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温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究

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温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究 温热银质针疗法三种体外留针长度银质针 温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究 ChineseJournalofRehabilitationMedicine,Dec.2010,Vo1.25,No.12 . 基础研究. 温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对 大鼠骨骼肌作用的比较研究 王飞高谦2,3杨志丽z王刚 摘要 目的:研究温热银质针疗法时体外留针长度与温热银质针温度及大鼠骨骼肌形态学变化的关系,以明确最适的留针 长度. 方法:将54只...
温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究
温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究 温热银质针疗法三种体外留针长度银质针 温度及对大鼠骨骼肌作用的比较研究 ChineseJournalofRehabilitationMedicine,Dec.2010,Vo1.25,No.12 . 基础研究. 温热银质针疗法三种体外留针长度银质针温度及对 大鼠骨骼肌作用的比较研究 王飞高谦2,3杨志丽z王刚 摘要 目的:研究温热银质针疗法时体外留针长度与温热银质针温度及大鼠骨骼肌形态学变化的关系,以明确最适的留针 长度. 方法:将54只大鼠随机分为3组采用温热银质针治疗,银针刺入鼠左后腿皮肤深度均为3cm.各组体外留针长度分 别为9cm,7cm,5cm,艾条在针柄顶端点燃.使用数字测温仪测量针尖,皮肤进针点及二者中点的温度.光镜下观察针 尖处肌肉组织形态学变化及波形蛋白和结蛋白达情况. 结果:温热银质针治疗过程中,各组针尖,中点,皮肤进针点温度波动明显(体外留针9cm组针尖温度除外),第10rain 时最高.体外留针5cm组针尖(43.6~0.6~C)和皮肤进针点温度 (46.8+1,l?)最高,体外留针9cm组皮肤进针点温度 (36.6~0.CC)最低,体外留针9cm组针尖温度(35.2~0.7~C)与体外留针 7cm组(35.6~0.7~C)无显着差异.各组大鼠骨 骼肌细胞呈现损伤一修复过程,体外留针5cm组组织损伤范围大,程 度严重,以瘢痕修复为主,波形蛋白和结蛋白表 达少,另两组以肌细胞再生修复为主. 结论:根据温热银质针体内针身温度和大鼠骨骼肌损伤一修复情况, 体外留针9cm和7cm时更合适. 关键词银质针;温度;留针长度;肌肉再生;波形蛋白;结蛋白 中图分类号:R246文献类型:A文章编号:1001—1242(2010)一 12—1170—06 Comparisonofthermo-silverneedletemperaturesofthreekindsofneedlelengthsoutofbodyduringther- mo-silverneedletherapyandeffectsonratsmuscle/WANGFei,GAOQian.YANGZlIili,etalJ/Chinese JournalofRehabilitationMedlcine,2010,25(12):1170--1175 Abstract Objective:Todeterminetheoptimalneedlelengthoutofbodyduringthermo-silverneedletherapy,bycomparing therelationsbetweendifferentneedlelengthsoutofbodyandneedletemperatures,andinvestigatingthemorpholog— icchangesofratsmuscleatdifferentneedlelengthsoutofbody. Method:Fifty-fourratswererandomlydividedintothreegroupsaccordingtotheneedlelengthoutofbody.The silverneedleswerepuncturedintoskinandmuscleofratslefthindlegs,theneedlelengthsoutofbodywere 9cm,7cmand5cmrespectively,theneedlelengthsstayinginbodywereall3cmandconeswereignitedonthe handlesofneedles.Temperatureofneedletips,thepuncturespotsonskirtandmidpointsofneedlesweremeasured withsemi-conductorthermistordigitalthermometer.Morphologicchangesofmuscleandexpressionsofvimentinand desminwereobservedunderlightmicroscope. Result:Duringthermo-silverneedletherapytemperaturesofthreepointsofeachneedleinallgroupsfluctuated significantlyandascendedatthe10thminexcepttheneedletipsin9cmgroup.Amongthreegroups,averagetern- peratureoftheneedletip(43.6~0.6~C)andthepuncturespotonskin(46.8~1.I~C)in5cmgroupwerethehighest; however,averagetemperatureofthepuncturespotonskin(36.6~0.6~C)in9emgroupwasthelowest.Temperatureof DOh10.3969/j.issn.1001—1242.2010.12.Oll l空军总医院中西医结合正骨治疗科,北京,100142;2解放军总医院康 复医学科;3通讯作者 作者简介:王飞,男,主治医师,硕士;收稿日期:2009一O1—12 1170WWW.rehabi.C01Yt.Cn 中圊霭夏匡学棠鑫2010年,第25卷,第12期 theneedletipshowednosignificantdifferencebetween9cmgroup(35.2~0.7?)and7cmgroup(35.6~0.7?).Muscle cellsinallgroupspresentedinjuryandregeneration.Musclesin5cmgroupwereinjuredmostseverely,withobvi- OUSscarrepairing,andtheexpressionsofvimentinanddesminwerescarce.However,regenerationswereobviousin theothertwogroups. Conclusion:Duringthermo—silverneedletherapy,theneedlelengthsof9cmand7cmoutofbodywereoptimal basedOntheneedletemperatureandinjury-repairofratsmuscle. AuthorSaddressAirForceGeneralHospital,PLA,Beijing,100142 Keywordssilverneedle;temperature;needlelengthoutside;muscleregeneration;vimentin;desmin 肌筋膜疼痛综合征由位于骨骼肌纤维紧张带上 的触发点引起,其特征是定位准确,高度敏感,有压 痛,按压能够复制患者平时的症状,并产生牵涉痛. 它是引起腰背痛,颈肩痛及关节周围疼痛的常见疾 病ll-21.根据来自不同专科的资料统计结果,其发病 率在2l%一93%I31.很多治疗方法被用来灭活触发 点,针刺就是其中很常用的一种.针刺肌筋膜触发点 时出现局部颤搐反应,疼痛会明显减轻,肌紧张会缓 解,可能与针刺机械性地破坏了功能障碍终板的完 整性,激活抑制疼痛的内源性阿片肽系统,阻断触发 点伤害感受信息向脊髓背角的传递等有关.我国骨 科学前辈创用的温热银质针疗法将针刺和温热疗法 有机地结合在一起.在治疗顽固肌筋膜痛时既有即 时的镇痛作用,又有持久的解除肌肉痉挛效果[51. 温热作用与温度的关系密切,而温热银质针疗 法通过热传导对针体进行加热,因此针在组织内的 温度受体外留针长度影响很大.但是目前尚无不同 体外留针长度下体内针身温度及肌肉组织形态学改 变方面的研究.医生在临床操作中多是根据经验和 患者皮肤进针点处的耐受程度来把握体外留针长 度.体外留针太短容易烫伤皮肤,留针太长虽然治疗 安全.但可能对深部组织没有温热作用.达不到效 果.为此,本研究选取临床上常用的9cm,7cm,5cm 三个体外留针长度,使用半导体热敏电阻测温针直 接测量温热银质针在大鼠体内的温度.通过HE染 色动态观察针尖处肌肉组织的损伤一修复情况,并通 过免疫组织化学方法观察波形蛋白和结蛋白的表达 情况,为临床治疗时选用适宜的体外留针长度提供 实验依据. 1材料与方法 1.1实验动物:Wistar大鼠(由解放军总医院医学 动物中心提供)54只,雌性,体重300--350g.分为3 组,每组18只大鼠.三组大鼠左后腿均使用温热银 质针治疗.所用银质针的长度分别为12cm,10cm, 8cm,进针深度均为3cm,体外留针长度分别为9cm, 7cm,5cm. 1.2实验仪器 银质针:采用85%白银及掺杂少许铜镍合金熔 炼而成.直径1.Omm,针端尖而不锐.针体长度分别 为12cm,10cm,8cm,针柄长5cm.直径1.6ram,针柄 轧花.球形针尾 艾条:直径1.5cm,北京同仁堂(毫州)饮片有限 责任公司生产. 数字测温仪:四通道,量程l5—99?,精度 O.5?,反应时间0.85s,针式半导体热敏电阻传感器, 测温针长12cm,直径1mm,南京理工大学研制. 石蜡切片机:美国A0820型.自动染片仪:英国 SHANDON,型号GEMINI.显微镜及照相机:日本 Olympus20型.图像分析系统:Image—pro5.0彩色多 媒体病理图文分析系统. 1.3实验试剂 一 抗:抗结蛋白单克隆抗体(Maixin—Bio公司), 编号MAB一0055,抗波形蛋白单克隆抗体fMaixin— Bio公司),编号MAB一0178. 二抗:即用型非生物素免疫组化EliVisi0n plus检测试剂盒(Maixin—Bio公司1,编号KIT一9903. 显色剂:DAB(3,3一四盐酸二氨基联苯胺1显 色剂(Maixin—Bio公司). 缓冲液:冲洗玻片时采用PBS缓冲液,抗原修复 时采用Tris缓冲液,均由Maixin—Bio公司提供. 1.4方法 1.4.1实验动物准备:将大鼠用10%水合氯醛腹腔 注射麻醉(0.3ml/lOOg体重),仰卧位固定于鼠板上. WWW.rehabi.com.cn1171 ChineseJournalofRehabilitationMedicine,Dec.2010,Vo1.25,No.12 严格消毒针刺部位,用l8号针头作为穿刺针刺破左 后腿跟腱与腓肠肌连接处皮肤.将银质针与1号和 2号测温针(1号测温针针尖与银质针针尖平齐,2 号测温针针尖位于银质针针身距针尖1.5cm处)针 身平行紧贴刺入左小腿三头肌内3cm,体外留针长 度分别为9cm,7cm和5cm.用隔热套筒保护测温针 紧邻银质针针尾的部分,并将银质针,测温针针尾搭 于搭线架上. 1.4.2加热,测温:将1.5cm长艾条套人银质针球形 针尾,点燃.打开数字测温仪电源,1号和2号测温 针显示温度为银质针针尖和中点(皮肤进针点与针 尖的中点)温度.再用3号测温针测量皮肤进针点的 温度.加热前以及加热5rain,10min,15min, 20min时l,2,3号针的温度.加热结束后将银质针, 测温针拔出,再次消毒穿刺部位. 1.4.3动物取材:大鼠术后于解放军总医院动物实 验中心动物房饲养,食水喂养.分别于针刺后 2d,2周,4周将各对应观察组6只大鼠处死.解剖分 离左侧小腿三头肌.肉眼观察骨骼肌情况.垂直于针 道取针尖处肌肉组织,1O%甲醛固定. 1.4.4HE标本制作:10%甲醛固定,苏木精伊红染 色.中性树胶封片. 1.4.5免疫组织化学标本制作:SP法染色,DAB显 色,中性树胶封片. 1.4.6免疫组化标本的图像分析:各组中每个观察 时间组每块肌肉两种染色各取三张切片做图像分 析,从每张切片中组织的上中下随机选取6个视野 进行分析,参数值由图像分析软件自动给出并存储. 然后进行后期数据统计处理. 测量参数为:?每个视野中两种蛋白在肌纤维 中各自阳性区域平均光密度.?每个视野中两种蛋 白在肌纤维中各自阳性区域面积值. 计算参数为:两种蛋白在肌纤维中各自阳性区 域占各自总测试面积的百分比.面积百分比:每组每 种蛋白阳性区域面积/(测试的视野数X每个视野的 面积值)x100%.每个视野的面积值为11lO0001xm~-. 1.5统计学分析 选用SPSSl3.0统计软件进行数据分析,数据用 均数?标准差表示,组间温度比较及组内不同时间, 部位温度比较均采用单因素方差分析.以19<0.05为 1172H,”M.rehabico~cn 有显着性差异. 2结果 2.1温热银质针治疗三种体外留针长度下针尖,中 点,皮肤进针点温度测量结果 治疗后三种体外留针长度下针尖,中点,皮肤进 针点温度随时间变化情况:温热银质针治疗体外留 针7cm和5cm时,治疗过程中针尖,中点,皮肤进针 点的温度先升高后降低.10min时各点温度最高(P< 0.01).体外留针9cm时,针尖温度没有明显波动(尸> O.O5).中点和皮肤进针点的温度先升高后降低, 10min时最高(P<0.O1)(图l一3). 治疗lOmin时三种体外留针长度下针尖,中点, 皮肤进针点的温度:温热银质针治疗10min时,三组 针尖温度比较:体外留针5cm组最高(P<0.O1),体外 留针9cm和7cm组差异无显着性(P>O.05);中点温 度比较:体外留针5cm组>7cm组>9cm组(P<0.01); 图1三种体外留针长度下针尖温度随时间变化情况 44.O 42.O 40.0 毯 赠38.0 36.0 34.0 O51Ol52O 时间(min) …” 体外留针9cm 一? 体外留~f7em—一 体外留针5cm 图2三种体外留针长度下中点温度随时间变化情况 46.0 44.0 42.O 40.0 赌 38.0 36.O 34.0 O510l52O 时间(min) …-一 体外留针9cm 一? 体外留针7cm -一 体外留$i’5cm 中c田腐复匡学第毒2010年,第25卷.第12期 图3三种体外留针长度下进针点温度随时间变化情况 50.0 45.0 — 40.0 35.o 30.O 25.0 …一 体外留针9era 一? 体外留针7cm -一 体外留针5era O5lOl52O 时I’H-I(min) 皮肤进针点温度比较:体外留针5cm组>7cm组> 9cm组(P<0.01).每组3个部位温度比较:进针点> 中点>针尖(尸l<0.001),见表1. 体外留针9cm组I835.2+0.736.0~0.5.36.6~0.6L 体外留针7cm组1835.6~0.737.1:tO.9j口37.8?1.0F 箜塑!丝塑:圭Q:竺竺:!圭::塾:! 注:大鼠麻醉后体温34.8~0.4?,?与其它组相应部位温度比较,P< 0.01,?与组内其它部位温度比较,P<0.001 2.2温热银质针治疗对大鼠骨骼肌作用的形态学 观察 治疗后各组大鼠后腿骨骼肌肉眼观察结果见表 2.治疗后大鼠骨骼肌HE染色观察结果:?各组大 鼠治疗后2d,体外留针9cm和7era组损伤区肌细 胞胞浆崩解,变性,轮廓可见,越接近针尖处,肌细胞 变性,坏死程度越重.坏死纤维内可见单核细胞,周 围有炎性细胞浸润,毛细血管增生.体外留针5era 组损伤区肌细胞胞浆崩解程度重,轮廓不清,大量炎 性细胞浸润,毛细血管增生明显.?治疗后2周,体 外留针9cm和7cm组针尖周围见大量新生的骨骼 肌细胞.体积较小,为圆形或椭圆形,胞浆嗜碱性,细 胞核大.位于细胞中央区域,同时可见散在一些残存 的变性,坏死的肌细胞,炎性细胞浸润,毛细血管丰 富.血管周边可见成纤维细胞.体外留针5cm组损 伤中央区肌细胞凝固性坏死,损伤区外周可见一些 新生的骨骼肌细胞,大量炎性细胞浸润,毛细血管增 生明显.血管周围纤维组织增生.?治疗后4周,体 外留针9cm和7cm组针尖周围新生的骨骼肌细胞 进一步成熟,体积仍较小,胞浆嗜碱性不明显,细胞 核大,位于细胞中央区域,周围可见炎性细胞.体外 留针5cm组损伤区内大量纤维组织增生,毛细血管 增生,炎性细胞浸润明显,周边可见一些体积较小的 新生骨骼肌细胞. 治疗后大鼠骨骼肌波形蛋白和结蛋白免疫组织 化学图像分析结果见表3.各组治疗2d,2周,4周组 内比较时波形蛋白平均光密度差异无显着性(P> 0.05),阳性区面积差异无显着性(P>0.05).损伤2d 时各组波形蛋白平均光密度差异无显着性(P> 0.O5),体外留针9cm组和7cm组波形蛋白阳性区面 积差异无显着性(P>0.05),但都大于体外留针5cm 组(P<O.05).各组2d,2周,4周结蛋白平均光密度 差异无显着性(P>0.05),阳性区面积差异无显着性 (P>0.05).损伤2d时各组结蛋白平均光密度差异 无显着性(P>0.05),体外留针9cm组和7cm组结蛋 白阳性区面积差异无显着性(P>0.05),但都大于体 外留针5cm组(P<O.05). 3讨论 侯京山等161通过测量温热银质针皮肤进针点的 温度推测体内针身温度.程珂等f7l通过红外热像技 术以及有限元手段分析温针灸的温度场.但是都没 有明确报道温热银质针的体内针身温度.本研究通 过半导体热敏电阻测温针直接测量温热银质针在大 表2治疗后各组大鼠后腿骨骼肌肉眼观察结果 叫.rehabi.com.Cn1173 ChineseJournalofRehabilitationMedwine,Dec.2010,Vo1.25,No.12 鼠体内的温度.根据艾条燃烧过程中温度渐升渐降, 在10min左右温度达到最高,可达到300~C以上[81 的特点,本研究选择了艾条点燃后5min,10min, 15min,20min四个温度测量时间点.Barnes和Welch 等人通过大量的理论和实验研究后证明,激光对组 织的热损伤与作用时间呈线性关系,而与组织所达 到的温度的峰值指数相关,可见,温度对组织热损伤 更为敏感『91.因此本研究中比较三种体外留针长度下 针身不同部位温度时将加热10rain时的温度(最高 温度)作为比较对象,这一点与此前的研究中比较加 热后四个时间点的平均温度不同[1删.另外,为了让大 鼠麻醉后体温尽量接近人的体温,实验中使用棉布 覆盖大鼠躯干以减少热量散失,这样可以将大鼠体 温保持在34.8?左右. 程珂等[71通过红外热像技术观察到温针灸时针 道周围组织温度波动明显,从进针点到针尖处组织 温度分布呈”v”字形.本研究结果与程珂的观察相 似.针身温度随时间和部位的这种变化规律与温热 银质针通过针尾燃烧艾条.利用热传导对针体进行 加热的原理有关.体外留针9cm组由于热量在向针 尖传导过程中散失太多,针尖温度没有呈现出波动. 陈华[11]通过动物实验发现银质针治疗后能造成 大鼠肌细胞损伤并刺激肌细胞再生.本实验发现体 外留针9cm和7cm组肌肉组织损伤范围较小.程度 较轻,以肌细胞再生修复为主,体外留针5cm组损 伤范围较大,程度较重,以纤维性修复为主.这与陈 华的研究结果相似,这一结果也提示温热银质针可 能使肌筋膜痛触发点所在肌纤维损伤后再生. 1174WWW.rehabi.con.cn 波形蛋白和结蛋白是肌肉组织中重要的中等径 骨架纤维蛋白,Nonaka等[12J认为波形蛋白和结蛋白 的表达规律是研究肌肉损伤一再生过程的有力手段. 但目前尚未见到将这两种蛋白用于研究温热银质针 治疗后肌肉损伤一修复过程的报道.本实验采用免疫 组织化学方法和图像分析方法,将这两种蛋白的表 达量化,并结合肌肉组织病理学变化,对温热银质针 治疗后肌肉的损伤一修复过程进行分析.Vater等【l3] 通过小鼠比目鱼肌注射蛇毒发现肌肉损伤一修复过 程中波形蛋白和结蛋白均有表达,并且同损伤一再生 的病理过程紧密相关.本实验发现体外留针9cm和 7cm组肌细胞再生明显,两种蛋白表达多,这与 Vater的结果相似. Bornemann等?认为波形蛋白和结蛋白的表达 具有时间规律性:损伤后12h波形蛋白表达增加,2d 后达到峰值.然后下降,2周后基本消失;损伤开始 后结蛋白表达下降,2d后结蛋白表达增加,4d后达 到峰值并持续存在.本实验发现各组大鼠治疗后 2d,2周,4周时波形蛋白和结蛋白的表达差别不明 显.分析原因可能与温热银质针引起组织损伤的特 点有关.这种损伤是以针尖为中心向四周扩散,中心 区损伤程度最重,离中心越远损伤程度越轻,肌细胞 损伤程度不同,修复速度也不同,损伤后2d,2周,4 周时分别有处于不同阶段的再生骨骼肌纤维,因此 波形蛋白和结蛋白的染色没有呈现出时间规律性. 从温度与增强血液循环的关系考虑.41—43? 时充血反应慢,43—45?时充血反应快,超过45? 充血反应不会进一步上升,还可能出现组织损害, 中国旆夏匡学磐志2OlO~,第25卷,第12期 加热3min后出现充血反应.理想反应出现在 30min左右I15】.本实验中体外留针5cm组虽然针尖 温度达到43.6~C.但是肌肉组织损伤程度重,范围 大,纤维组织增生明显,波形蛋白和结蛋白表达少, 而且进针点温度高达46.8o【=.大鼠皮肤进针点处被 毛脱落,因此体外留针5cm偏短.临床治疗时需用 冷盐水进行局部降温.体外留针9cm和7cm组虽 然针尖温度只有35.2?和35.6?,但是针尖处肌肉 组织损伤程度轻,范围小,肌细胞再生明显.波形蛋 白和结蛋白表达多.这提示温热银质针在体内的温 度不能单纯按照温热作用的理想温度来衡量.它毕 竟是针刺作用和温热作用的结合.因此从肌细胞的 损伤一修复情况考虑,体外留针9cm和7cm时较适 宜.既往体外实验发现,艾条点燃后不到20min就燃 尽.20min时针体温度已接近环境温度l171.因此临床 上治疗时间选择20min是比较适宜的. 本实验比较了不同体外留针长度下单根银质针 的体内针身温度及引起正常大鼠肌肉组织的损伤一 修复情况.而临床上温热银质针治疗肌筋膜痛时采 用多根针密集型针刺,因此为了更符合临床实际,还 需要进一步比较研究不同体外留针长度下多根针治 疗肌筋膜痛动物模型时的体内针身温度及肌肉组织 损伤一修复情况.以为临床治疗时选择合适的体外留 针长度提供实验依据. 参考文献 【1】RashiqS,GalerBS.Proximalmyofascialdysfunctionincomplex regionalpainsyndrome:aretrospectiveprevalencestudy[j~.Clin JPain.1999.15(2):151一l53. 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