【doc】连续监测法测定血清丙氨酸氨基肽酶

【doc】连续监测法测定血清丙氨酸氨基肽酶 连续监测法测定血清丙氨酸氨基肽酶 垫塑塾瞳茔筮2003年6月第1O卷第2期 连续监测法测定血清丙氨酸氨基肽酶 吴林岚涂向东陈敏朱忠勇 ? 79? 【摘要】目的:建立血清丙氮酸氮基肽酶(AAP)连续监测法,初步应用于临床.方法:以丙氮酰对硝基苯胺(Ala— pNA)为底物.研究AAP作用于此底物的动力学特征.选择最适反应条件,建立血清AAP测定速率法及参考值.同时观测肝胆 疾病患者血清AAP水平.结果:酶反应最适pH8.0.Tris—HCI缓冲液的最佳浓度150mmoi/L,Ala—pNA浓度以3mmol/L为 宜.米氏常数(Km)0.74mmol/L.在8分钟观测时间内吸光度变化与时间成比倒.线性范围可达1800u/L,平均批内,批问CV 分别为I.04%和2.02%.20mmol/L甘油三酯,2eJL血红蛋白,34mol/L胆红索对酶活力测定无干扰.正常成年人群参考范 围(x?2s)41,77u/L.肝胆疾病组血清AAP明显高于健康对照组.结论:血清AAP活力是鉴别诊断肝胆疾病的一项特异, 灵敏的指标;连续监测法适用于各种类型的自动化仪.便于临床推广. 【关键词l丙氮酸氮基肢酶连续监测法肝胆疾病 AKINETICASSAYMETI10DF0RALANINEAMIN0PEmDASEINSER UM WuLinlan.TuXiangdong.ChenMin.eta1. CenterforLaboratoryMedicine,FuzhouGeneralHospita1.Fuzhou,350025 【Abstract]Objective:Toestablishkineticassaymethodforalanineaminopeptidase(AAP)inHI’am.beappliedtoclinicaldiag— p nosisprimarily.Mcthod:ekineticpropertyofAAPWaSstudiedwithAla— NAassubstrate.Weoptimizedtheassayofsertffn AAP.andestablishedthekineticassaymethodandreferencelimits.InthemeanntimewedeterminedAAPactivityinse~nnofhepato- b~aryd~easesubjects.Results:OptimumpHofassayforserumAAPwaS8.0,concentrationofTris—Habufferw?150mmol/L. thefinalconcentrationofAla—pNAwas3mmol/L.Michel—Metenconstant (Km)Was0.74mmol/L.Absorbencyincreasedahlg withtimein8minutesatleast.Thelinear~-nitextendedto1800u/L.Thewithin—nlnCVandamong—runCVWaS1.O4%and2. 02%respectively.TheconcentrationofTGupto20mmol/Lhadnoninterferencetoreaction.SOdidHbupto2g/LandT—BILTup to340~mol/L.ReferencelimitsforAAPinadults(x?2s)WaS41, 77U/L.AAPvaluesin~I’Ur/1wassignificantlyhigherforhepato- bilarydiseasesubjectsthanforhealthysubjects.Conclusion:AAPinseYumis averyspecificandsensitiveindicatorofbepatobiliarydis— ease.ThekineticassaymethodsuitsvarioustypesofBioautomatedanalyzers. ’ 【Keywords】AAPKineticassayHepatobiliarydisease 丙氨酸氨基肽酶(alanineaminopeptidase,AAP, EC3.4.11.2)是一种广泛存在于人体各脏器的蛋白 质水解酶,在毛细胆管,肾近曲小管刷状缘,小肠粘 膜等组织中含量丰富[???4?.据国外文献报 道u.2】,血清中AAP水平是鉴别诊断胆道阻塞和慢 性肝病很有价值的指标,但国内仅见少数尿AAP测 定用于肾毒性损害诊断方面的报道,且多采用终点 法,手工操作[3?4?5I.为了适应生化自动分析的特 点,我们了一种高效便捷的血清AAP连续监测 法,并测定了一批健康者和肝胆病患者,初步探讨其 作者单位:福州总医院检验中心 蠢 临床应用价值. 1材料和方法 1.1仪器美国RA—XT全自动生化分析仪, 日本OLYMPUSAU2700全自动生化分析仪,PHS — w型酸度计. 2.2试剂丙氨酰对硝基苯胺盐(Ala— pNA),Sigma产品;三羟甲基氨基甲烷(Tris),分析 纯. 1.3标本I肾组织提取液:将新鲜健康猪肾用 生理盐水洗净,剪碎后研磨挤压使组织液渗出,离心 取上清液备用.(猪肾经生理盐水反复清洗,上清液 用时稀释,残余血红蛋白甚微,不影响测定.)?血 ? 80? 清:收集体检健康者及GGT,ALT异常患者的血 清. 1.4方法 1.4.1测定原理AAP作用于底物Ala— pNA,使其分解成丙氨酸和对硝基苯胺,在波长 405mm测定对硝基苯胺生成速率,求出AAP活力. 单位定义:每分钟催化底物产生l/~mol对 硝基苯胺为一个酶活力单位(U/I). 1.4.2实验基本参数温度:37?,标本量: 10l,试剂量:300~d,波长:405nm,延迟时间:60秒, 测定时间:70秒,反应系数:3131.计算公式: AAP(U/L)=AA/minX1 , 0-- 6 ×× =AA/minX10s× =3131×AA/min 注:,表示对硝基苯胺的摩尔消光系数,L为比 色杯光径(1cm),TV为反应物总体积,SV为标本体 积. 2结果 2.1最适pH的确立分别配制pH7.4,8.6 300mmol/L的Tris—HCI缓冲液,与4mmol/I的 Ala-pNA水溶液等量混合,测定标本?的AAP活 力,结果pH8.0时活力最大,在此pH下,对硝 基苯胺的摩尔消光系数为9.9×10sI,.mol-1cm一. 2.2Tris—Ha缓冲液浓度的选择配制 pH8.0100—500mmol/I系列浓度的Tris—Ha缓 冲液,与4mmol/L的Ala—pNA水溶液等量混合, 测定标本?AAP活力,发现底物液中Tris浓度 150mmol/I时,AAP活力最高,因而选用150mmol/ I的Tris—HCI缓冲液. 2,3底物浓度以pH8.0150mmol/I的 Tris—HCI缓冲液配制0.125,4mmol/I系列浓度 的Ala—pNA溶液作为底物,测定标本?.根据 LinewearBurk作图法得出血清AAP作用于Ala— pNA的米氏常数(Km)为0.74mmol/I.当底物浓 度达3mmol/L时,AAP活力最高,故将AAP测定 的底物浓度定为3mmol/L,为Km值的4.05倍. 2.4经时反应曲线将一份AAP活力为 95U/I的血清放在日本OLYMPUSAU2700全自 动生化分析仪上进行检测,定时读取吸光度值,结果 福州总医院2003年6月第l0卷第2期 在8分钟观测时间内其吸光度的变化与时间呈稳定 的比例关系,即酶反应处于线性阶段,由此可见此反 应完全适用于连续监测法. 2.5线性范围将肾组织提取液用生理盐水 作系列浓度的稀释,以pH8.0150mmol/ITrls — HCI缓冲液配制的3mmol/LAla—pNA溶液作为 底物,测定各稀释液AAP活力,观察酶反应的线性, 结果AAP活力在1800U/L以下线性良好. 2.6精密度及稳定性批内CV:取正常和高 值血清标本各一份,各测定11次,均值分别是58, 110U/i,S为0.69,0.98,CV分别是1.19%,0. 89%.批间CV:pH8.0300mmol/LTrls—HCl 缓冲液与6mmol/IAla—pNA水溶液等量混合作 为底物,与上述标本置于4?密封保存,用时取出, 每日测定一次,连续10日,结果均值分别是58, 110U/L,S为1.28,2.00,CV分别是2.21%,1. 82%. 2.7干扰试验我们对脂血,溶血及黄疸对酶 活力的影响进行了观测,发现20mmol/L的甘油三 酯,2g/I的血红蛋白,340~mol/L的胆红素对测定 没有影响. 2.8参考值和初步临床应用以上述步骤建 立的AAP连续监测法对我院体检健康者172例进 行血清AAP活力测定(对照组),男118例,女54 例,将其分为6,18岁,19,73岁两个年龄组(表 1),结果显示6,18岁年龄组AAP高于19,73岁 年龄组(P<0.01),两组的参考范围(?2s)分别为 (67?18),(59?18)U/I,男性略高于女性,但无统 计学意义.19,73岁男性和女性年龄与AAP间相 关系数分别为0.1856,0.2798,P>0.05,无相关性. 201例(20--71岁)确诊为肝癌,肝硬化,肝炎,胆道 疾病及其它疾病患者的血清AAP活力,经t检验统 计学处理,结果肝胆疾病组AAP活力明显高于对照 组,P<0.01(表2). 表1血清AAP活力与性别,年龄的关系 福州总医院2003年6月第lO卷第2期 表2对照组和疾病组血清AAP活力比较lx?S.u_/L) ? 81? 2.9与常见肝胆指标的比较7一GT,ALP,T — BIIT是常见的肝胆疾病诊断指标,同时测定血 清AAP,一GT,ALP,T—BILT,将结果进行比较 (表3),相关分析表明在肝胆疾病中血清AAP与 一 GT,ALP呈现正相关,相关系数r分别为0.7385 (P<0.01),0.6702(P<0.01),与血清T—BIIT不 存在显着的相关关系,相关系数0.1968(P>0.05). 表3患者血清AAP与一GT,ALP,T—BILT之间的关系 3讨论 目前,国外关于AAP活力连续监测法的反应条 件各报道不尽相同,文献…报道,用于AAP活力测 定的底物除了丙氨酰对硝基苯胺以外,还有丙氨酰 B一萘胺,丙氨酰肼等,但以丙氨酰对硝基苯胺对酶 作用的专一性最强,无需与缓冲液进行孵育;适用于 自动化分析,因而作为首选底物.就缓冲液而言, Tris—HCI缓冲液配制底物液较磷酸盐缓冲液更能 促进AAP活力.我们通过实验对测定条件进行了 优选.从实验中可以看出,随着底物浓度的增加, AAP活力随之上升,至2mmol/I时,反应曲线渐趋 平坦,在3mmol/L时达到峰值.当Tris—HCI缓冲 液的浓度低于150mmol/L时,AAP活力与缓冲液 浓度同步上升,但是当缓冲液浓度超过150mmol/I 时,过量的Tris—HCI缓冲液则会抑制AAP活 力uJ,从而引起酶活力的下降.另外,过低或者过 高的pH不利于酶活力的测定.以PH8.0 150mmol/ITris—HCI缓冲液配制3mmol/IAla— pNA溶液作为底物最为适宜.这一结果与文献【l】 的报道相符,而与文献【5J不太一致. 据文献u.2】报道,未成年人血清AAP活力明显 高于成年人,男性在18岁以后AAP活力随年龄增 长而下降,女性无明显变化.而本实验所做的参考 值调查显示成年男性的年龄与AAP并不是负相关 关系.我们的实验表明,血清AAP活力在肝癌,肝 硬化,肝炎及胆道疾病中多有不同程度的升高,其中 以胆石症,胆道感染等原因引起的阻塞性黄疽升高 最为显着,在肝癌和急性黄疸性肝炎中的阳性率极 高,这可能是由于肝小叶结构破坏,肝细胞变性,或 癌肿压迫门静脉使肝血流缓慢,毛细胆管阻塞所致. 当胆道阻塞时,酶从胆道排出障碍而向血中逆流,在 血液中大量释放出来.同时,AAP与7一GT,ALP ? 82? 存在显着的相关性,相比之下,AAP在肝胆疾病诊 断中的特异性优于7一GT. 本实验所建立的血清AAP连续监测法克服了 终点法的缺陷,线性范围可达18oou/L.但迄今为 止,我们尚未发现AAP大于600U/L的血液标本. Ala—pNA在pH8.0Tris—HCl缓冲液中易水解, 每日测定标本前,应先行检测试剂空白值,加以扣 除,由于底物浓度过量,同时酶测定方法为连续监测 法,因而检测结果稳定,重复性良好.高浓度的脂 血,溶血和胆红素不影响酶活力测定,无需作样本空 白,最低检测限为3U/L,操作简便快速,能满足大 福州总医院2003年6月第1O卷第2期 批量检测的要求,适合于临床推广应用. 参考文献 1MuelerPW.PhillipsDL,andStteinberyKK.Alsnineaminopepti. daseinserum:automatedoptimizedassay,andeffectsofage.sex, smoking,andalcol~lconsupfioninaselectedgopulation.ChnChem. 366. 1987,33/3:363— 2SanderinkGL,ArturY.SshleteF.eta1.Alanineaminoidasein sel-ul”n~biologicalvariationsandreferencelimits.CiinChem,1988, 34:1422—1426. 3关之次郎.7’:77’7/手y-[J】.日本临床,1995,53, 增刊:445—446. 4谭建明.俞天麟.朱忠勇.尿丙氨酸氨基耿酶测定方法及参考值 范围.中华医学检验杂志,1992.15(2):76. 5候巍,董理.冯秋香.尿丙氨酸氨基耿酶连续监测法.临床医学 检验杂志.2000.18(3):157—158. 染色体异常核型四例 涂向东张宝珍 例1男,1岁,因智力低下来院就诊.查体:患儿具有 典型的21三体面容特征:眼距离.眼裂小.耳位低.伸舌,流 涎,后发际低,右手贯通掌.先天性心脏病.父母体健,非近 亲结婚.否认有遗传病家族史.患儿外周血T淋巴细胞培 养,常规制片,G显带,其核型为46,XY(大Y),t(12;21) (12qter~12pl2::21ql1-*’21qter).父母亲拒绝做染色体检 查. 例2女,33岁.结婚5年孕3次,每次均为孕5O天左 右胚胎死亡.孕期无患病及不良因素触史.夫妇双方表型, 智力正常.常规外周血T淋巴细胞培养.G显带,其核型为 为46,XX,t(7;21)(7pter一12qll::22ql1-”22qter;22pter-” 22qll::7ql1—7qter).丈夫精液及染色体检查均正常. 例3男,35岁.结婚五年.妻子不明原因自然流产3 次,均在受孕4O天左右.患者表型智力正常,身体健康,无 吸烟,饮酒等不良嗜好,妻子孕期无患病及有害物质接触史. 常规外周血T淋巴细胞培养,G显带,其核型为45.XY,t (17;l4)(17pter~17q25::14ql1-~14qter,一14.妻子染色体 核型正常. 例4男,27岁,婚后四年,妻子怀孕2次,每次均为2 个月时自然流产.夫妇表型,智力正常,非近亲婚配,无有害 物质接触及遗传病家族史.常规外周血T淋巴细胞培养.G 显带,其核型为46,xY(大Y),t(5;7)(5pter-~5q34::7q31一 作者单位’福州总医院全军医学 验 ? 病例? 7qter;7pter~7q31::5q34”-~5qter).妻子染色体核型正常. 讨论 例1患者体征符合21三体综合征的典型症状.外周血 染色体检查属于21三体易位型.据文献报道易位的21位 染色体一般均易位到另一近端着丝粒染色体(第13,14,15, 21,22号染色体)上,两者合为一条.而本例21号染色体却 是与12号染色体的长臂之间发生了相互易位.这种易位方 式是比较少见的.因父母拒绝做染色体检查.无法查明这种 易位是否为亲近传递的. 染色体平衡易位是引起胎儿流产,死亡或畸型的重要原 因之一.例2,4患者均为平衡易位携带者.由于通常没有 染色体物质的丢失或增加,不引起明显的遗效应.故患者的 表型正常.但是平衡易位的携带者可形成具有不平衡的染 色体组配子,与正常配子受精后所产生的后代只有一种是正 常的,1种是平衡易位携带者,其余16种均形成单体或三体. 这些配子通常是致死的,可导致胎儿流产,死胎或畸型儿. 本文3例患者均有不明原因的反复流产史,而且流产均发生 在妊娠早期,可能与形成不正常的配子有关. 志谢本核型经中南大学湘雅医学院中国医学遗传学 国家重点实验室夏家辉,戴和平教授鉴定为世界首报核壅, 特此致谢.