昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立的研究(可编辑)

昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立的研究(可编辑) 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体 细胞系建立的研究 ? 密级 分类号 学位 辛旨导教师 申请学位级别 专业名称 研究方向 论文提交日期 论文答辩日期 学位授予日期 答辩委员会主席 人 评 阅 北京?中国林业科学研究院摘要 摘要 昆虫细胞系具有非常广泛而重要的科学和应用价值.本研究参考 动物细胞培养中植 块培养的方法,从昆虫幼虫脂肪体细胞的原代培养入手,系统研究了以昆虫脂肪体组织 为实验材料建立昆虫细胞系的方法,并初步探讨了昆虫纲胞在体外增殖的机制,试图为 更多昆虫脂肪体细胞系的建立提供有效的技术手段.研究中选用健康的光肩星天牛 幼虫脂肪体组织为实验材料进行原代培养,通过比较不同虫 龄、不同取材部位的大小和完整性、不同培养表面、不同培养液种类和、不同血液 中酚氧化酶原抑制物的种类和添加比例、原代培养物的贴壁处理等因素对原代培养结果 的影响,以及传代方式、条件、时机等对传代培养结果的影响,试图探索出一套特有的 昆虫脂肪体细胞建系方法.实验结果表明,由脂肪体组织建立昆虫细胞系,最佳的取材 为末龄或进入预蛹期幼虫体内完整的脂肪体组织,优先使用一次性塑料培养瓶,原代细 胞培养液的最佳配制比例为:%,胎牛血清%,苯基硫脲%, ..。决定昆虫脂肪体细胞是否成系的关键因素包括:原代培养的组织能否同培养 器皿表面紧密接触贴壁,紧密贴壁的组织块倾向于游离出分裂能 力较强的细胞群; 在新生细胞长满瓶底时,处理好第一次或前几次转瓶、传代的步骤非常重要。最佳的初 次传代方式是轻轻摇晃,将较易脱壁的细胞以较高的密度传入新的培养瓶中,同时注意 不要扰动原组织块,减小对细胞的剪切力.原代培养换液量也需要根据细胞的生长状况 而定,一般为换液量的%。 运用上述方法,本研究共建立了株昆虫幼虫脂肪体细胞系.., ,, ??。 ?, ,??,其中株来自甜菜夜蛾 ,株来 自棉铃虫 。株细胞系的细胞均以圆形为主;新建立的细胞系 ?和..的第代细胞群体倍增时间分别为.和.; 一和.染色体符合典型的鳞翅目染色体数目较多的特点,多 数细胞为多倍体.使用的方法,鉴定了新建立的细胞系分别来自其同源的昆 虫,而与实验室保存的其它昆虫细胞系扩增谱带不同。细胞长期冻存在.?的环 境下,并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,且多次复苏成功.新 建细胞系均对同源核型多角体病毒敏感,但敏感程度各不相同, 对其它非同源种类的核 型多角体病毒不敏感。对已建的细胞系.进行了单细胞克隆,当前正在 进行放大培养. 使用掺入法标记了光肩星天牛脂肪体细胞在体内和体外的短期增殖情况,昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 发现该细胞在虫体内增殖缓慢,内少有增殖;脂肪体组织在体外贴壁培养后,组织块 内部的细胞不增殖,而游离出组织块处于培养液环境中的细胞合成活跃,可以大 量增殖. 研究结果表明,选取昆虫末龄幼虫或预蛹完整的脂肪体组织,以物理的手段促使体 外培养的组织块紧密接触培养器皿表面,以及小心处理最初几次传代的过程,是利用昆 虫脂肪体组织为细胞来源、从原代培养进入到传代培养、最终成功建立细胞系的关键; 掺入法标记初步研究的结果显示,从脂肪体组织块中游离出的细胞,可能是大 量分裂增殖而形成细胞系的主要来源,为昆虫细胞体外增殖规律和细胞成系机制的研 究,提供新的方法和思路。本文的研究结果为建立新的昆虫细胞系提供技术上的支持和 借鉴,也可能使建立新的昆虫细胞系成为一种常规的实验室技术。另外,本研究中新建 立的株具有自主知识产权的鳞翅目昆虫细胞系,不仅丰富了有限的昆虫细胞系资源; 而且因其对各自同源的核型多角体病毒敏感,拓展了其研究和应用的价值,可以成为研 究昆虫病毒、构建杆状病毒表达载体系统以及大规模生产昆虫病毒杀虫剂的有效工具。 关键词;昆虫脂肪体,细胞增殖,建立方法,细胞系,核型多角体病毒 ?丝堂 .,.,.. / //. , . :., , ,. ,. ,. .%%%. ... . . : ?一?,, .? ?粼?,.?? :. .. 他 ..垦皇堕堡垫塑堡之望丝查鲨堕塞坠墨主堡垦皇堕堡塑丝墨盟 壁皇 .堍矗 .??. . ? . .咖脚鲫玎 . : , , , 正文图表目录 正文图表目录 表我国已经建立的昆虫细胞系.. 图使用昆虫不同组织为实验材料已建立细胞系比例? 表昆虫脂肪体来源细胞系及对病毒敏感性?. 表.已经建立的甜菜夜蛾细胞系株? 表已经建立的棉铃虫细胞系株?. 公 .. 公式. 公式.. 公式. 公式.. 表鳞翅目昆虫不同组织原代培养与培养状态的比较.. 表.不同龄期光肩星天牛幼虫脂肪体组织体外培养比较状况. 图光肩星天牛幼虫脂肪体组织游离出来的细胞??. 图.光肩星天牛幼虫脂肪体组织游离出来的细胞继续增殖?. 图光肩星天牛幼虫脂肪体组织周围有脂滴类物质周围无或者很 少有细胞游离出?. 图桑天牛幼虫脂肪体组织周围游离出来的细胞内空泡??.. 表.不同培养表面对组织贴壁和原代细胞增殖的影响. 图光肩星天牛初期传代细胞培养. 图光肩星天牛健康的初期传代细胞?。 图.光肩星天牛脂肪体组织内未发现阳性细胞。 图.离体培养光肩星天牛脂肪体组织游离出细胞,大部分阴性。. 图离体培养的光肩星天牛脂肪体组织边缘有阳性细胞? 图.传代培养中标记阳性的细胞,可见细胞核深染?. 图.传代培养中标记阴性的细胞. 表本研究建立的甜菜夜蛾幼虫脂肪体来源的细胞系基本情况图. 第代..细胞?。. 图. 细胞生长曲线?。. 图. ?染色体?.. 图. 鉴定.等细胞系. 表. .细胞在不同接种培养密度下生长增殖情况??. 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系 的建立 表条件培养液对..单细胞克隆的影响.. 图感染的.细胞??.. 表. ..的不同细胞接种密度对产量的影响??. 表 .最初几次传代情况?。 图 细胞?.. 图 .细胞生长曲线? 图 ?.细胞核型分析? 图 ?.染色体.. 图 鉴定?? 图感染的.细胞。 图?传代光肩星天牛细胞,悬浮于培养液中?.. 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的并表示谢意。 日期:如咿和月歹日 签名.独雾 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规 定,本研究生培养单位有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘,允许论文被查阅和借阅.本人授权本研究生培养单位可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、。 汇编学位论文. 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名:二岳夕杉良 学位论文作者签名:张寡 . 。年月‘日 ’卯年月 学位论文作者毕业联系方式 工作单位: : 电子邮件: 通讯地址、邮编:第一章前言 第一章前言 .引言 开展昆虫细胞系建立方法的探索和研究可以为建立具有自主知识产权的细胞系提供 技术和方法,推动昆虫病毒学、免疫学、遗传育种学、药理学及环境毒理学等多学科研 究的深入进行.尽管已经有成功的昆虫细胞系建立的技术,但很多学者仍然认为建立细 胞系是一项非常困难、繁琐、耗时、随机性大和成功率低的工作.本研究从选择昆虫脂 肪体这一特定组织为材料入手,探讨快速、高效、重复性好的昆虫细胞系建立的方法, 试图使昆虫细胞系的建立成为一种生物学研究中常规的实验技术,为昆虫病毒杀虫剂的 生产以及杆状病毒表达载体系统的构建和研究,提供有效的技术手段。 .动物细胞培养技术概况 动物细胞培养工作始于上世纪初,年将蛙胚髓管部的小片组织在体外 培养了数周之久,第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果,标志着体外培养 技术的开始【.年等学者发现鸡胚浸出液能够非常明显地促进多种细胞的体 外生长,使体外连续营养供应和传代培养成为可能。年开发出著名的 化学配方细胞培养液,使细胞培养不再依赖动物体液【.在期间, 和两种应用最为广泛的细胞株先后被建立嘲.上世纪六十年代开始,在细胞培养 液中添加了抗生素,更进一步降低了污染的几率,使得细胞培养技术日渐普及,并被广 泛应用。 按照所培养的生物成分的结构形式,动物细胞培养方法可以分为植块培养法 、分离散细胞培养 等几种培养方法。当初 在创立体外培养这门技术时,最先建立了植块培养法.植块培养就是将从动物 体内所取得的组织切割成一定大小的植块约,再将植块接种到培养瓶皿内,加 入少量细胞培养液以不使植块浮出为宜,然后将培养瓶皿送入培养箱中进行培养的 方法.对大多数动物组织而言,在植块培养?后,即可见细胞从植块向外迁移。通 过植块培养,让构成植块的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增殖,然后将植块去 除,从而得到细胞培养物。由于构成植块的细胞之间保留了体内状态下细胞之间的相互 作用,因而在体外培养时,植块内的细胞容易存活和生长.但有的组织细胞迁移性不强, 如神经组织植块、肌肉组织植块等,短时间的培养,很少甚至没有从植块中迁移出来.昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 相对于植块培养法,分离散细胞培养就是将所制备的细胞悬液用 于接种和培养, 其最大优点就是解除了植块内部细胞之间的“组织关系从而可以反映出单个细胞的 生物学特征.将组织块分离散成细胞悬液的方法有多种,最常用的是机械解离细胞 法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法.与植块内的细胞相比,分离散细胞在 体外培养时经历的生长环境改变更大,因而在体外更难以存活和生长.如何在接种后使 细胞尽快进入生长状态,是分离散细胞培养能否成功的关键因素. 体外培养按照其结构成分,可以分为器官培养、组织培养和细胞培养.动物细胞培 、传代培养及无限传代 养可依其性质来分,有原代培养 的细胞系三种。原代培养是指从直接取自生物体细胞、组织或器 官开始的培养。首次成功地传代培养之前的培养可以认为是原代培养。在实际应用中人 们常将代以内的培养物用作原代培养,因为代以内细胞的生物学性质无太多改变. 在体外培养条件下,不论是否稀释,将细胞从一个培养器皿转移或移植到另一个培养器 皿即称为传代培养。传代培养之后便成为一株细胞系.细胞系 就是指从原代 培养物经传代培养后得来的一群不均一的细胞,可以长期连续传代.另外,通过选择或 克隆化培养。从原代培养物或细胞系中获得的、具有特殊遗传和生化性质或特异性标记 . 的细胞群称作细胞株 培养的动物细胞可以用来分离和鉴定病毒,生产疫苗、检验试剂、单克隆抗体等昂 贵的药物和试剂等。年,以血凝块悬滴培养豆苗病毒,为体外培养技术 在病毒学上的应用奠定了基础.年剑桥大学英国学者和阿根廷学者 研究出杂交瘤技术,并被广泛应用于单克隆抗体的制备.利用已建成 的动物细胞系可以进行染色体分析,基因定位等分子生物学研究。例如,自建立了细胞 培养技术后,人们才能于年确证人染色体正确数日是条。以后又发现唐氏综合 症’ 是由于出现额外染色体所致.三体.另外,进行细胞因子活 性检测,细胞分化等细胞生物学和发育生物学研究。 利用培养的细胞来进行实验研究,具有很多优越性嘲,研究对象是获得细胞,因 而可以长时期地监控检测;研究条件可以人为地控制:可以保持研究样本的一致 性;研究的内容便于观察、检测和记录;研究内容广泛,研艽费用经济。同时, 细胞培养也存在一定的局限性,细胞系的体外培养环境与体内环境存在一定的差距, 有时不一定能够反映体内的真实情况;细胞系对培养条件的比较苛刻;在培 养过程中容易污染;培养液价格昂贵。 第一章前言 .昆虫细胞系建立技术研究进展 昆虫细胞系在生物学很多研究领域已经成为非常重要的研究工具.昆虫细胞系除了 可以作为基础细胞生物学研究的材料外,还可以有很多独特的用途。如在昆虫病理学中, 可用来研究昆虫病原物的侵染发病机理;作为生物反应器,可以规模化生产昆虫病毒或 微孢子虫进行害虫的生物防治,或表达外源蛋白;用来对昆虫生理活性物质、细菌毒素 等进行生物鉴定:作为杀虫剂的作用物,鉴定其杀虫效率和作用靶标等。最近有研究表 明,寄主昆虫细胞系作为人工饲料的添加物,可以提高天敌成虫的生育能力【,这样, 从另一个角度,拓展了昆虫细胞系的研究和应用范围。为了满足相关学科研究和发展等 多方面的需求,人们一直并且不断加强新的昆虫细胞系建立的研究工作. 国外已经有很多关于杆状病毒表达载体系统,昆虫细胞系建立及培养方法等方面的 介绍’,国内也有许多关于昆虫细胞培养与杆状病毒表达载体系统方面的综述【蚺, 但是关于昆虫细胞系建立方面的介绍却很少【,以下就昆虫细胞系的建立技术和方法 进行系统阐述. ..昆虫细胞培养的特点 就像哺乳动物细胞系作为研究模型可以在一定程度上替代哺乳动物一样,昆虫细胞 系的体外培养也可以替代昆虫的饲养。但是昆虫细胞的生物学特性与哺乳动物的有许多 不同。首先,昆虫细胞培养液与哺乳动物细胞培养液相比,氨基酸含量较高,值较 低,渗透压高。对于大部分昆虫细胞系,培养在值.至.范围内的培养液中生长 较好,而哺乳动物细胞适宜的值范围约为..;培养昆虫细胞系时,培养液的最 适渗透压约为./,高于哺乳动物细胞培养液的渗透压 /.其次,两者离子平衡方式不同,大部分昆虫细胞培养液使用磷酸 盐缓冲体系,而不是哺乳动物细胞培养常用的碳酸盐缓冲体系,这样,气体就是不 必要的了,简化了细胞培养的设备.因而,用于哺乳动物细胞的培养瓶大多是可以通气 的,置于培养箱中培养;而昆虫细胞培养瓶大多是密封的瓶口,置于普通培养箱中 即可.再次,哺乳动物细胞传代时大多使用胰蛋白酶消化,而昆虫细胞则不需要,轻轻 吹打即可.另外,因为昆虫被称为“冷血”的,所以昆虫细胞可以生长在低于哺乳动物细 胞的较宽温度范围内,一般为?瑚?,而哺乳动物细胞系大多需在?的条件下培 养. 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 ..昆虫细胞系的建立和昆虫细胞培养液的发展 ...昆虫细胞离体培养技术概况 二十世纪初,许多昆虫学家尝试过使用体外培养的昆虫细胞作为其科学研究的工具. ,他使用惜比古天蚕蛾 最早进行昆虫组织体外培养的是 的精子进行体外培养,用来观察精予的发育。年, 观察到了原代细胞的增殖和存活时间的延长,但仍然不能够成功传代【】.首次成功建立 连续培养的昆虫细胞系的科学家有两位,分别是高尚荫,中国,武汉,于 年建立了家蚕细胞系】和,澳大利亚,堪培拉,于 年建立了桉蚕蛾 卵巢细胞系【.从此,昆虫细胞系的建立工作在 世界范围内广泛展开,新的细胞系株不断出现。草地贪夜蛾 细胞株 【 ,以及粉纹夜蛾耐细胞株商品名 是目前各实验室普遍选用的昆虫细胞系。 已有很多学者对已经建立的细胞系进行过总结【.搏叼.到目前为止,全世界已经建 立了株以上的昆虫细胞系,分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目.蜚蠊目、膜翅目、 直翅目、同翅目和半翅日等多种昆虫,其中大部分来自鳞翅目和 双翅目,而来源于 其它目的昆虫细胞系仅约占%。在我国,已经从鳞翅目和双翅目昆 虫中建立了 株以上的细胞系表,个人统计。 ?? . 笙兰重量 表我国已经建立的昆虫细胞系靼 ? 不详 双翅目 成虫卵巢 .,成虫卵巢 。啊 双翅目 白纹伊蚊 初孵幼虫 潘李珍等, 双翅且 白纹伊蚊 初孵幼虫 潘李珍等,删卅 双翅目 白纹伊蚊 初孵幼虫 潘李珍等, 鳞翅目 茶尺蠖 蛹卵巢 刘栖于等,毋 ? 鳞翅目 茶尺蠖 蛹卵巢 刘栖于等, 鳞翅目 棉铃虫 蛹卵巢 杨淑艳等,刀 鳞翅目 棉铃虫 蛹卵巢 杨淑艳等, 鳞翅耳 粘虫 血细胞 沈立美等, 鳞翅目 小菜蛾 全蛹 陈曲侯等, 峨 鳞翅目 黄条行军虫 成虫卵巢 陈曲侯等, 球钳讲 鳞翅目 黄条行军虫 成虫卵巢 陈曲侯等, ?细胞株 鳞翅目 棉铃虫 血细胞 沈立美, 鳞翅目 油桐尺蠖 成虫卵巢 刘松华等, 鳞翅目 斜纹夜蛾 不详 谢伟东等.,。 鳞翅目 斜纹夜蛾 胚胎 谢伟东等, 鳞翅目 家蚕 幼虫卵巢 孙祥芸,双翅目 中华按蚊 初孵幼虫 潘李珍等, 鳞翅目 甜菜夜蛾 血细胞 余泽华等,泸‘ 蕾 鳞翅且 银纹夜蛾 胚胎 黎路林等,明 鳞翅目 小菜蛾 胚胎? 。, 鳞翅目 小菜粉蝶 胚胎 黎路林等:,/ 鳞翅目 斜纹夜蛾 蛹卵巢 石正入等, 鳞翅目 柞蚕 成虫卵巢 粱布锋等, 斜纹夜蛾 蛹卵巢?鳞翅目 ., 樗蚕? 鳞翅目 樗蚕 蛹精巢 刘淑珊等 渊 一鳞翅目 八字地老虎 血细胞 李长友等, 鳞翅目 粘虫 胚胎郑桂玲等, 鳞翅目 榕透翅毒蛾 蛹卵巢 。 鳞翅目 粘虫 胚胎 于洪春等:“ 鳞翅耳 棉铃虫 卵巢 沈中建? 鳞翅目 八字地老虎 胚胎 不详 鳞翅目 甘蓝夜蛾 胚胎 不辞 鳞翅目 粘虫 血细胞 不详 鳞翅目 八字地老虎 血细胞 不详 鳞翅目 八字地老虎 胚胎 不详 鳞翅目 桑毛虫 血细胞 来诔 鳞翅目 棉铃虫 血细胞 不详 鳞翅目 蓖麻蚕 血细胞 未蓓 鳞翅目 蓖麻蚕 血细胞 来诔鳞翅且 棉铃虫 宋釜 血细胞 鳞翅且 棉铃虫 血细胞 不详 甜菜夜蛾 笆墨坚:笆幅 璧望星 脂肪体二蠢?‘刀 ?墨坚垡坚曼堡型巴?羔壁韭一丛壅墼 墅堕堡嚣;;:釜竺 注:沈中建未发表资料 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 ...昆虫细胞培养液概况 培养液是细胞在体外赖以生长、增殖、分化的重要因素.与动物细胞培养液的研究 类似,昆虫细胞培养液亦经历了天然培养液、合成培养液、无血清培养液三个发展阶段。 天然培养液主要指来自昆虫体液或利用组织分离提取的一类培养液。早期的培养液?? 天然培养液,主要是简单的盐溶液或昆虫血淋巴,体外培养的细胞仅能存活几天,由于 没有可以维持细胞长期存活的培养液,昆虫细胞培养发展缓慢。天然培养液含有车富的 营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质,渗透压、等也与体内环境相似,但制 作过程复杂,批次间差异大,因此逐渐被合成培养液替代。 年,在分析家蚕血淋巴化学成分的基础上,模拟昆虫的血淋巴,设计出 最早的昆虫组织培养液??合成培养液碍】.合成培养液也称基础培养液,是目前应用最 为广泛的培养液,由已知化学成分的人工合成化合物组成,主要包括无机盐、维生素、 氨基酸、糖、有机酸和促进生长的元素.在基础培养液中添加的天然成分有昆虫血清、 牛血清、马血清或羊血清、乳蛋白水解物以及酵母水解物等。在改进培养 液的基础上,建立了第一个昆虫细胞系;初期的细胞培养在基础培养液中添加昆虫血 清,并由此建立了多个细胞系.但是由于大量的昆虫血清难于获得,后来细胞培 养液中大多添加%的牛血清。血清中含有诸如生长因子,维生素、氨基酸等生物活性 物质,能够促进细胞分裂。绝大多数细胞在含有血清的培养液中生长良好,但由于其具 体化学成分复杂、难以分析,使得生长过程不易检测控制。血清在使用前通常需要灭活 处理,即热处理。热灭活的目的是去除血清中的补体等对热敏感、 并且不利 细胞生长的物质,同时也对血清中可能存在的支原体等滤过性病原物具有灭活作用。但 热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分有可能带来负面影响.尽管如此,在大多数 实验室还是对血清进行常规的热灭活处理”。 无血清培养液即不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间繁殖的合成培养液. 虽然基础培养液加少量血清所配制的完全培养液可以满足大部分细胞培养实验的要求, 但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其他生 长因子的干扰作用,而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过 程中分泌某种物质抗体、生长因子的能力;或者要大规模地培养某种细胞,以期获 得它们的分泌产物。因此,研制出无血清培养液一直是生物科学工作者努力的目俐碉. 、 目前,有很多商品化的无血清昆虫细胞培养液得到了广泛的应用,如 /, ,: 、 、 ,,和,,等。虽然无血清培养可以 避免添加的牛血清等成分不明物质的不利影响,但是其并不适用于广泛的细胞类型。在 我们实验室,有的细胞能够适应不含血清的培养液,有的细胞在不含血清的培养液中生 第一章前言 存代后,逐渐死亡.尽管目前商品化的无血清培养液可以适合许多细胞正常生长, 然而价格仍然较高,同添加血清的培养液相比,没有很大的优势。因此,有学者开发了 多种廉价培养液,比如发明了一种基于稀释的海水而配制的培养液. 如今,在甚培养液的基础上改进的培养液广泛地应用于昆虫细胞培养.大部分 昆虫细胞培养液已经商品化,常用的有:”, ,., , ?, , ,; , .,,,:., 柚, .,.,.由于 “ 许多培养液可以适合于多种昆虫细胞的培养,一般的实验室尽管 培养多种细胞系,但大 多只使用其中的种培养液。 ..昆虫细胞系建立技术 ? 至今为止,虽然已经建立了来源于多种昆虫的株以上的细胞系叫,但相对 于已知的几十万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来说,这些细胞系还远远不够。在某 些研究方面,仍然需要特定昆虫种类来源或者特定细胞类型的细胞系,因此有必要 建立更多新的昆虫细胞系.事实上,每一株细胞系都是分子生物学等研究领域开展研究 的潜在资源。目前还没有统一和规范的建立昆虫细胞系的方法和技术手段.尽管已经有 成功建立昆虫细胞系的例子,但许多学者仍然认为建立细胞系是一项非常困难、繁琐、 耗时、随机性大并且成功率低的工作. ...昆虫细胞系建立的方法 建立细胞系的过程主要包括昆虫体表消毒、组织解剖、原代细胞的获得、细胞入瓶 和恒温培养等几个步骤.首先是将虫体体表消毒.消毒的方法有多种,可以使用次氯酸 钠或酒精进行表面消毒,并用灭菌水清洗后晾干;第二步,解剖虫体,获得需要的待培 养的组织,如脂肪体、卵巢等,用生理盐水清洗虫体组织以除去血细胞,然后浸入含 %%胎牛血清的细胞培养液中;第三步,原代细胞的获得,将准备接种的组织放入 培养瓶的方法各不相同.可以选择机械分离法,即用细筛网挤压细胞,使之分散。这种 方法分离效率高,但细胞死亡损失大。另外也可以选用胰蛋白酶消化组织的胞外基质, 解离细胞。胰蛋白酶法和机械分离法各有弊端,现在一般倾向于避免使用这类对细胞有 机械破损的方法,而是直接将组织块放入培养瓶中,转移到的环境下静置培养 鲫.入瓶后第一个星期后加入一定量的传代培养液,然后每星期更换半量的培养液,待 细胞长满瓶底后开始传代.与哺乳动物细胞原代培养过程类似,昆虫细胞原代培养过程 . 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 主要包括三个时期:即快速增殖期、非特异性的细胞恶化期和最后但不总是相同种 类的细胞继续增殖期。增殖的细胞有形成单层细胞贴壁的,也有悬浮细胞形成团块的。 悬浮的细胞常常最后成系,而贴在培养瓶壁上的细胞则逐渐死亡.细胞在由入瓶后到增 殖,最后可以传代的过程的变化很大.认为有三种可能:.细胞的表面、细胞 器、或酶系发生改变;.适应环境变化的细胞类型存活,不适应的细胞死亡,是一种 选择的过程;.随着培养条件的变化,细胞产生了基因突变,适应的突变细胞被选择 而生存【。等通过延时电影技术 指出,较 小的球形细胞更容易发生细胞分裂隅.在我们进行光肩星天牛细胞培养的过程中发现, 较小的透明梭形细胞增殖分裂活跃。 与哺乳动物植块培养相似,在我们的建系过程中也发现,组织贴壁对原代培养细胞 获得的作用非常明显.当培养的组织块贴壁后,?即可见到有成纤维细胞状的细胞从 组织块周边游离出来,两周至四周左右即可增殖长满瓶底,传代。使用这种分离原代细 胞的方法,使得培养体系背景清澈,细胞增殖容易观察.但是,使用不同的昆虫脂肪体 组织,组织块周边游离出细胞的可能性和多少存在差别,细胞持续增殖和存活的能力也 各不相同. ...昆虫细胞系的组织来源 已建立昆虫细胞系的母细胞分别来自昆虫的胚胎、初孵幼虫、成虫、蛹或幼虫的卵 巢、血细胞、脂肪体、器官芽嘟,,中肠、表皮、神经系统【、内分泌系统和肌肉 垮图,个人统计.不同的组织培养方法亦不尽相同。等描述了用鳞翅 目幼虫或成虫的组织建立细胞系的方法,但这些过程繁琐、耗时,费力,且随机性大、 成功率低、可重复性差。 胚胎细胞的优点是再生潜力高.使用昆虫胚胎和初孵幼虫建立的细胞系最多,占所 有建成细胞系的%以上图,个人统计.其建系方法首先是由和 在建立叶蝉细胞系的时候创立的【删.一般是将卵壳表面消毒后,让卵在无 菌条件下孵化。采用机械的方法将胚胎初孵幼虫组织分散成单细胞后,利用或不用 蛋白酶进一步消化分散,然后转入培养瓶进行培养.其原代培养的时间变化较大,大部 分需几个月至年.很多研究者认为,使用不同发育阶段的胚胎为实验材料,可以增加 细胞增殖的机会. 第一章前言 图使用昆虫不司组织为实验材料已建立细胞系比例? ‘ .? 自从利用卵巢组织建立第一个昆虫细胞系以来,卵巢成为一个常用的组织来 源。大多是解剖出卵巢,用机械方法研碎后或者直接放入培养瓶中培养。对卵巢来说, 建立培养时,使用不同发育时期的昆虫为材料,成虫、蛹、幼虫的卵巢均被成功地使用 过。在我们的实验过程中发现,幼虫的卵巢没有充分发育,不便操作,成虫,尤其是鳞 翅目成虫,鳞片等体表附属物妨碍操作,增加了污染的机会,而采用将要羽化的蛹,比 较容易解剖到卵巢组织,大大减少了受到污染的机会,是较好的实验材料。卵巢组织在 培养状态下,卵巢小管上皮细胞较易从组织上游离出来,但进一步分裂的情况并不多见。 目前已有株以上的细胞系来自卵巢组织‘?略?,也有幼虫、蛹、 成虫精巢细 胞系的报道【嚣..。 昆虫的血细胞是最易于获得的培养材料,具有单细胞和污染概率较小的特点,但培 养的成功率较低【 】。其中的原因之一就是血淋巴和血细胞中含有酚氧化酶原。在体外容 易被激活而使培养物黑化,从而毒害培养的细胞。有多种防止黑化的方法,如在培养物 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 中加入酚氧化酶的抑制剂半胱氨酸. /、谷胱甘肽. /、苯基硫脲 等,或者经过分离的手段,去除含有酚氧化酶原的血淋巴和绛色细胞。据不完全统计, 有约株以上的细胞系来源于昆虫的血细胞图,个人统计【配??. 昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有类似的功能,是一种重要的生理代谢组织,也 是很多病原物的靶标。不同种类昆虫的脂肪体细胞在体外能否很快分裂生长,差别很大, 具体的原因还不清楚【。我们的初步研究结果表明,原代培养的脂肪体组织在从体内转 移到体外时,能否贴壁非常关键,是能否快速成系的重要因素之 一.且前昆虫脂肪体细 胞系有来源于约种鳞翅目昆虫、种蟑螂、种鞘翅目天牛的余篇报道表, 个人统计强。 器官芽包含各种类型的细胞,是发育生物学研究的重要材料,经过分化,将要发育 成为特定的器官组织。表皮细胞、神经系统、内分泌系统、肌肉系统常常被用来进行原 代培养的实验,但真正建立细胞系的很少.然而建立特殊器官和组织来源的细胞系,对 细胞生物学研究和发育生物学研究具有重要意义,是未来昆虫细胞培养发展的方向之 ...昆虫细胞系的传代培养 根据国际组织培养协会对“传代”的定义,无论是否稀释,将细胞从一个培养瓶转 移或移植到另一个培养瓶,即称为传代或传代培养,也称再培养。一般来说,随着细胞 培养的进行,培养时间的延长,细胞通过分裂增殖,可能长满整个培养空间;另一方面, 因细胞间的相互接触而发生接触性抑制,生长速度会逐渐减慢甚至停滞.在这种情况下, 需要将细胞重新接种到另外的培养器皿内,再进行培养。这个过 程就称为传代培养”。 传代的初期,细胞生长较慢,传至五代至十代以后,生长速度明显加快。待传代培 养细胞生长稳定后,每?以;到:的比率传代一次。随着传代的进行,细 胞趋于纯化,形态趋于同一.有人认为,这是由于高密度传代后,细胞失去多向分化潜 能的缘故。多次传代意味着不断选择生长最快的一群细胞,这样。最终获得了较为单一 类型的细胞.其它类型的细胞在多次传代中将逐渐消失.培养过程中,健康细胞也会自 动将无用的细胞淘汰、排除,甚至将其吞噬消化掉。传代的昆虫细胞系可以静置在培养 瓶或培养皿中培养,也可在培养瓶或各种生物反应器中摇动悬浮培养. 传代培养失败的原因有很多可能。在传代过程中,常常需要对细胞进行反复吹打, 或者用胰蛋白酶消化的方法,使细胞悬浮并均匀分散。这样的处理,有可能破坏由细胞 因子引发的与细胞周期相关的信号传导途径,并且不能及时修复,从而导致细胞脱离细 胞周期,不能进行增殖,细胞进入休眠或者趋向死亡.改进传代方 式和传代培养条件是 细胞传代研究需要进一步考虑的问。另外,根据我们的经验,传代时机和密度也很重 】第一章前言 要,应当等到细胞增殖布满瓶底后,再过一段时间,在有大量细胞悬浮时,以较高密度 传代较好。促使细胞在传代后迅速生长,可能是实现细胞传代培养的另一个关键. 在脊椎动物的细胞培养中,年采用鸡胚浸出液促进细胞的生长,在完全 没有抗菌素的条件下,竞使鸡胚心脏细胞维持生存了年,先后传代次,令人信 服地证明了动物细胞有可能在体外无限地生长。一般来说,传代次数较少的细胞,其染 色体变化和基因变异较少,基本保持体内细胞的特点和功能;而较高代数的细胞,虽然 失去了体内环境的各种调控,发生了染色体数目变异和基因突变,但仍能保持相当部分 的体内细胞的重要功能和特性。依据培养人成纤维细胞的经验认为,传代细胞 应该至少传代次以上,才被认为是连续传代的细胞系【。我们认为,细胞通常在传 代次之后,生长就已经基本稳定。 细胞系建立以后,细胞系的命名工作也非常重要.和指出, 细胞系的名称代码,应该包括实验室名称,细胞系虫种来源,细胞株编号及克隆株编号 . .如我们建立的甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞系名称为...,表示该细胞系在 中国科学院动物研究所,中国科学院动物研究所英文缩写的实验室中,培 养建立的甜菜夜蛾弛,甜菜夜蛾学名缩写的第二个细胞系,罗马数字第. ’? ...昆虫细胞系的单细胞克隆 ’ ’. 大多数细胞系,即使是来源于同一组织,通常由不同类型的细胞组成,周此在病毒 学研究工作中,需要对细胞进行克隆化培养,得到克隆细胞株?细胞克隆王作最初是’ 和.等人在埃及伊蚊爿.和桉蚕丘细胞株上进行的【 ..“ 等人的实验证明,从一个细胞系中分离的多个克隆在对病毒感受 性方面有不同 的反应,而且病毒在各个克隆细胞内的发育速度也有明显差别. 大部分的单细胞克隆实验都是采用孔板,适度稀释培养液至每孔也个细胞,几 个小时后观察并标记只有个细胞的孔,待一星期或更长时间后,选择细胞增殖的孔, 放大培养,获得单细胞克隆的细胞株。对大多数细胞来说,细胞培养过程产生的各种细 胞因子对细胞的生存、生长、增殖和分化等过程具有重要的协调作用,参与构成细胞生 存的微环境,对细胞的分化、运动、信息沟通等也有重要影响。因此,稀释细胞时加入 条件培养液 可以增加细胞存活和增殖的几率.条件培养液是通过 将该细胞系对数生长期的培养物经离心去除细胞并过滤除菌后获得的. 另外,有一种孔细胞克隆板,该细胞克隆板 每 个孔内包含个的小格,孔共含这样的小格个.使用与孔板相似的方 法稀释细胞并选择单个细胞的小孔,一个或几个星期后观察选择增殖的孔内细胞,并放 大培养.此种克隆板单位面积内细胞数量更多,使大孔内可以有更多的细胞,大孔内小 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 孔上方培养液互通,细胞间可以建立通讯,更利于单细胞的增殖。 ..昆虫细胞系的特征和鉴定 随着昆虫细胞系数量的增多,对新建细胞系进行鉴定并描述其形态的、生理的和分 子的特征显得越来越重要。传统的细胞系鉴定内容包括细胞形状大小显微镜和电镜观 察、生长特性和倍增时间、染色体核型、同功酶谱、外源因子检测支原体等、细胞 的冻存和复苏等,但至今仍未形成统一的。随着分子生物学手段和技术的发展, 扩增指纹图谱,锄 被广泛应用于对新建立的 昆虫和哺乳动物细胞系进行分子鉴定【.。最近,有研究者使用扩增片段长度多态性 ,和、的 技术,更精确地鉴定种间和种内的不同细胞系.其它的鉴定技术还有线粒体的 限制性核酸内切酶分析【,、异源双链核酸分子分析、、 随机扩增多态性 ,懈、酶联免疫吸附分析法 ,、放射免疫测定、蛋白双向电泳、 血清学分析、免疫扩散测定等。 ...细胞形状、大小、生长曲线和倍增时间 可以在倒置相差显微镜下观察活体细胞的形状,并测量其大小。昆虫细胞大部分细 胞呈圆形,也有部分呈梭形或者蝌蚪形,偶尔也会有较大的巨型细胞。有时还需要在电 镜下观察细胞。细胞依其生长性质以及培养时是否需要附着面,又可分为悬浮型及贴壁 依赖型两类细胞. 培养瓶,接种密度为 生长曲线的测量一般使用孔板、.锄或 ~个细雕/,每瓶培养液于?静止培养。用台酚蓝染色后,在显微镜 下用血球计数板计数活细胞数,绘制细胞生长曲线,使用的公式计算群体倍增 时间/。倍增时间的不同可能有多种原因,包括细胞系的组织来源、培养温度、培养 液的种类和血清含量等。 ...染色体 染色体数目、核型是一种可用于鉴定细胞系种属、性别来源的较为确切的指标.染 色体核型分析包括制备细胞中期分裂相样本,将分散的单个染色体进行计数和分组排 列、分析等。蚊虫类染色体数目较少,计数起来相对容易.许多昆虫,尤其是鳞翅目昆 虫染色体较小且数目较多,多倍体细胞系染色体数目更多,难于区分和计数,因此早第一章前言 期使用计数染色体数目的方法来区分双翅目和鳞翅目细胞.等通过观察细 胞形状和比较染色体数日,排除了细胞系被一种家蝇细胞系污染的可能性. ...同功酶 同功酶分析是一类简单、直接的鉴定细胞系的方法【。,并且有商品化的试剂盒 公司的 可用,非常方便??.同功 酶分析为鉴定新的细胞系或是否被其它细胞污染,提供了标准.但同功酶谱分析不能作 为细胞系鉴定的唯一标准,必须与细胞形态、生长特征、核型等相联系。和 首先证明了同功酶技术在区分无脊椎动物细胞系中的局限性】.使用同功酶谱分析, 美洲粘虫 、 细胞系不仅与常用的鳞翅且昆虫细胞系,如 刑, .. 等相比,表现不同的酯酶谱带形式,而且也与 该虫卵的酶谱不刚?。很多报道也指出相同的现象,其原因正在进一步探讨中. ... 扩增指纹 细胞系鉴定的一个重要方面就是明确并证实其寄主组织来源。在哺乳动物细胞系鉴 定中使用的基于技术的指纹分析得到广泛的应用,如和 。等首先利用技术来鉴定昆虫细胞系,比较了 来自鳞翅目、双翅日、鞘翅目和同翅且四个目的个细胞系,证明是一项有 价值的、可靠的实验技术【。此后,许多科学家应用这项新的实验手段来鉴定新建立 的昆虫细胞系搏.实验表明,鉴定技术快速、简便、可信度高、重 复性好,不仅能够区分不同虫种来源的细胞系,而且能够提供细胞系原始来源的证据。 使用该技术可以在种内和种间水平上区分细胞系的来源. 常用的鉴定技术采用一种哺乳动物醛缩酶基因片段的引物,分别为’引 物:,’引物:厂,并使 用常规的扩增方法,昆虫细胞系的鉴定也采用这对引物.电泳后观察带型的不 同来鉴定细胞系的来源. ...细胞冷冻保存 所谓冷冻保存,就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的 溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度一般是低于.?的超低温条件,并在 此温度下对其长期保存的过程。最常用的冷冻保护剂是甘油和二甲基亚砜, 然而的应用比甘油更为普遍,需要注意的是,在常温下对细胞的毒性作昆虫脂肪体细胞体外增殪方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 用较大,而在?时,其毒性作用大大减弱,且仍能以较快的速度渗透到细胞内.因此, 在使用作为冷冻保护剂时,需要一定时间的预冷过程,一般是?下, 使等成分渗入到细胞内,在细胞内外达到平衡以起到充分的冷冻保护作用。另 外,在使用前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用.较常用的长 期冻存温度是,最佳的冻存条件是放入液氮中. 具体的冷冻保存过程是;选择生长旺盛对数生长期、状态良好的细胞,以~ 个细胞/的密度,按每管.的量分装于冻存管内,冷冻保护剂浓度为% 的或者甘油。通用的方法是先将含有细胞的冻存管放入普通冰箱冷藏室和? 中约;接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室.约;然后转入 低温冰箱?左右;再将其转移到超低温冰箱.??过夜;最后将 冻存管投入液氮中保存.或者用等速降温机,以??/的速度由室温降至?, 液氮中长期储存.我们的方法是,将细胞存放于保温盒中密封,直接置于冰箱中, 保温盒内的温度将缓慢下降,这样是一个缓慢降温的过程,当保温盒内外温度平衡时, 细胞也就进入.?的冻存状态了. 复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过 程。复温时造成的细胞损伤非常快,往往在极短的时问内发生.一般来说,在复苏时复 温速度越快越好。常规的做法是,在?水浴中,使冻存管内的细胞在一内恢复 到常温。这样,细胞内外无冰晶损伤和溶质损伤产生,冻存的细胞 经复苏后仍保持其正 常的结构和功能.由于许多冷冻保护剂如在低温下能够保护细胞,但在常温 下对细胞有害,故在细胞复温后应及时离心去除或用培养液稀释冷冻保护剂。 ..污染的避免 在细胞培养中最常见的污染是微生物污染细菌、酵母菌、霉菌、病毒、支原体和 霉僵菌等以及其它细胞的污染。主要的污染原因是无菌操作技术不当、操作室环境不 佳、加入了被污染的血清、混入了其它细胞等.严格的无菌操作、清洁的环境、品质良 好的细胞来源、配制正确的培养液是减低污染的好方法.如果污染的细胞未被发现,那 么超净工作台上的气流将有可能把污染物吹向新的传代细胞和培养液瓶中.因此,最好 的办法是一旦发现被污染的细胞,就应当将其弃去,防止污染其它的细胞。由于细菌或 真菌在培养液中相对于细胞生长迅速,可以通过显微镜甚至肉眼检查出来;支原体的污 染只有通过特殊的方法进行检测珏. 细胞系的交叉污染,尤其是形状相似的细胞系之间的混杂不容易 鉴定。这种污染自 年开始报道,到二十世纪七十年代,超过了三分之一的用于癌症研究和细胞生物学 研究的细胞,都被细胞污染。昆虫细胞的培养条件温度、培养液等不适于哺 . 第一章前言 乳动物细胞的生长,因而昆虫细胞不易被哺乳动物细胞污染,需要避免的是被其它昆虫 细胞污染.培养健康的细胞依赖于严格的防止污染的操作技术.常见的错误是,当多种 细胞使用同一种培养液时,将同一试剂瓶中的培养液用于不同细胞的培养,这样,极易 由于操作不当,将其中一种或多种细胞带入试剂瓶中,造成细胞之间的交叉污染.不同 细胞使用的培养液分别盛放在专用的试剂瓶中,换液操作时及时更换移液管或加样头, 是杜绝细胞之间交叉污染的行之有效的方法.另外要尽量避免在超净台上同时放置多种 细胞系. 细胞培养中最常用的抗生素是青霉素常用浓度为/和链霉素 //.这两种抗生素常常混合使用。许多实验室的培养液中多同时 加入这两种 抗生素.庆大霉素//有广谱抗菌活性,并具有溶液稳定性,故也被一些实验 室采用.以上几种抗生素对霉菌与酵母菌无抑制和杀灭活性。尽管抗生素在预防细菌的 污染方面可能起到一定的作用,然而对已经遭受污染的培养,可能就达不到排除污染的 目的,因而传代培养中加入抗生素可能更体现在对操作者心里的安慰上.虽然普遍认为 抗生素对细胞代谢的影响可忽略不计,但是传代培养最好避免使用,以免影响细胞生长 , 环境的稳定性。美国模式培养物收集中心 引进细胞株的培养中不允许使用抗生素. ’上 .昆虫脂肪体细胞系建立研究进展 到目前为止,已经建立了约株昆虫脂肪体或脂肪体与卵巢混合物来源的细胞系 表,其中大部分为鳞翅目昆虫,也有部分来源于蜚蠊目和鞘翅目昆虫,约占细胞 系总数的%图,个人统计.这些脂肪体来源的细胞系又以幼虫为主,占%个 人统计,而脂肪体和卵巢混合物为材料的细胞系大多取自蛹和成虫.昆虫的脂肪体同 哺乳动物的肝脏具有相似的功能,是重要的生理代谢组织,也是杆状病毒侵染、复制的 主要部位之一.建立更多新的来源于昆虫脂肪体的细胞系,构建更加高效的秆状病毒表 达载体系统既有理论上的意义,又具实践的意义.昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 表昆虫脂肪体来源细胞系及对病毒敏感性病毒敏感性 文献 种 组织来源 细胞系名称 川 甘蓝夜蛾 脂肪体 ; 棚 ?妇丑。喇 艮二 美洲棉铃虫 脂肪体和卵巢 “心呼 。 坤 . 脂肪体 美洲棉铃虫 不详 不详 美洲大蠊 脂肪体 不详 不详 脂肪体 脚’ 美洲大壕 。 脂肪体 :‘村粘虫 脂肪体 不详 圳 连星污灯蛾 脚 :. . 甘蓝夜蛾 脂肪体 ? . 甘蓝夜峨 庸肪体 ;烈 岫铆 :姗、,骆/ 甘蓝夜蛾 脂肪体 明 口:. 甘蓝夜蛾 脂肪体 珥 :.卜 甘蓝夜蛾 脂肪体 ‘ . 桑斑季灯蛾 脂肪体 硐 ? 蛔肿砸.、, 卫 舞毒峨 脂肪体 不详 驷山明托四船; , 桑斑污灯蛾 艏肪体 甜. 曼魄即抛 脂肪体 不详 :嘲 口. 葡萄脊虎天牛 . 脂肪体 咖 脂肪体和卵巢 不详 向 /. 脂肪体和精巢 不详 矗,州 大豆夜峨 脂肪体和卵巢 不详 “,嘲 /脂肪体和卵巢 不详 .,’州 大豆夜蛾 ./ 大豆夜蛾 脂肪体和卵巢 不详 .,嗍 /. ‘ ./ 小地老虎 脂肪体和卵巢 不详 小地老虎 脂肪体和精巢 不详 柏,‘婀 欧洲玉米螟 脂肪体 不详 .,州 阳 欧洲玉米螟 脂肪体 不详 ,嗍 。 甜菜夜蛾 脂肪体 ? .?,?明 甜菜夜蛾 脂肪体 & .,’大蜡螟 脂肪体 不详 ,铆 .. 棉铃虫 脂肪体 ,未发表研 ; 不详 美洲棉铃虫 脂肪体 不详 不详 ,. 美洲棉铃虫 腊肪体 不详第一章前言 .甜菜夜蛾细胞系建立研究进展 自年第一株昆虫细胞系成功建立后至今,近年的时间内,已经建立的昆虫 细胞系超过个,分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅耳和鞘翅目等 多种昆虫,其中大部分来自鳞翅目和双翅目昆虫.昆虫细胞系作为研究材料,一直 是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具, 而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分,表达了大量的具有重大经济 意义或科学意义的外源蛋白质:同时作为生物反应器,扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫 剂,特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂,昆虫细胞也发挥了重要的作用。 到目前为止,来自甜菜夜蛾的细胞系共有余株表.,个人统计。 和从剪碎的甜菜夜蛾初孵幼虫组织中,建立了甜菜夜蛾第一个细胞系 .阳.经克隆形成法,又从.细胞系中分离了.细胞株.第 二株..细胞系是通过甜菜夜蛾血细胞建立的,该细胞系对斜纹夜蛾核型多角 体病毒敏感.等也从甜菜夜蛾初孵幼虫组织中建立了一株细胞系. 对敏感,生长速度比.快。经克隆分离的细胞株能% 被感染,生长速度比快,产生的空斑也比大.年 等建立了四株甜菜夜蛾细胞系/,删., /.,./.也是一株来源于甜菜夜蛾血细 胞的细胞系,接入微孢子虫 .的孢子后,比其它源自鳞翅目昆虫非血 细胞的细胞系更具敏感性。其个克隆株至中,以 对微孢子虫的敏感性最强?.另外还见有其它一些甜菜夜蛾的细胞系出现在文献中, 如德国、/美国、舱..美国、 美国等资料不详.然而到目前为止,除本研究中建立的株甜菜夜 蛾脂肪体细胞系中的株..?和..外,还没有见到其 它甜菜夜蛾脂肪体细胞系的报道。 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法研究以及七株昆虫脂肪体细胞系的建立 “虹柚出埘。嘲 初孵幼虫 蝴;/. 余泽华等,知阁 血细胞 不详 鹪 初孵幼虫 .. 【删 初孵幼虫 不详 不详 不详 不详 胚眙 不详 血瑚蚂 ?曲 胚胎 不详 ?卸 胚眙 不’徉 ; 胚胎 不详 .叼 血细胞 不详 腊肪体 删 珏咀出删 曲咿 腊肪体 压?出删 不详 不详 不详 不