小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及运动皮层中的变化

小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及运动皮层中的变化 小胶质细胞在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及运动皮层中 的变化 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 一虢尹该一: ‘褥二獬簿’遵 ?l。b譬jsj 再。Ij||《H 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名:严刮缸 导师签章: 加|f年6只B 目 录 中文摘要…………………………………………………………………1 英文摘要…………………………………………………………………6 研究论文 小胶质细胞在SODl(G93A转基因小鼠腰髓及运动 皮层中的变化 前言…………………………………………………………………一13 月lJ舌………………………………………………………………… 材料与方法………………………………((:………………………13 结果…………………………………………………………………21 附图…………………………………………………………………23 附表…………………………………………………………………28 讨论…………………………………………………………………29 结论…………………………………………………………………32 参考文献……………………………………………………………33 综述 神经变性病与神经炎症………………………………………37 致谢………………………………………………………………………45 个人简历…………………………………………………………………46 小胶质细胞在SODl(G93A‘转基因小鼠腰髓 及运动皮层中的变化 摘 要 lateral 目的:肌萎缩侧索硬化 amyotrophic 死性神经系统变性疾病，表现为进行性肌肉萎缩、肌无力和锥体束征。患 者多在首次出现症状后的3(5年内因球麻痹、呼吸衰竭或肺部感染而死亡。 病理上以选择性上或,和下运动神经元丢失为特征，伴有小胶质细胞及星 形胶质细胞活化。约5(10,为家族。I生ALS familial 是散发性ALS sporadic dismutase superoxide 物模型。 用人SODl humanSOD，hSODl 转基因鼠进行体内和体外研究， mutant 发现人突变SODl human 神经元受损，包括:异常蛋白质聚集、线粒体功能失调、氧化应激、细胞 骨架异常、轴浆运输受损、谷氨酸兴奋毒性、生长因子缺乏及神经炎症等。 神经炎症是指一种细胞和分子过程，包括小胶质细胞和星形胶质细 nervous 胞的活化及周围免疫细胞的浸润，在中枢神经系统 centralsystem， CNS 的多种病理条件下会发生，包括神经变性疾病如ALS等。神经炎 经变性疾病中神经炎症的共同特点。在ALS神经炎症部位，主要有星形 胶质细胞、小胶质细胞及少量的T(淋巴细胞。大量证据表明，炎症在ALS 中起关键作用，然而小胶质细胞(神经元相互作用导致运动神经元病的本 质仍然不明。目前广泛研究的是小胶质细胞慢性、有害的神经炎症引起神 经元变性。 究对象，应用免疫组织化学及激光共聚焦方法研究转基因小鼠疾病不同时 中文摘要 期运动皮层及腰髓小胶质细胞形态及数量变化，应用免疫印迹法研究小胶 质细胞特异性标记物随病程的表达变化，探讨小胶质细胞在SODl(G93A 转基因小鼠疾病进程中的变化规律，其运动神经元死亡中的可能作 用，为ALS治疗提供潜在靶点。 方法: l转基因鼠的繁殖 pathogen 进行喂养，每个鼠笼随机饲养3(5只小鼠。动物实验过程遵守河北省实验 Gur转基因小 鼠 动物管理办法规定。为维持B6SJL―TgN SODl(G93A l 突变基因稳定下传，将B6SJL 鼠交配繁殖，两种小鼠均购自美国Jackson实验室 BarHarbor,ME， 因扩增鉴定，确定是否带有hSODl基因。 2运动功能评分及实验分组 2(1运动功能评分 运动功能评分从小鼠50天开始每天评分一次。采用4分评分系统。 1 4分正常，无运动障碍; 2 3分悬尾时后肢震颤; 3 2分步态异常; 4 1分至少一侧后肢拖拽; 5 0分将小鼠仰或侧卧，30秒内不能翻正。 2(2实验分组 有模型组、同窝对照组。模型组为SODl(G93A转基因小鼠，对照组为非 转基因同窝对照小鼠，每组每个时间点6只小鼠，均为雌性。症状前期组 取自出生后60天，体重无减轻且无临床症状，评分4分。症状期指体重 开始减轻、出现步态异常，评分2分。终末期以SODl(G93A小鼠体重减 轻 20,，仰卧30秒不能翻身为准，评分0分。 3实验方法 中文摘要 3(1取材 实验期间每天观察动物、评分及称重。在SODl(G93A小鼠症状前期 注射麻醉后，分别以4,多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓或运动皮层 组织迅速投入液氮速冻后于(80?冰箱保存。 3(2免疫印迹 Westem blotting 分别取10mg腰髓及运动皮层组织按试剂盒说明提取总蛋白，BCA lb 4?摇床过夜。r次日，TPBS洗膜5次，每次5分钟。然后分别加入抗兔、 公司 扫膜并分析结果。计算目的条带与GAPDH的灰度比值并进行统计 学处理。 3(3免疫组织化学法 VT 脊髓及运动皮层组织经4,多聚甲醛固定后，Leica1000S振动切 片机切成20pm切片，0(01M 分钟以封闭组织内源性过氧化物酶;0(01MPBS漂洗5分钟×3次后，O(3, 抗体 1:200 40C过夜;0(01MPBS洗5分钟×3次后，加生物素化二 PBS洗5分钟×3次;加辣根过 抗 山羊抗兔IgG 室温2小时;0(01M 氧化物酶标记的链霉卵白素室温1小时;0(01MPBS洗5分钟×3次，DAB 染色lO分钟，捞片，脱水，透明及封片。 3(4共聚焦显微镜法 腰髓组织经4,多聚甲醛固定后，继而用30,蔗糖,4,多聚甲醛溶液 浸泡12小时至组织沉底，以保护组织免受冰冻损伤。冷冻包埋剂OCT 包埋后，经Leica CMl850冷冻并切成30pm切片，与免疫组化方法相似， 经漂洗、穿孔、封闭及抗Ibal抗体孵育后，FITC标记羊抗兔二抗室温孵 FVl000观 察 育1小时，PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，Olympus 中文摘要 及摄影。 3(5小胶质细胞计数 采用Nikon 50i科研级显微镜。每个时期3只小鼠，每只小鼠随机取 症状早期及终末期腰髓前角及运动皮层有完整胞体的Ibal阳性小胶质细 胞数目，并与非转基因对照小鼠相比较。 3(6统计学分析 实验结果以均数4-标准差表示，采用SPSS13(0(4软件，统计方法 为 多样本参数方差分析。P 0(05有统计学意义。 结果: l转基因鼠的鉴定 236bp ，为人SODl基因的PCR产物。 2临床表现 天左右，悬尾实验时小鼠开始出现双后肢震颤，评分3分。在100(120天 左右SODl(G93A小鼠逐渐出现一侧或双侧后肢明显无力、肌肉萎缩及步 态异常，评分2分。之后，双后肢进行性肌肉萎缩，不能支撑身体，进而 至少一侧后肢完全瘫痪，行走时拖拽，评分1分。约在130(150天左右， 将其仰卧后30秒内小鼠不能自行翻转，体重下降超过20,，达到终末期， 评分O分。而同窝对照组小鼠无上述表现，评分始终为4分。 3小胶质细胞变化 3(1通过免疫印记法观察小胶质细胞特异性标记物CDllb表达量，发现同 窝对照组小鼠腰髓表达量很少，且在60天至150天之间，随年龄增长其 表达即有所增多，症状早期明显升高，终末期达高峰 P O(05 。而在 SODl(G93A转基因小鼠运动皮层，CDllb表达与同窝对照组相比无显著 差别 P 0(05 。 3(2通过小胶质细胞特异性标记物Ibal免疫组化染色，发现同窝对照组 腰髓前角Ibal阳性小胶质细胞数目较少，胞体小且突起少，且在150天 中文摘要 龄之前，随年龄变化其数量无明显差异。在SODl(G93A转基因小鼠症状 前期，Ibal阳性小胶质细胞数目轻度增多，症状早期明显增多，胞体增 大，突起增粗，终末期更著。而在症状早期及终末期的脊髓后角，Ibal 阳性小胶质细胞数目也存在轻度增生，但程度远不及前角。在运动皮层， 别。 结论: SODl(G93A转基因小鼠疾病进展过程中存在小胶质细胞增生，且早 在症状前期已经发生，症状早期增生显著，终末期达高峰。小胶质细胞增 生的部位与疾病受损部位一致，且增生程度与病变严重程度成正比。 SODl(G93A转基因小鼠腰髓小胶质细胞的活化可能参与运动神经元的损 伤过程。 关键词:肌萎缩侧索硬化;腰髓;运动皮层;小胶质细胞;CDllb; Ibal;SODl;转基因小鼠 英文摘要 of inthelumbarcordandmotor Changemicroglia spinal mice cortexofSODl-G93A transgenic ABSTRACT lateral afatal objective:Amyotrophicsclerosis ALS isneurodeg― enerative muscular disease，characterized byprogressive and diein3-5 aftertheonsetdueto pyramidalsigns(Patientsusually years bulbar muscle or infection(Itis paralysis，respiratory lung paralysis characterizedthelossof motor lowerM-Ns mainlyby upper neurons MN or or activationof and O,of casesare both，and astrocytes ALS microglia(5―1 of familial fALS ，themajoritycases 90―95, are of and clinicalmanifestation familialALSare similar( sporadic very 20,offALSand4,ofsALSarelinkedtomutationsinthe Approximately forthe geneencodingubiquitouscopper,zincsuperoxide 1 ( thisthe toalaninesubstitutionatthe93rd is Among G93A glycine codon site themostcommonmutant(SOD1-G93A mice transgenicdisplayprogressive human motorneuron andsimilartothecasesof ALS(Sothe degeneration are mutantSOD1一G93Amicethemostcommonanimalmodeltoinvestigate ALSintheworld( Invivo invitro and studieshumanSOD mice using 1 hSOD1 transgenic havedemonstratedthathumanmutantSOD 1 hmSOD1 induces vulnerability ofmotorneurons aberrant through protein stress，cytoskeletal axonal dysfunction，oxidative factor transport，glutamateexcitotoxicity,inadequategrowth signaling，and neuroinflammation( a NeuroinflammationiS termcoinedtodescribecellularandmolecular which activation and of and processesencompasses microgliaastrocytes infiltrationof immune cells(ItOCCURSinthecentralnervous peripheral system a of conditions CNS invariety pathological including asALS(Neuroinflammation in diseases，such isa feature pathologicalpresent 6 chronicand neuroinflammationcontributes notionthat detrimental microglial toneuronal degeneration( SOD1一 G93A This was the studied study developedusing widely andlaser mousemodelof confocal transgenic ALS(Immunohistochemistry wereusedto the in and change microscope investigatemicroglial shape inthelumbarcordandmotorcortexofSOD1一G93A number spinal transgenic miceatdifferent wasusedto the of stages(Westernblotting studyexpression thedisease aimwasto markerwith progressed(Thestudy microglia-specific the of inthedisease its rolein changemicroglia progression，discusspossible for motorneuron ALS degeneration，andprovidepotentialtargets therapy( Methods: l of mice Breedingtransgenic Allanimalswere atconstant and andsterile kept temperaturehumidity f(eed withsterilizedSPFrodents free，SPF ，fed conditions specificpathogen werecarriedout tothe of particles(Experimentsaccordingrugulations animal ofHeBei weremaintained laboratorymanagementprovince(Animals and orfive withadlibitumaccesstowater diet，three mice percage( were SOD1-G93Amiceandtheir littermates Transgenic non-transgenic male Gur,J 1一G93A 1 generatedbybreedinghemizygousB6SJL―Tg SOD 1 ofwhichwere fromthe micetofemaleB6SJLF hybrids，both purchased Jackson Laboratory BarHarbor，ME，USA andoriginallyproducedby micewere of eta1(The identifiedatthreeweeks Gurney geneticoffspring age for SOD1withtissuefromtail( human bygenotyping functionand 2Motor scoreexperimentalgroups 7 。 荚父捅要 _一―――――――?――_―――_――――――_――――――――――-―_?_―_-_―_――――――――――-――_――――――___―-――一 functionScore 2(1Motor wereevaluatedfor ofmotordeficit at50 Themice signs daily， beginning of the 4 followingpointscoringsystem?? daysage，with ofmotor sign dysfunction( 1 (4point，Normal，no areevidentwhen thetail( limbtremors suspendedby 2 (3point，Hind abnormalitiesare 3 (2 present( point，Gait ofatleastonehindlimb( 4 (1point，Dragging to itselfwithin30swhen oneithersideorits fight placed 5 (0point，Inability back( 2(2Experimentalgroups dividedintothree Micewere includingpre-clinical 60days ， groups 100-120 end 130-150days ， clinical stage about onset aboutdays ，and mice(Eachtime included onthe lawofSOD1一G93A based pathogenous point andlittermatecontrol 1-G93A mice model transgenic groups groups(SOD littermatemicewerecontrol ， weremodel groups(Each groups，non―transgenic miceateachtime was had6female point(Pre-clinicalgroup60-day―old group was clinical andno loss(Clinicalonset mice，withoutsymptomsweight whenthemice tolose showabnormalities( defined began weight，andgait not itselfin micelost 20,oftheir could Whenthe bodyweight，and upright scoredasend sideorits was 30secondsalter oneither back,it beingplaced stage( 3Methods 3(1Sampling Tomonitordisease animalswere and progression，the inspected，scored 1 anesthesiawith0,chloral 50mg,kg ， everyday(After hydrate 3 weighed sacrificedat SOD1(G93A micewere pre―clinical 60days ，clinical transgenic 1 end 130-150 the 00(120 days ， and stage about onset aboutdays or werealsosacrificed inthe littermates respectively non-transgenic andmotorcortexwere inthe cord preserved times(Spinal corresponding fixativeafter with saline PBS ， phosphate-buffered transcardiallyperfusion in into1(5ml PBS，or followed freshlydissected，put by4,paraformaldehyde 英文摘要 in thenstoredin一80。C tubes，froze refrigerator( centrifuge liquidnitrogen，and 3(2Western blotting Ten ofwholetissueextractswere atotal milligram preparedusing protein extraction themanufacturer’Sinstructionand kit using following quantified on the of fromeach wasrun BCA method(Thirtymicrogramsprotein sample in 10,SDS―PAGEblottedontoPVDFmembranes(After gels，and blocking 1lb 5,skimmilkforl antibodies rabbitanti-CD hour，primary including anti―SOD added 1:200 ，miceanti―GAPDH 1:200 orgoat 1 1:200 was were at4"C(Next andthememebranesincubated day， respectively overnight 5 minutestime( themembraneswererinsedwithTPBSfortimes，5 every Then or fluorescence-labeled anti―rabbit，anti―miceanti―goat secondary added(Afterincubationfor1hatroom antibody 1:3000 was temperature， wererinsedfor4timeswith l timewith themembranes TPBS，and PBS，5 bandsofinterestweredetecteda11 minutestime(The every usingOdyssey Infrared was Imaging intensity theGAPDH by band，andstatisticallyanalyzed( quantified，normalized 3(3Immunohistochemistry motorcortextissuefixed cordand by Spinal cutinto sectionsa VT1000S (Tlle 201xmfree―floatingusingvibratome Leica inO(01 M timeandthen sectionswererinsedfor3times PBS，5min every inmethanol1 in treatedwith for5min(After 3,hydrogenperoxidase rinsing 0(01M for3 sectionswere with PBS times，5raineverytime，the perforated X一1 for15min(After with10,horseserumforlhat O(3,Triton00 blocking wereincubated at40Cwith room sections overnight antibody temperature，the sectionswere incubated Ibal 1:200 (Afterrinsing，the subsequently against witha anti-rabbit secondaryantibody goatIgG，1:200 for biotin―conjugated 2hatroom horseradish temperature，followedby peroxidaseconjugated and with for1hatroom treatment0(03,diamino― streptavidin temperature benzidineasa for10min(Thesectionswere ontothe chromogen spread slides， in in mounted( ethanol，cleared dehydrated xylene，and 3(4Confocal microscopy 9 英文摘要 The cordfixed was lumbar by spinal 4,paraformaldehyde ina solutionfor12h(BuriedinOCT 30,sucrose,4,paraformaldehyde was andslicedinto cordtissuefrozen medium，the 309m embedding spinal sections a LeicaCM1850 microtome(Similarto using freezing were and sections immunohistochemistry，the incubatedwithIbal incubatedwithFITC―labelled antybody，then goat anti-rabbit antibodiesforlhatroom rinsing secondary temperature(After with were withantifadesolutionand mounted PBS，Slides analyzedby fluorescentconfocal FV1 microscopy Olympus000 ( 3(5Microglialcounting Nikon50iresearch Wasused(Fivefieldsfromthreemicein microscope each were at cellswith group analysed400×magnification(Ibalpositive entirecell werecountedinthelumbaranteriorhornandmotrocortexof body SOD1一G93A miceandtheirlittermatesat and transgenic pre-clinical， onset end stages( 3(6Statistical analysis Resultswere asmeans-土:S(D(Statisticalwere expressed analyses ANOVAwithSPSS13(0(4statisticalsoftware( performedusingone-way were atP O(05( Differencesconsidered signiflcantat Results: lIdentificationof mice transgenic PCR of DNAfrom mice The amplificationproductsgeneome offspring 324 isthePCR of a236 demonstrates:a band，which lL一2，and bp product bp 1 isthePCR OfhSOD band，which product gene( 2Clinicalmanifestation SOD1一G93A micedidnotshowclinical at60 transgenic any changes andscored about80-90of of 4(At mice daysage daysage，thetransgenic showedtremoroftheirhindlimbswhen tailandscored3(At suspendedby 100―120 of ortwohindlimbsofSODl―G93Amice about daysage，one began muscle toweakandshowed wasobserved(At atrophy,andgaitabnormality the of micewerescored beginninggaitabnormality,the 2(Then，muscle 10 英文摘要 ‘ weakness andhindlimbs progressed couldn’t the support atleastonehindlimb andwas when this paralyzeddraggedwalking(Attime， the micewerescored1(Atabout 130-150 mice days SODl(G93A ofage，the can’t itselfwithin30seeand upright lost micewerescored weight 20,(The 0andconsideredasend above were stage(Themanifestationsnotobserved with littermatesthatwere non―transgenic scored4a11thetime( 3 of Changes microglia 3(1Westen resultsofCD1l makerof blotting b specific low 1 ofCDlbinthelumbar cordof mice expression spinal non(transgenic andno differencewasobservedfrom60to150 of the daysage pO(05 (In lumbar cordofSOD1一G93A 1lb spinal transgenicmice，CD expression increasedat and atclinicalonset slightlypre―clinicalstagedramatically stage， andreachedimumatend the motorcortexof stage?0(05 (However,in SOD1-G93A differenceof mice，no CD1l transgenic significant expression wasobserved with compared non―transgenic littermates 胗O(05 ( 3(2 forIba makerof Immunohistochemistry l anotherspecific microglia showedthatfewIba withasmallcell andfew l-positivemicroglia body wereobservedinthelumbarventralhomof prominences littermates， and therewasno differencefrom60to150 of the significant daysage(At ofSOD1一G93A increased pre―clinicalstage mice，Iba 1(positive microglia becameobviousatonset slightly，and andend cell stages，showinglargebody andthick increasedat prominences(Similarly，Ibal-positivemicroglia slightly theonsetandend inthe ismuchlessthanthe stages posteriorhom，which anterior numberofIba inthe hom(However,the motor 1(positivemicroglia cortexofSOD1一G93Amicedidnot with changecompared non―transgenic littermates( Conclusions: ，，? ‘ ‘‘ 。‘一 ‘ ?? 一 lhereare 111the disease of microgliaproliferations progression SOD1一G93A occur totheclinical mice，which prior becomeobviousatonset andreacha attheend stage peak stage(Microglia isin accordancewiththevulnerable the proliferation region，and proliferative 11 ‘ 英文摘要 extentis tothe of proportional activationinthe severity disease(Microglial lumbarcordofSOD1-G93A spinal mice contributetothe ofmotor may injury neurons( Key lateral words:amyotrophic sclerosis;spinalcord; motorcortex; 1l microglia;CDb;Ibal;SOD mice 1;transgenic 12 研究论文 小胶质细胞在SODI(G93A转基因小鼠腰髓及 运动皮层中的变化 (“?釜 刖 青 lateral 肌萎缩侧索硬化 amyotrophic 为进行性肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤及反射亢进，是运动神经元病中最 常见类型。该病至今发病机制不明，普遍认为与遗传环境因素、氧化应激、 线粒体的功能失常、兴奋性氨基酸的毒性作用等有关。其中大约20,家 族性ALS及4,散发性ALS与铜(锌超氧化物歧化酶 Cu,Zn superoxide 线粒体功能失调、凋亡及神经炎症等。 在ALS神经炎症部位，主要有星形胶质细胞和小胶质细胞，小胶质 细胞激活和增生是神经组织损伤的常见反应，以增生和转化为巨噬细胞样 的吞噬细胞为特征。小胶质细胞激活和增生见于AD、PD和ALS等神经 变性疾病的病人中，且与神经元变性部位密切相关【l】。Hallt2】等曾报道 小 胶质细胞和星形胶质细胞激活的顺序，另有报道小胶质细胞增生减少也会 使星形胶质细胞增生相应减少，神经胶质细胞与ALS转基因小鼠疾病发 生和发展之间的关系，国内未见类似报道。 lb和Ibal，通过免疫组化、免疫荧光及免 小胶质细胞特异性标记物CDl 疫印迹技术探讨SODl一G93A转基因小鼠不同疾病时期腰髓及运动皮层 小胶质细胞随病程进展的变化情况，为进一步研究其在ALS运动神经元 变性中的作用提供实验基础。 材料与方法 1材料 1(1实验动物 雄性B6SJL-TgN SODl一G93A l 研究论文 Gur小 突变SODl基因的小鼠为同窝对照组小鼠。 1(2主要试剂 十二烷基硫酸钠 天津化学试剂有限公司 甘氨酸 美国Solarbio公司 异丙醇 天津市标准科技有限公司 甘氨酸 美国Solarbio公司 水合氯醛 天津市光复精细化工研究所 丙烯酰胺 天津化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 天津市永大化学试剂开发公司 磷酸氢二钠 天津市永大化学试剂开发公司 甲醇 天津市永大化学试剂开发公司 生理盐水 石家庄第四制药厂 氯化钠 天津化学试剂有限公司 过硫酸铵 美国Sigma公司 四甲基乙二胺 TEMED 天津市光复精细化工研究所 "Iris碱 天津市光复精细化工研究所 溴酚蓝 美国Amresco公司 p(巯基乙醇 美国 Amresco公司 BCA蛋白检测试剂盒 德国 Novagen公司 蛋白提取试剂盒 北京普利莱基因技术 有限公司 PVDF膜 Millipore公司 预染蛋白标准 Biolabs公司 兔抗CDllb多克隆抗体 abcam公司 兔抗Ibal单克隆抗体 W狄O公司 鼠抗GAPDH单克隆抗体 上海康成生物有限公司 生物素化二抗 北京中杉金桥技术有 限公司 辣根过氧化物酶标记的链霉 北京中杉金桥 技术有限公司 000ml，4。C保存。 8(5,9(09，加双蒸水至1 420 000 1M HClml，加双蒸水至1 Tris(HCI PH 6(8’ :Tris121(149，1N ml，调PH为6(8，4。C保存。 1M HCl420 000 Tris(HCI PH 8(8 :Tris121(149，1N ml，加双蒸水至1 m1，调PH为8(8，4?保存。 TPBS:O(01MPBS500 Tween O(01M 20，4。C保存。 ml，加500I-tl 封闭缓冲液 5,的脱脂奶粉 :1(5 g的脱脂奶粉加入到30ml的0(01M PBS中，混匀，4?保存。 30,丙烯酰胺:丙烯酰胺299，甲叉双丙烯酰胺1g，溶于约60ml双 蒸水中，加热至37?溶解，补双蒸水至终体积为100ml，棕色瓶中4。C保 存数月。 10,十二烷基硫酸钠 SDS :SDS 109，溶于100ml双蒸水中，加 热到68?溶解，室温保存。 10,过硫酸铵:过硫酸胺19，溶于终体积为10ml的双蒸水中，室温 可保存7天，4?可保存14天。 5×上样缓冲液:1M Tris―HCl pH6(8 1(25ml，SDS O(59，溴酚兰 25mg， 15 研究论文 巯基乙醇25山。 电泳缓冲液: 5×贮备液:甘氨酸479，Tris7(559，加双蒸水至500ml。 1×工作液:5x贮备液95ml，10,SDS 5ml，加双蒸水至500ml。 转膜缓冲液: 10×贮备液:甘氨酸14(59，Tris299，SDS1(859，加双蒸水至500ml。 lxT作液:lO×贮备液100ml，甲醇200ml，加双蒸水至1000ml。 10,分离胶: 1MTris(HCL TEMED 30,丙酰10,SDS双蒸水10,APS 鱼旦鱼:墨!!翌坠 翌12 1丛!! !翌12 1丛12 些12 6ml 0(75 1(0 60 4(12 60 6 1(4主要实验仪器、设备 5331型梯度PCR仪 德国Eppendorf公司 GBOX(HR全自动凝胶成像系统 英国SYNGENE公司 数码相机 日本NIKON公司 5417R台式冷冻高速离心 德国Eppendorf公司 Synergy―HT多功能酶标仪 美国BIO(TEK公司 Odyssey双色红外荧光成像系统 美国LI(COR公司 超净工作台 江苏苏净集团 普通冰箱 海尔集团 超低温冰箱 日本SANYO公司 微量移液器 德国Eppendorf公司 DYZ(22A型双恒定时电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-12型电泳仪 北京市六一仪器厂 DYCZ(40B型电泳槽 北京市六一仪 器厂 制冰机 日本SANYO公司 研究论文 万向脱色摇床 北京市新技术研究所 FA2004A电子分析天平 上海精天电子仪器有限公司 YX0602型电热式蒸气消毒器 山东新华医疗器械厂 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司 SF(2000型塑料封口机 温州兴业机械设备有限公司 2方法 2(1转基因鼠的繁殖 pathogen 笼随机放3(5只小鼠，保证小鼠有充足的鼠料及水直到终末期。为维持 Gur转基因小鼠突变基因稳定下传，将B6SJL B6SJL(TgN SODl(G93A l SOD1(G93A,+半合子雄鼠与B6S儿F1,J雌鼠交配繁殖。 2(2SODl(G93A转基因鼠的鉴定 2(2(1 DNA的提取 剪取子代鼠的尾尖组织约lmm，置于加入约150ul50mM的NaOH 1M 的EP管中，95。C孵育30分钟，涡旋使鼠尾尖充分消化后，加入12(5ul Tris(HCL PH 8(O ，再涡旋，10(000 rpm离心2分钟。基因组DNA即 在上清液中。 2(2(2多聚酶链反应 PCR 流程 目的基因引物的合成 IL(2引物序列: GGCCACAGAATTGAAAGATCT(3’ 上游5'-CTA C(3’ GGTGGAAATTCTAGCATCATC 下游5'-GTA 突变SODl引物序列: CAGCCCTAATCCATCTGA(3’ 上游5’(CAT TAA TCA TGA(3’ GAC CAAAAG 下游5’(CGC 目的基因的PCR扩增 基因扩增条件为:95?3min，然后95?45S，60?30s， 35个循 环 ，72?延伸5min。 凝胶电泳结果分析 吸取10ul 80V，30min，用GBOX(HR全自动凝胶成像系统拍摄打印实验结果。 研究论文 2(3实验分组及病程分期 天 及终末期 130(150天 取材。 同窝对照组:选取非转基因同窝对照小鼠18只，雌性，每组6只。 分别于对应时间点取材。 2(4疾病临床诊断及评分标准【3】 评分采用单盲评分法 评分者不知道小鼠基因类型 。症状前期组取 白出生后60天，体重无减轻且无临床症状，评分4分。症状早期指体重 开始减轻、双下肢屈曲、出现步态异常时，评分2分。终末期指体重减轻 20,，双下肢瘫痪、仰卧30秒内不能翻身的濒死状态，评分O分。实验 期间每天观察动物，观察小鼠有无肢体的伸展异常和震颤，有无肢体的无 力或瘫痪、步态的异常、翻身困难、体重减轻等，观察呼吸、吞咽功能、 皮肤营养情况。每天称体重1次。 2(5实验取材 灌流固定取材或新鲜取腰髓和运动皮层组织迅速投入液氮速冻后保存于 (80?冰箱。 2(6小胶质细胞的测定 2(6(1蛋白质的提取 取出(80。C保存的各组脊髓及运动皮层标本，分别称取约10mg的组 织置EP管中，分别标记，并在碎冰块儿上缓慢解冻，加入预冷至0。C的 O(5(1(0ml的蛋白裂解液，用超声破碎仪破碎至组织完全裂解;取0(5ml 组织匀浆液至1(5ml离心管，加入2倍体积 1m1 的抽提液充分混匀， 室温或4?静置10mira 中间为蛋白膜，吸除上、下层液体，蛋白膜附着在离心管壁上;敞开管口， 将上清液移至另一微量离心管，分装后保存于(80?冰箱备用。 2(6(2蛋白浓度的测定 采用BCA试剂盒检测，以牛血清白蛋白为标准蛋白，用多功能酶标 研究论文 仪测OD值做标准曲线，然后检测样本相应OD值，对照标准曲线得出样 本蛋白浓度。具体步骤如下:用生理盐水分别配置浓度为1000，500，250， sulfate:BCA solution为 1:20 125，62(5(g,gl的标准蛋白，按4,curpric 比例配置上样液，测定时分标准孔、测定孔、空白对照孔，标准孔先加入 25山的标准品，再加入2009l的上样液，测定孔每孔再加入2(5山的待测 蒸馏水，混匀，37。C孵育30 调零后，读出每个样本的OD值，再得出相应的浓度值，然后根据浓度值 计算出每30txg蛋白所需要蛋白的体积。 2(6(3Western blotting分析 准备玻璃板，依次用水，乙醇，水冲洗，干燥，安装。 配置10,分离胶，灌入准备好的玻璃板间隙中，留出灌浓缩胶所需 空间 约1(5cm ，分离胶表面加入一层异丙醇，以防止空气中氧对凝胶 聚合的抑制作用，凝胶静置于室温下约30min，使胶完全聚合; 用洁净的滤纸尽量吸净覆盖层液体异丙醇，配置5,的浓缩胶并加入 分离胶上端，插入聚四氟乙烯梳子，避免气泡的产生，置于室温聚合; 在浓缩胶聚合的同时，取出冷藏的蛋白质标本，吸取30“g待测蛋白 加入到1(5ml离心管，并加入等体积5×上样缓冲液，混匀;置100?水中 煮沸5min;12000转，4?离心lmin，待上样; l×电泳缓冲液，排净凝 胶 浓缩胶聚合完全后，电泳槽中加入500ml 下部的气泡，拔出梳子，摆直梳齿; 按顺序把蛋白和上样缓冲液的混合液上至电泳槽的齿梳之间，其中一 孔加入59l已知分子量的蛋白质标准品 蛋白质Marker 。 电泳槽接电泳仪，以80V电压电泳，至溴酚兰染料进入分离胶;100V 电压继续降溴酚兰染料到达分离胶底部，关闭电源。 将玻璃板取出，将分离胶剥离，分别切取所需要的己知分子量的蛋白 条带，标记方位后，放入提前配好的1×转膜缓冲液中平衡5min;将干净 滤纸剪成凝胶大小，用前浸入转膜缓冲液中平衡至少5mira准备与凝胶、 min，然后放入转膜缓冲液 中， 滤纸同样大小的PVDF膜，先放入甲醇中1 依次在转移夹中由负极向正极放置海棉、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三 层滤纸和海棉，注意每层之间不能有气泡; 研究论文 闭1h: 用5,脱脂奶粉配制一抗，一抗的稀释浓度依据各抗体的说明书 其 中CDl 释好的一抗中孵育，4"C过夜; 0(01M TPBS摇震漂洗5minx5次; 按l:3000稀释后与PVDF膜室温避光孵育2h; 0(01M TPBS摇震漂洗5min×4次，0(01MPBS摇震漂洗5minx1次; Infrared Odyssey Imaging 的比值。 2(6(4免疫组织化学法 VT 脊髓及皮层组织经4,多聚甲醛固定后，Leica 1000S振动切片机 切成201am切片，0(01M 单克隆抗体 1:200 40C过夜;0(01MPBS洗5分钟×3次后，加生物素 PBS洗5分钟×3次;加辣 化二抗 山羊抗兔IgG 室温2小时;0(01M 根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温l小时;O(01MPBS洗5分钟×3次 后DAB染色15分钟，捞片，脱水，透明及封片。 2(6(5共聚焦显微镜法 脊髓组织经4,多聚甲醛固定后，继而用30,蔗糖,4,多聚甲醛溶液 浸泡12小时至组织沉底，以保护组织免受冰冻损伤。冷冻包埋剂OCT 包埋后，经Leica 似，经漂洗、穿孔、封闭及一抗孵育后，FITC标记羊抗兔二抗室温孵育 FVl000观 察及 1小时，PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，Olympus 摄影。 2(6(6小胶质细胞计数 采用Nikon 50i科研级显微镜。每个时期3只小鼠，每只小鼠随机取 5个视野，400放大倍数下分别计数症状前期、症状早期及终末期腰髓前 角及皮层有完整胞体的Ibal阳性小胶质细胞数目。 研究论文 2(7统计学处理 1 采用SPSS3(0(4软件进行统计学处理，统计方法为多样本参数方差 有统计学意义。 结 果 l转基因鼠的鉴定 带 324 GCT替代GGT 突变。 2临床变化 分3分。随后渐出现一侧或双侧后肢明显无力、悬尾试验双后肢屈曲及步 态异常，评分2分。之后，双后肢进行性肌肉萎缩，出现至少一侧后肢完 全瘫痪，行走时的拖拽现象，评分1分。约在130(150天左右，小鼠四肢 均受累，将其仰卧在30秒内小鼠不能自行翻转，体重下降20,以上，达 终末期。评分为O分。同窝对照小鼠表现正常，评分始终4分。 3小胶质细胞CDllb表达及形态、数量的变化 lb 3(1小胶质细胞特异性标记物CDllb的表达变化:小胶质细胞抗CDl 抗体可识别出一条明显的条带，分子量大小约为170kDa。 lb在同窝对照组表达很少，且在60天至150天之间， 在腰髓，CDl lb 随年龄增长其表达无明显差异。SODl(G93A转基因小鼠症状前期CDl 表达即有所增多，症状早期明显升高，终末期达高峰 Fig(1 。 在运动皮层，CDl 无显著差别，且随病程进展无明显变化 Fig(2 。 3(2小胶质细胞形态及数量变化 以小胶质细胞特异性标记物Ibal抗体 研究论文 来研究 :同窝对照组腰髓前角Ibal阳性小胶质细胞数目较少，胞体较 小，突起少而细，且在150天之前，随年龄变化其数量无明显差异。在 SODl(G93A转基因小鼠症状前期，Ibal阳性小胶质细胞数目有所增多， 且可见到胞体增大、突起增粗、激活的小胶质细胞。症状早期小胶质细胞 数目明显增多，胞体及突起粗大，呈Ibal强阳性。终末期Ibal阳性小胶 质细胞进一步增多，胞体增大，呈显著激活状态，遍布整个脊髓前角 Fig( 3(4 。腰髓前角Ibal阳性小胶质细胞计数显示随疾病进展其数量逐渐增 1 。脊髓后角Ibal阳性小胶质细胞在症状早期 多，以终末期为著 Table 及终末期有轻度增生及胞体增大，但其程度远不及脊髓前角 Fig(5_ 。在 运动皮层，小胶质细胞表达量在同窝对照组 130(150天 及终末期组没 有明显差别 Fig(6 。 研究论文 ’ ?――――――――