + 卡进行系统鉴定 。鉴定仪 157 7 157 7 (在美国 、加拿大 、日本 、英国 、澳大利亚 、阿根廷接连不断发生 , 1. 4 毒力试验 实验小白鼠体重 15,18g 昆明医学院实验动 ) 1982 年在美国俄勒冈与 密 歇 根 州 发 生 E coli O?H暴 发 以 物科提供。将分离的 E coliO?H接种普通肉汤 ,臵 37 ?培 157 7 157 7 来 ,至 1995 年底美国暴发流行近 50 起 ,每年约 2 万人受到感 养 18,24h 。实验组腹腔注射 0. 5ml/ 只 ,每株菌注射 3 只 。对 1染 。1996 年日本报道 E coli O?H感染 9000 余人 ,至少有照组同法注射无菌肉汤 ,观察 5d 。 157 7 12 人死亡 。目前 E coli O?H感染呈全球流行 ,已被认定是1. 5 药敏试验 用法国生物梅里埃 VITEK32 全自动微生物鉴 157 7 定仪对分离菌做抗生素敏感试验 。70 年代以来新发现的 28 种传染病的病原体之一 。我国 1987 年首次从腹泻患者粪便中检出 E coli O?H,至今未发现暴发 1. 6 毒素基因检测 157 7 流行 。但已在 北 京 、江 苏 、山 东 等 地 的 腹 泻 患 者 中 分 离 到 E 1. 6. 1 提取 DNA 模板 将 3 株分离菌分别接种于 3ml LB 肉 2 μcoli O?H, 故 应 引 起 足 够 重 视。随 着 生 物 技 术 的 迅 猛 发 汤 ,37 ?振荡培养 6h ,取该培养液 200l 于 1. 5ml 离心管中 ,用 157 7 展 ,特别是分子生物学技术在实际工作中的应用 ,为 E coli O 玻璃粉吸附法提取 DNA 模板 。 157 ( )?H毒力基因检测提供了新的方法和手段 ,拓宽了研究前景 。 1. 6. 2 PCR 扩增 针对 E coli O?H的志贺毒素 I SLT I 7 157 7 ( ) 为了解 E coli O?H在部队的感染及毒力基因存在的情况 , 志贺毒素 ?SLT ?和侵袭相关基因 ,了三对引物 ,采用 157 7 2002 年夏季 ,我们对云南战区部分部队的腹泻患者及战区的 复合 PCR 扩增法 ,即一次扩增反应可以同时检测三种基因的 猪和污水标本进行了 E coli O?H的分离鉴定 ,共检出 3 株 , 存在 。157 7 其中腹泻患者标本 1 株 ,猪粪便标本 2 株 ,污水中未检出 。我 1. 6. 3 反应条件 95 ?预变性 5min ,94 ?变性 1min ,58 ?退火 们对三株分离菌进行了毒素基因检测 ,现报道如下 : 20s ,72 ?延伸 20s , 35 个 循 环 , 最 后 72 ?延 伸 5min , 反 应 体 积 μ1 材料与方法 30l 。将扩增产物在 15g/ L 琼脂糖凝胶上电泳 。 1. 1 标本来源 采集部队腹泻患者粪便 、猪粪便和污水标本 2 结果 - 分别为 120 、120 、40 份 。 2. 1 菌落形态 分离菌为 G无芽胞杆菌 。在 S - MAC 琼脂 1. 2 分离鉴定 将采集的标本接种于 EC 肉汤 ,臵 37 ?6h 增 平板上经 37 ?24h 培养后 ,呈无色透明 、圆形 、扁平 、光滑湿润 ( ) 菌 ,免疫磁珠富集后划线接种于山梨醇 - 麦康凯 S - MAC琼 直径约 1,1. 5mm 的菌落 。 脂平板 ,臵 37 ? 18,24h ,每平板取 5 个以上菌落接种于二三 2. 2 生化特性 能分解葡萄糖 、乳糖产酸产气 ,棉子糖 、卫茅 糖铁培养基 ,37 ?孵育 24h ,用 O诊断血清和 H因子血清做 157 7 醇阳性 , IMViC + + - - ,呈典型大肠杆菌反应 。MUG 试验均 3 无靛蓝色荧光 。系统生化反应见 1 。玻片凝集试验 ,阳性者再做快 MUC 试验,检测其是否有靛蓝 2. 3 血清学 3 株分离菌 E coli O?H与 ETEC、EIEC、EPEC 色荧 ,如无荧光则疑为 E coli O?H。 157 7 157 7 志贺多价 、沙门 A - F 群多价 O 诊断血清均不发生凝集反应 ,1. 3 生化鉴定 将疑为 E coli O?H的分离菌经常规生化 157 7 试验初筛后 ,进一步用法国生物梅里埃 VITEK全自动微生物 与大肠杆菌 O诊断血清和 H因子血清发生强凝集 。生理盐 32 157 7 水对照阴性 。E coli O?H感染是一种食源性疾病 ,目前在世界上许多3. 1 1577 表 1 分离菌株 E coli O?H的生化特性 发达国家和一些发展中国家均发生过暴发流行 ,成为世界性公 157 7 共卫生问 ,我国虽未发生 E coli O?H暴发流行 ,但近年来 157 7 菌株菌株 试验项目试验项目 已有 10 余个省市从人畜及食品中分离到 E coli O?H。2002 人粪 猪粪人粪 猪粪157 7 三氯新- - 棉子糖+ + 年夏季我们在云南战区部队开展的 E coli O?H监测中 ,首次 157 7 + + - - 葡萄糖氧化 山梨醇 从腹泻患者和猪粪便中分离出 E coli O?H同源株 ,检出率分 157 7 + + + + 阳性生长控制 蔗糖 () () 别为 0. 75 %1/ 120和 1. 67 %2/ 120。经调查 ,该患者是进食了 - - - - 乙酰氨 肌醇 从市场购买的未经再加热的卤猪肉后出现腹泻 ,先是水样便 ,后 - - - - 七叶苷 侧金盏花醇 转为血便 。猪肉是我国人民饮食中重要的肉食品 ,虽然我国大 - - + + 植物尿蓝母 香豆酸 部分地区没有生吃猪肉的习惯 ,但在猪的屠宰中猪肉很容易被 HS - - - - 2 尿素 其粪便污染 ,被污染的猪肉在运输 、销售和加工制作中又难免污 β- - + + - 半乳糖苷酶 枸橼酸盐 染其它食品 。在我国 ,多数养猪场排出的污水是未经消毒处理 - - - - 鼠李糖 丙二酸盐 的 ,周围的水源和食品很容易受到 E coli O?H污染 ,极有可 157 7 - - + + 苯丙氨酸 阿拉伯糖 能引起局部地区的暴发流行 。本研究从生猪粪便中分离的 2 株 - - + + 多粘菌素 B 耐药 葡萄糖发酵 + + - - 乳糖 精氨酸 E coli O?H与人粪便中检出的是同源株 ,我们认为该患者是 157 7 + + + + 麦芽糖 赖氨酸 吃了被 E coli O?H污染的卤猪肉而导致的腹泻 。可见猪是 1577 + + + + 甘露醇 鸟氨酸 人类感染 E coli O?H不可忽视的传染源 ,故部队食堂在管理 1577 + + - - 木糖 氧化酶 中应加强防范 ,并在发生食物中毒时加以排查 。 2. 4 毒力试验实验小白鼠经腹腔感染后 10h 开始发病 ,表 3. 2 国内报道的有关 E coli O?H的分离 ,基本上是直接采 157 7 现为竖毛 、弓背 、食欲不振 、双眼半闭 、呼吸困难等症状 ,24h 内 ( ) 用山梨醇 - 麦康凯琼脂 S - MAC进行的 ,而我们采用的是免 全部死亡 ,对照组小鼠观察 5d 仍正常 。 疫学技术 , 即 用 免 疫 磁 珠 富 集 法 。此 法 较 先 进 , 能 提 高 检 出 2. 5 从腹泻患者和猪粪便中分离 E coli O?H对 15 种抗生 157 7 率 。在检测中 ,我们还应用了 MUG 试验进行快速筛检 。几乎 素均敏感 ,药敏试验结果见表 2 。 ββ所有大肠杆菌都具有- D - 葡萄糖醛酸苷酶和- D - 半乳 表 2 分离菌株 E coli O?H的药敏试验结果 157 7 β()糖甙酶 ,能水解四甲基伞形酮 - - D - 葡萄糖醛酸苷 MUG 人源株猪源株β( ) 和四甲基伞形酮 - - D - 半乳糖甙 G产生靛蓝色荧光 。而 抗生素 μμ()()敏感度敏感度MIC MIC g/ mlg/ mlβE coli O?H虽然存在 uidA 基因 ,能编码翻译- D - 葡萄糖 157 7 阿莫西林< 8 S < 8 S 醛酸苷酶 ,但不具有活性 ,不能水解 MUG 而不产生靛蓝色荧 2 S 2 S 氨苄西林 光 。我们利用 E coli O?H的这一特点 ,做快速 MUG 试验 , 157 7 < 4 < 4 S S 头孢噻肟 能显著提高 E coli O ?H 的阳性筛选率 。本研究中还使用了 157 7 < 2 S < 2 S 头孢西丁 先进的全自动微生物鉴定仪 ,对该菌进行了系统的生化鉴定 < 8 S < 8 S 头孢他啶 和抗生素敏感试验 ,结果准确可靠 ,特别是 15 种抗生素的敏感 < 2 S < 2 S 头孢噻吩 性试验结果 , 为 部 队 或 其 他 医 疗 卫 生 单 位 在 今 后 治 疗 E coli < 0. 5 S < 0. 5 S 庆大霉素 O?H的感染提供了重要依据 。 < 4 S < 4 S 157 7 亚胺培南 3. 3 PCR 技术应用于感染性疾病的分子生物学诊断是一种快 < 16 S < 16 S 奈啶酸 速有效的方法 ,但临床上广泛应用的大多是对某单一病源体或 < 4 S < 4 S 奈替米星 某单一毒力因子的一元 PCR ,确认一个病源微生物或毒力因子 < 32 S < 32 S 呋喃妥因 需逐一筛查 ,工作起来耗时耗材又费力 。发展一种新的可同时 < 1 S < 1 S 氧氟沙星 诊断多个病源微生物或多个毒力因子的多元 PCR ,是临床检验 < 16 S < 16 S 替卡西林 和科研工作者的迫切需要 。我们针对 E coliO?H的 SLTI、SLT 157 7 < 0. 5 S < 0. 5 S 妥布霉素 ?利侵袭相关基因设计了三对引物 ,经反复试验探索 ,建立了复 S S < 10 < 10 复方新诺明 注 : S 为敏感 PCR 方法 ,使一次扩增反应 ,可同时检测出分离菌 E coli O?合 157 2. 6 毒素基因检测 3 株分离菌均检出了 E coli O?H的三个 157 7 H的三种毒素基因 。为证实分离菌是否具有毒力 ,我们用小白 7 毒素基因 ,即 SLT I、SLT ?和侵袭相关基因 。扩增产物大小分 鼠做了毒力试验 。实验组每只小白鼠经腹腔注射 0. 5ml 该分离 别为 321bp 、571bp 、1089bp 。见图 1 。 菌液后 ,24h 内全部死亡 ,说明毒力较强 。而对照组观察 5d 仍正 常 。复合 PCR 方法的建立 ,不仅给临床检测 E coli O?H提供 157 7 了快速 、特异 、灵敏的方法 ,而且给感染性腹泻研究领域的病源 学监测和流行病学调查提供了新手段 。 参 考 文 献 1 Feng P. Escherichia coli serotype O?H. Emerging Infect Dis ,1995 ,2 : 157 7 47 . 2 于恩庶 ,等. 主编. 肠出血性大肠杆菌感染 M . 见 : 新发现的传染 病. 福州 :福建教育出版社 ,1997 . 聂青和主编. O?H大肠杆菌感染 ,感染性腹泻病 M . 第 1 版. 北 3 1577 京 :人民出版社 ,2000 . 图 1 PCR 扩增电泳结果 ( )收稿日期 :2003209210 1 为人源株 ;2 、3 为猪源株 :4 为阳性对照 ;5 为阴性对照 。 3 讨论