紫草栓剂的制备工艺

紫草栓剂的制备工艺 吉林农业大学硕士学位 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第一章 前言 1.1 紫草的研究概况 1.1.1 紫草的生物学特性 紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.是紫草科紫草属的多年生草本植物。别 [1]名硬紫草。传统药用部位为根。有平伏状粗毛。根粗大，圆锥形，干时紫色。茎直立，上部分枝。叶互生，披针形，长4(5,8cm，宽1,2cm，无柄或具柄。花萼裂片线性;花冠白色，长6,8mm，喉部有5鳞片，鳞片顶端微凹。小坚果卵形，长约3mm，灰白色，光滑。花期5,6月，果期7,8月。生于荒山田野、路边及干燥多石山坡的灌木丛中。春、秋季采挖，除去泥沙，干燥。根圆柱形，扭曲，有分枝，长7,14cm，直径1,2cm。表面紫红色或紫黑色，粗糙有纵纹，皮部薄，易剥落。质硬而脆，易折断，断面皮部深紫色，木部较大，灰黄色。性寒，味甘、咸。 [1]中药紫草在中国药典上有三种品种，分别是紫草科植物紫草、新疆紫草、内蒙紫草(又称黄花软紫草)的干燥根。药材按质地把紫草分为硬紫草和软紫草。硬紫草正品为紫草;假紫草(内蒙紫草)和帕朱尔假紫草同时归入硬紫草;软紫草是新疆紫草，而天山紫草一般归入软紫草。除此之外，滇紫草(Onosma paniculatum Bur(et Franch()在云南也常作 [2]紫草入药。这几种紫草的品质非常不同，所含紫草素及其衍生物的总量分别为(薄层色谱扫描):新疆紫草:2(019%，硬紫草:0(384%，滇紫草:0(105%，蒙紫草:0(215%， [2]显然以新疆紫草品质最佳，所以目前新疆紫草已成为主要的商品紫草。 新疆紫草(又称软紫草)，来源于紫草科植物新疆紫草Arnebia euchr0ma(Royle) Joh nst(的根。其植物形态为多年生草本，高15,35cm。全株被白色硬糙毛。根圆锥形，多扭曲，紫色栓皮多层。茎直立，单一或基部分成二歧。基生叶丛生，叶条状披针形，长约13cm，全缘，黄绿褐色;茎生叶互生，较少，短小。花集结成聚伞花序，密生于茎顶，近于头状;苞片条状披针形;花无梗，花萼短筒状，5深裂;花冠紫色，长筒形漏斗状，管部与花萼裂片近于等长，先端5裂，裂片椭圆形，喉部与基部光滑;雄蕊5，着生于花冠管中部，花丝极短或无;子房4深裂，花柱细长，柱头球状。小坚果骨质，宽卵形，淡褐色，表面有疣状突起。花期6,8月，果期8,9月。生于山地阳坡草丛中。春、秋季采挖，晒干或微火烘干。根呈不的长圆柱形，多扭曲，长7,20cm，直径1,2?5cm。表面紫红色或紫褐色，皮部疏松，呈条片状，常10余层重叠，易剥落。顶端有的可见分歧的茎残基。体轻，质松软，易折断，断面不整齐，黄白色或黄色。气特异，味微苦、涩。 [3]紫草在我国及亚欧等国分布广泛。在我国，硬紫草分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山西、江苏、安徽、江西、湖北、湖南、陕西、四川、贵州等地，主产于东北及华北地区。新疆紫草主产新疆和静、阿克陶、塔什库尔干、温泉、昭苏等地。内蒙紫草分布于甘肃、内蒙古。 1 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 1.1.2 人工栽培的研究 我国各类市场所需用的紫草现几乎完全依靠野生，主要分布于东北、华北、华东、华中、西南等地区及陕西、新疆、内蒙、西藏等省、自治区。而人工栽培紫草刚刚起步，只在辽宁的沈阳、灯塔、本溪、清原的几个市县有小量试点种植，尚未形成规模，产量很少。由于人们滥采滥挖，造成了野生紫草资源连年下降，虽然我国已进行大量人工栽培，也难以满足日益增长的需要。近2年已呈匮乏之势，产区少有大货供应市场，同时，产区不断开荒造田、开矿修路、城市改造、小区建设、兴办旅游区等多项举措，使野生紫草的生长环境遭到了很大破坏，导致野生产量逐年下降。市场对紫草需求量的增加和紫草产量的减少，已造成供应链的缺口，而且缺口呈逐年加大之势。调查数据显示，紫草缺口2007年为500吨，2008年为800吨，预计2009年缺口将增至1000吨左右。所以我国紫草野生资源虽然较为丰富，但随着人们大量采集，目前已接近枯竭。 1.1.2.1 新疆紫草的栽培 [4]新疆药业集团新疆中药民族药研究所李晓瑾等人完成了新疆紫草人工栽培及化栽培技术的研究，成果通过自治区科技成果鉴定，技术水平处于国内领先地位。 1.1.2.2 黄花紫草的栽培 [4]谢晓蓉等人介绍了黄花紫草从采种、种子处理、播种技术(春播、秋播、播种深度)、田间管理(化学除草技术、间苗、施肥)到病虫害防治，再到采收与加工的全过程。涉及了 最终总结出一套合理的黄花紫草的栽培。 具体操作的许多细节， 1.1.2.3 紫草生物繁殖技术 [4]中国科学院武汉植物研究所刘长军等对真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长及紫草素合成的影响进行了研究。新疆大学生命科学与生物技术学院主要进行了新疆紫草产色素组织的组织细胞学、新疆紫草外植体组织培养和植株再生、新疆紫草外植体诱导愈伤组织、新疆紫草无性繁殖体系的建立进行了研究。 1.1.3 紫草的化学成分研究概况 紫草中具有多种生物学活性成分，有效成分主要为两大类:一类是脂溶性很强的萘醌类色素:包括紫草素(shikonin)，乙酰紫草素(acetyl-shikonin)，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(isobuthyl—shikonin)，β-羟基异戊酰紫草素(β-hydaroxyisovaleryl shikonin)，异戊酰紫草素(isovaleryl shikonin)，去氧紫草素(deoxy shikonin)等;另一类是水溶性成分:主要是多糖， [1]含量在2%左右。 [4]从新疆紫草及其根的石油醚提取物中可以分离出萘醌色素类化合物,它们是β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁(β,β′-dimethylacrylalkanin，?)，去氧紫草素(deoxyshikonin，I)，消旋乙酰阿卡宁(dl-acetylalkanin，?a)，乙酰阿卡宁(acetylalkanin，?b)，β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(β-acetoxyisovalery-lalkanin，?)，消旋紫草素(dl-shikonin，?)，β-羟基异戊酰阿卡宁 2 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 (β-hydroxyisovalerylalkanin，?)，l-甲氧基乙酰紫草素(l-methoxyacetylshikonin,Ae-I)，乙酰紫草素(Acetylshikonin)，紫草素(shikonin)。还有紫草嘧啶A、B(Lithospermidin A、B)和紫草呋喃A,E(Shikonofuran A,E)。其中β-羟基异戊酰阿卡宁和l-甲氧基乙酰紫草素为新化合物，消旋乙酰阿卡宁，乙酰阿卡宁，β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁为新疆紫草中首次发现的已知成份。此外，还含有β-羟基异戊酰紫草素，2,3-二甲基戊烯酰紫草素，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素，异丁酰紫草素及去氢阿卡宁等。其中去氧紫草素、去氢阿卡宁、三甲基丙烯酰紫草素为新疆紫草的特有成份。新疆紫草主含β,β′-二甲基丙烯酰紫草素，而硬紫草主含乙酰紫草素，除未检出去氧紫草素、去氢阿卡宁和三甲基丙烯酰紫草素外，其余成分与新疆紫草相同。 1.1.4 紫草药理作用研究概况 紫草在我国有悠久的药用历史，其味苦、辛，性寒，归心、肝经，有清热凉血、活血、解毒透疹的功效，主要用于温热病热入营血，斑疹紫黑，疮疡，水火烫伤等。 1.1.4.1 抗炎作用研究概况 皮下注射紫草素10mg/kg对小鼠巴豆油耳炎症和大鼠酵母性足趾肿有明显抑制作用, 紫草素的抗炎作用,并推测萘醌类化合物对5-脂氧酶活性抑制作用是由其还原性决定验证 [5] 的。 1.1.4.2 抗菌作用研究概况 [6]李惠兰等采用纸片扩散法对滇紫草、新疆紫草和露蕊滇紫草提取物进行抑菌实验。结果表明,滇紫草、新疆紫草和露蕊滇紫草对金黄色葡萄球菌、α2溶血性链球菌、大肠埃希菌和变形杆菌均有抑制作用。日本的佐佐木健郎也证实紫草与新疆假紫草中萘醌类色素成分乙酰紫草素对白念珠菌的抗真菌作用。 1.1.4.3 抗病毒作用研究概况 [7]罗学娅等采用细胞病变法发现紫草的有效成分左旋紫草素对副流感病毒有抑制作用。紫草素还可通过下调HIV21主要受体CCL25的表达、抑制HIV病毒株的复制而对抗HIV [8]病毒。此外,紫草对单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、带状疱疹病毒和甲型肝炎病毒均有抗病毒作用。 1.1.4.4 抗肿瘤及免疫调节研究概况 [9-11]紫草的有效成分紫草素及其衍生物对多种肿瘤都有抑制作用,如对小鼠胶质瘤细胞C6、小鼠腹腔积液肉瘤S180、自发性乳腺肿瘤、恶性葡萄胎、人宫颈癌细胞、hela细胞、人大肠癌细胞CCL229等均有抑制作用。作用机制研究表明,紫草素类化合物及其衍生物能诱导肿瘤细胞凋亡，激活促细胞分裂原激活蛋白激酶(mitogen-acti-vated proteinkinase,MAPK)，抑制蛋白酪氨酸激酶和DNA拓扑异构酶I的活性，从而影响肿瘤细胞的代谢、增殖、分化、信号传递、基因表达等过程,阻碍肿瘤细胞的生长。 3 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 1.1.4.5 保肝作用研究概况 [12]紫草水提物对四氯化碳诱导的动物肝细胞损伤有保护作用。刘燕等运用卡介苗和脂多糖建立免疫性肝损伤模型,证实新疆紫草的脂溶性提取物和水溶性提取物可不同程度地改善肝脏病理组织性损伤。 1.1.4.6 抗生育作用研究概况 [13]法韫玉等将600例停经42d内的早孕妇女分两组,分别应用米非司酮联合紫草配伍米索前列醇及米非司酮配伍米索前列醇进行药物流产,结果表明米非司酮联合紫草组的完全流产率明显高于米非司酮组。前者孕囊排出时间较后者明显缩短,孕囊排出率升高,且出血时间和出血时间超过10d的发生率亦较后者明显缩短和减少。后证实从紫草根中分离得到的酚类化合物rabdosiin二钾盐具有显著的抗生育活性。 1.1.4.7 促进创面愈合作用研究概况 [14]紫草油能显著促进创面的愈合，彭浩等发现复方紫草油可能通过调节创面的内皮素(ET)-1、一氧化氮(NO)的含量，优化ET21/NO的比值，从而减少创面组织细胞膜的脂质过氧化损伤程度。 1.1.4.8 抗甲状腺作用研究概况 [15]Michael Auf,mk olk等人详细研究了紫草及其有关成分的抗甲状腺作用，认为具有3,4-二羟基肉桂酸结构的物质是抗甲状腺作用的前体。这类酚类物质发生自氧化所产生的邻醌是活性物质，邻醌与体内蛋白质的结合导致激素不能与受体结合从而产生抑制作用。 1.1.4.9 止血作用研究概况 用数种紫草的水、醇提液10g/kg给小鼠灌胃,连续3d,对其断尾出血均有不同程度的止 经乙醇提取的紫草有效成分对溶血小板激活因子乙酰转移酶有抑血作用。国外研究表明, [16]制作用。 1.1.4.10 抗前列腺素生物合成作用研究概况 从紫草A . euchroma 根中分离到4个单萜苯酚和2个单萜苯醌，它对体外前列腺的生物 [17]合成具有不同程度的抑制作用。 1.1.4.11 其他药理作用研究概况 乙酰紫草醌和紫草醌表现出明显的抗氧化活性,与维生素E一起使用,显示较强的协同 [18]增效作用。紫草素可在体外抑制内皮细胞的血管新生活性,通过抑制其增殖、迁移及管 [19]腔形成而发挥其抗血管新生作用。紫草醇提取物对表皮细胞过度增生均有明显的抑制作[20]用。从紫草A . euchroma 中分离到的4个紫草素类化合物对骨胶原、花生四烯、血小板活化因子(PAF)、ADP和凝血酶引起的兔血小板凝聚具有抑制作用，起到抗凝血作用等等[21]。 1.1.5 紫草的临床应用与展望 4 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 紫草为一常用中药,其药理作用确切,临床应用广泛。目前紫草主要应用于治疗皮炎、皮疹，体表疮疡，烧烫伤，鼻中隔糜烂，口腔溃疡、牙周炎，静脉炎，溃疡性结肠炎，宫颈糜烂，肛窦炎，紫草油涂唇可治慢性唇炎，加味紫草油外用治疗接触性皮炎、冻疮等[22]-[41][42]，国内也有以紫草为君药的中药复方治疗前列腺炎的案例，紫草素具有多种生物活性，对紫草素为先导化合物开发消炎、抗肿瘤、抗病毒的新药研究己经成为热点课题。用紫草素单味药治疗前列腺炎的文献和研究尚未见报道。除此之外，紫草素还是良好的天 [44]然色素，己广泛用于食品、化妆品和印染工业中，需求量巨大。近年来有许多关于紫草素的全合成、不对称合成及组织培养等研究的报道,但尚无合成工艺用于生产,组织培养法也不适于实验室中简单、快速地制备紫草素。从紫草中提取分离紫草素仍是较快速、便利 [45]的途径。目前对新疆紫草的药理机制研究还不深入,特别是对其抗肿瘤及艾滋病方面有待进一步研究与实验。随着新疆紫草资源综合利用开发能力的增强，相信新疆紫草资源应用前景将十分广阔。经过药学工作者的不懈努力,相信必将会取得更多的研究成果。 1.2 前列腺炎的治疗情况 慢性前列腺炎是泌尿男性生殖系统的常见病、多发病，发病率高、病程迁延、顽固难愈。 目前，对于前列腺炎的治疗，国内外主要采用抗生素疗法，也有少数治疗此病的中成药如前列康等，这些疗法存在诸多弊端。一方面由于前列腺的生理结构所致，采用口服或注射给药途径治疗，到达病变部位的药物浓度很低，因此临床效果较差，另一方面，抗生素的副作用较大，临床上由于长期大量采用抗生素治疗前列腺炎引起肝、肾功能障碍的病例也屡见不鲜。 由于前列腺与肛门在生理结构上距离较近，采用中药栓剂通过肛门给药，药物容易到达病变部位，局部药物浓度较多，因此药物作用起效快、作用时间长、疗程短、见效快。而且用纯中药，不具毒副作用，对肝肾功能不会造成损害，因此，中药栓剂是一种治疗前列腺炎的理想制剂，现在有一些以紫草为君药的中药复方的栓剂来治疗前列腺炎，有一定的疗效。 本品前列宁栓是一种纯中药制剂，它采用紫草单味药，用高新技术提取有效部位制成中药栓剂。产品纯度高，用药剂量小，有效单体含量可达70%，用量为西药注射剂的剂量水平，前列宁栓治疗前列腺炎药效学试验和临床观察均收到了较好效果。 1.3 本研究的目的及意义 慢性前列腺炎属中医淋症范畴，多由膀胱气化不利，湿热下注所致。其临床症状表现为下焦湿热之候，如小便热涩或有刺症，少腹满急，排尿不畅，甚者有尿频、尿急，并伴有性功能障碍等。前列腺炎是一种发病率非常高且让人十分困惑的疾病，接近50%的男子在其一生中的某个时刻将会遭遇到前列腺炎症状的影响。病人的病情反复发作，使患者的 5 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 身心受到了极大的折磨。所以寻找、研制有效药物，提高治愈率，一直是国内外泌尿外科学界亟待解决的重要课题。 紫草具有清热解毒、活血凉血之功。将其用于淋症的治疗，祖国医学古籍文献中早有记载，《本草纲目》载:紫草能“祛湿热利窍”，又言“苦寒性滑、故利九窍而通利水道也”。《千金翼方》中用紫草一两，为散，治小便卒淋。《证治准绳》中用紫草治血淋。《证类本草》也记载紫草主心腹邪气、五疸，补中益气，利九窍，通水道。这些古籍文献说明，紫草治疗前列腺炎，祖国医学早有应用。 本研究前列宁栓是以传统中药紫草的有效成分为原料，通过单因素对提取溶媒、提取方法的选择进行考察，单因素考察碱液放置时间、酸化时加酸量和沉淀量的关系，干燥温度对紫草提取物含量的影响，采用正交试验法对提取条件、萃取条件进行优选。“正交试验法”是研究与处理多因素试验的一种科学有效的方法。其要点是需要设计多因素试验方案，选择合理的试验设计方法，使之既能减少试验次数，又能收到较好的效果。需要注意的是，得到最佳的试验水平的组合，如果是已经做过的正交试验中没有出现过的。它是否真正符合客观实际，还需要通过试验或生产实际来进行验证。最终优选出最佳的紫草提取物提取工艺条件，从而达到了充分提取紫草的有效部位，获得高收率的有效成分左旋紫草素的目的。 在剂型上选择了栓剂。栓剂是指药物与适宜基质制成供腔道给药的固体制剂。按国家有关规定，栓剂在生产与储藏期间均应符合下列有关规定。栓剂常用基质有半合成脂肪酸甘油酯、可可豆油、聚氧乙烯硬脂酸酯、氢化植物油、甘油明胶、聚乙二醇类或其他适宜物质。某些基质中可入表面活性剂使药物易于释放和被机体吸收。供制栓剂用的固体药物，除加有规定外应预先用适宜方法制成细粉，并全部通过六号筛。根据施用腔道和使用目的不同，制种各种适宜的形状。栓剂中药物与基制应混合均匀，栓剂外形要完整光滑，应无剌激，应无剌激性;塞入腔道后，应能融化、软化或溶化，并与分泌液混合逐渐放出药物，产生局部或全身作用;并应有适宜的度，以免在包装或储藏时变形。栓剂所用包装材料或容器应无毒性并不得与药或基质发生理化作用，除另有规定外，应在30?以下密闭保存，防止因热、受潮而变形、发霉、变质。因此本研究通过对成栓基质、加药量、铸栓温度等多方面因素进行考察，采用正交试验法，经反复试验，优选出最佳成型工艺条件。从而达到制出安全、有效、稳定的栓剂的目的。 对其再进行质量标准研究和稳定性研究，通过采用高效液相法测定前列宁栓剂和原料中有效成分左旋紫草素的含量。采用薄层层析法鉴别前列宁栓剂和原料中的主要有效成分。对前列宁栓及其原料室温稳定性进行考察，对紫草提取物进行影响因素试验和加速试验。从而保证了此栓剂的质量稳定。 目前，紫草药材的利用主要用于复方制剂中，用量较少，对其开发利用也非常有限。本研究是用紫草单味药制成栓剂来治疗前列腺炎，国内目前没有此例的文献研究报道。本 6 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 研究已申请专利，具有完整的知识产权。本研究完成后，可以使该药材得到充分利用，为大量种植的紫草药材开辟了新的应用市场，对药材的种植、生产、加工及相关产业都具有提升作用。本研究适合工业化生产，促进就业，推动了经济的发展。 7 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第二章 原料的工艺研究 2.1 实验材料 新疆紫草药材:吉林省宏检医药药材公司，含量:1.92%(紫外法) 北京同仁堂长春分店，含量:2.096%(紫外法) 左旋紫草素对照品:购自中国药品生物制品检定所，批号:769-200204 2.2 仪器与试剂 2.2.1 仪器 DG-160分析天平 (北京光学仪器厂) N-2000双通道色谱工作站 (浙江大学智能信息工程研究所) LC-8A高效液相色谱仪 (日本岛津) SPD-6A 可变波长紫外检测器 (日本岛津) KQ-250DB型数控超声波清洗器 (昆山市超生仪器有限公司) DZF-1B型真空干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) HA121-50-01型超临界CO萃取仪 (南通市华安超临界萃取有限公司) 2 电热恒温水浴锅 (河北省黄骅航天仪器厂) 日本shimadzu Uv,265FW紫外分光光度计 日本shimadzu 2201紫外分光光度计 2.2.2 试剂 石油醚(60~90?)，氢氧化钠，硫酸，乙醇，三氯甲烷，甲醇(色谱纯)，冰醋酸， 提取用水为蒸馏水。 2.3 实验方法 2.3.1 紫草有效成分的提取工艺路线 溶剂提取 碱液萃取 酸沉 紫草粗粉 提取液 萃取液 沉淀 水洗至中性、干燥 紫草提取物 8 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 2.3.2 紫草提取物中左旋紫草素含量的测定方法 2.3.2.1 紫外分光光度法 ? 对照品溶液的制备 精密称取左旋紫草素对照品5.13mg，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。 ? 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分别置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线。得直线方程及线性范围。 ?(左旋紫草素含量的测定 精密称取已干燥的紫草提取物2.5mg，置于100ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，于516nm波长处测定吸收度A，所得的吸收(A)值代入回归方程，得到的C值，经计算即可得紫草提取物中左旋紫草素的含量。 样品含量(%),C×测定体积×样品稀释倍数/样品干重×100% 2.3.2.2 高效液相色谱法 ? 色谱条件 流动相:三氯甲烷:甲醇:水:冰醋酸(8:50:36:6)，流速:0.8ml/min，检测波长:270nm，灵敏度:0.08AUFS，纸速:1.0mm/min，衰减,0。 0mg，置于10ml容量瓶中，用乙醇? 对照品溶液的制备 精密称取左旋紫草素对照品2. 溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 ? 标准曲线的制备 精确吸取左旋紫草素对照品溶液1、2、3、4、5μl，高效液相色谱测定，以样品量为横坐标，峰面积为纵坐标，回归得直线方程及线性范围。 ? 供试品的制备 精密称取样品2.0mg，置于10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 ? 供试品含量的测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算提取物中左旋紫草素的含量。 样品含量(%),(样品的峰面积/对照品的峰面积)×(对照品溶液浓度×对照品进样体 积)×(样品溶液总体积/样品进样体积)/取样品的干重×100% 2.3.3 收率的计算方法 紫草提取物收率(%)=得到的样品量/原样品量×100% 左旋紫草素收率(%)=紫草提取物收率×紫草提取物中左旋紫草素含量 2.3.4 紫草提取物溶剂系统的筛选 作为紫草抗炎的有效成分之一的左旋紫草素，在这类萘醌色素类脂溶性成分中含量最高，所以为了能够提取出收率更高、含量更高的左旋紫草素，查阅文献，选择常用的以下不同溶剂对紫草提取物提取的影响，通过计算紫草提取物的收率，方法见2.3.3，以及采用紫外分光光度法测定并计算左旋紫草素的含量，方法见2.3.2.1，对紫草提取物的溶剂系 9 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 统进行筛选，结果见表2-3，具体方法如下: 2.3.4.1 CO超临界萃取 2 紫草药材200g，采用CO超临界萃取，压力:30Mpa;温度:40?;流量:10Kg/升;2 萃取时间:2h，得到提取物，加0.75mol/L氢氧化钠2000ml溶解,滤过,滤液加0.5mol/L硫酸3000ml，放置1周后，有少量沉淀，抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，采用紫外分光光度法测定左旋紫草素的含量。 2.3.4.2 乙醇提取 紫草药材200g，加乙醇2000ml，浸泡24小时，浸泡2次，滤过，滤液合并，50?水浴回收溶剂，残渣加0.75mol/L氢氧化钠1200ml溶解，滤过，滤液加入0.5mol/L硫酸2400ml沉淀，抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，同法测定含量。 2.3.4.3 三氯甲烷提取 紫草药材100g，加1000ml三氯甲烷，浸泡48小时，加0.75mol/L氢氧化钠4000ml萃取3次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸3000ml，放置，沉淀抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，同法测定含量。 2.3.4.4 石油醚提取 紫草药材100g，加500ml石油醚，浸泡24小时，加0.75mol/L氢氧化钠2000ml萃取3次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸3000ml，沉淀抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，同法测定含量。 2.3.5 提取方法的选择 根据常用的提取方法，分别选择了冷浸法、渗漉法和回流法，比较不同方法得到的紫草提取物的收率及有效成分的含量，收率与含量测定的方法同2.3.4，选择出更适合工厂化生产，简单易行的提取方法，结果见表2-4，具体方法如下: 2.3.5.1 冷浸法 取紫草100g，加石油醚800ml，冷浸24小时，加0.75mol/L氢氧化钠800ml萃取1次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸1200ml，沉淀抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，测定含量。 2.3.5.2 回流法 取紫草100g，加石油醚800ml，回流提取3次，每次1小时，提取液合并，冷至室温后，加0.75mol/L氢氧化钠4000ml萃取3次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸6000ml，沉淀抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，测定含量。 2.3.5.3 渗漉法 取紫草100g，加石油醚800ml，冷浸2小时后，加石油醚渗漉，共用石油醚1400ml，石油醚液加0.75mol/L氢氧化钠4000ml萃取3次(2000，1000，1000ml)，分取碱液层， 10 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 放置24小时，加入0.5mol/L硫酸6000ml，沉淀抽滤，水洗至中性，干燥，计算收率，测定含量。 2.3.6 提取工艺条件的正交设计 为了选出紫草有效成分的最佳提取工艺，先对石油醚的浸泡时间、用量和提取次数，以空白试验为对照，采用三因素三水平，进行正交试验考察，因素水平表见2-1，具体方法如下: 表2-1 因素水平表 Table2-1 Level table of factor A B C D 水平 浸泡时间(h) 溶剂量(倍) 提取次数(次) 空白 1 6 4 1 1 2 12 6 2 2 3 24 8 3 3 精密称取紫草粗粉约20g，共9份，按照正交设计表，加入规定量石油醚、浸泡规定时间和次数，滤出冷浸液，分别加入8倍量0.25mol/L氢氧化钠溶液萃取三次，碱液合并，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸，加酸量分别为碱液量的1.5倍，沉淀用布什漏斗过滤，水洗至中性，50?干燥至恒重，称重，计算紫草提取物收率，采用高效液相色谱法测定提取物中左旋紫草素含量，具体方法见2.3.2.2和2.3.3，以左旋紫草素收率作为评价指标。结果见表2-5，方差分析见表2-6。 .7 碱液萃取条件的确定 2.3 为了选出紫草提取物萃取的最佳工艺，对萃取所用氢氧化钠的浓度、用量、萃取次数，以空白试验为对照，采用三因素三水平，进行正交试验考察，因素水平表见表2-2，具体方法如下: 表2-2 因素水平表 Table2-2 Level table of factor A B C D 水平 碱液浓度(mol/L) 碱液用量(倍) 萃取次数(次) 空白 1 0.125 4 1 1 2 0.25 6 2 2 3 0.5 8 3 3 精称紫草粗粉约100g，共9份，分别加入药材8倍量的石油醚、浸泡24小时，滤出冷浸液，加入规定浓度和规定量氢氧化钠溶液，萃取规定次数，碱液合并，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸，加酸量为碱液量的1.5倍，沉淀用布什漏斗抽滤，水洗至中性，50? 11 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 干燥至恒重，称重，计算提取物收率，测定左旋紫草素含量，计算方法与2.3.6相同，以左旋紫草素收率作为评价指标。结果见表2-7，方差分析见表2-8。 2.3.8 碱液置换时间的选择 由于紫草提取物中的左旋紫草素，大部分是其它萘醌在碱液中不稳定脱脂转化而成，因此，碱液需要放置一段时间，让其成分发生转化。为了得到收率及含量较高的紫草有效成分，分别比较了不同的碱液置换时间对紫草提取物的收率及含量的影响，具体方法如下: 称取紫草100g，5份，分别加石油醚800ml，冷浸24小时，滤出冷浸液，加0.25mol/L氢氧化钠800ml萃取1次，取碱液层，分别放置4、8、16、24、48小时后，各加入0.5mol/L硫酸，加酸量分别为碱液量的1.5倍，有沉淀析出，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，计算收率，采用高效液相色谱法测定含量，收率和含量测定方法分别见2.3.3及2.3.2.2，结果见表2-9。 2.3.9 酸沉条件的研究 加入酸液使其有效成分析出，现分别比较不同加酸量对紫草提取物的收率及含量的影响，收率与含量测定方法同2.3.8，具体方法如下: 称取紫草100g，3份，分别加石油醚800ml，冷浸24小时，加0.25mol/L氢氧化钠800ml萃取1次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸，加酸量分别为碱液量的1倍、1.5倍、2倍，析出沉淀，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，同法计算收率，采用高效液相色谱法测定含量。结果见表2-10。 2.3.10 干燥温度的确定 通过查阅文献可知，紫草提取物的干燥温度不宜过高，所以分别采用60?、80?、90?的干燥温度，考察不同干燥温度对紫草提取物的收率及含量的影响，收率与含量测定方法同2.3.8，具体方法如下: 称取紫草100g，3份，分别加石油醚800ml，冷浸24小时，加0.25mol/L氢氧化钠800ml萃取1次，分取碱液层，放置24小时，加入0.5mol/L硫酸1600ml，沉淀抽滤，水洗至中性，分别置于60?、80?、90?干燥，记录干燥的时间，同法计算收率，采用高效液相色谱法测定含量。结果见表2-11。 2.3.11 验证试验 因正交实验所得出的最佳提取工艺，是已经做过的正交试验中没有出现过的。它是否真正符合客观实际，还需要通过中试放大验证试验来进行验证。方法如下:按正交实验所得出的最佳提取工艺，提取三份紫草药材，得到的三批紫草提取物，同法计算收率，并用高效液相色谱法测定其含量，收率与含量测定方法同2.3.8，结果见表2-12。 12 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 2.4 结果与讨论 因为新疆紫草品质最佳，有效成分含量最高，所以本实验采用的药材均为新疆紫草，粒度对总萘醌的提取率均有非常显著影响，粒度较大的提取率高，粒度为0.5cm小段时萃取率最高，而对紫草中左旋紫草素的提取率无显著影响。 2.4.1 紫草提取物溶剂系统的筛选 结果见表2-3，结果表明，CO超临界萃取得到的样品收率虽然最高，但有效成分含2 量低，而且提取得到的粗提物加碱溶解时，溶液粘稠，过滤困难;乙醇提取物同样加碱溶解时，溶液粘稠，过滤困难，提取得到的产品色泽极黑;三氯甲烷萃取时乳化严重;而石油醚提取的样品比乙醇、三氯甲烷提取的样品收率高，提取物中有效成分左旋紫草素的含量最高，石油醚提取的产品色泽也较好。根据更有利于工业化生产，故选择石油醚试剂进行提取。 表2-3 不同溶剂提取紫草提取物的结果比较 Table2-3 Result compare of lithospermi extractive by different solvent extraction 提取溶剂 CO超临界萃取 乙醇 三氯甲烷 石油醚(60~90?) 2 收率(%) 3 0.4133 0.12 0.5863 含量(%) 37.97 35.98 64.88 87.45 2.4.2 提取方法的选择 结果如表2-4所示，冷浸法提取的样品比回流法提取的样品含量高，虽然收率不及回流法，但在工业生产中，冷浸法比回流法要更加简便、易行，更适合工业化生产，渗漉法收率比冷浸法低，故选择用冷浸法进行提取。 表2-4 不同提取得方法结果比较 Table2-4 Result compare of different extraction method 提取方法 冷浸法 回流法 渗漉法 收率(%) 1.9352 2.5769 1.1739 含量(%) 77.61 54.84 79.83 2.4.3 提取工艺条件的正交设计 结果如表2-5和表2-6所示，A、C因素各水平之间没有显著差异，而B因素各水平之间存在显著差异，由于A>A>A，B>B>B，C>C>C，因此提取条件的最佳工艺应312321321 为ABC，即加入8倍量的石油醚，冷浸24小时，提取3次。可是在实际生产中，为了333 能节省溶剂用量，降低成本，提取次数所得的结果又不大受影响，故工厂选择的最佳提取工艺为:加入8倍量的石油醚，冷浸24小时，提取1次。 13 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表2-5 正交试验结果 Table2-5 Result of Orthogonal experiment 试验 A B C D 试验结果 号 时间(h) 溶剂量(倍) 次数(次) 空白 提取物 紫草素 紫草素 收率(%) 含量(%) 收率(%) 1 1 1 1 1 0.1346 72.65 0.0978 2 1 2 2 2 0.4382 77.86 0.3419 3 1 3 3 3 0.6125 71.01 0.4349 4 2 1 2 3 0.1534 78.28 0.1201 5 2 2 3 1 0.3878 73.05 0.2833 6 2 3 1 2 0.2918 95.95 0.28 7 3 1 3 2 0.3759 89.70 0.3372 8 3 2 1 3 0.3272 96.08 0.3144 9 3 3 2 1 0.4641 92.52 0.4294 I 0.8746 0.5551 0.6922 0.8105 9 II 0.6834 0.9396 0.8914 0.9591 G=?Y=2.639 i III 1.081 1.1443 1.0554 0.8694 i=1 2 I 0.7649 0.3081 0.4791 0.6569 2G 2CT= II 0.4670 0.8828 0.7946 0.9199 9 2III 1.1686 1.3094 1.1139 0.7559 RS,,CTR 2.4005 2.5003 2.3876 2.3327 3 S 0.02637 0.05963 0.002207 0.00377 表2-6 方差分析 Table2-6 Analysis of variance 来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性 A 0.02637 2 0.013185 6.9947 B 0.05963 2 0.029815 15.8169 F<0.10 C 0.02207 2 0.011035 5.8541 D 0.00377 2 0.001885 1 F(2,2)=9.0 F(2,2)=19 F(2,2)=99.0 1-0.101-0.051-0.01 2.4.4 碱液萃取条件的确定 结果如表2-7和表2-8所示，C因素各水平之间没有显著差异，A、B因素各水平之间 存在着显著差异，由于A> A> A，B>B>B，C>C>C，因此最佳工艺应为ABC，321321132331 可是在实际生产中，根据有利于工厂化生产和减少污染方面的考虑，减少碱的用量，则选 14 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 择的萃取工艺为:加入8倍量0.25mol/L氢氧化钠，萃取1次。 表2-7 正交试验结果 Table2-7 Result of Orthogonal experiment 试验 A B C D 试验结果 号 碱液浓度 碱液用量 萃取次数 空白 提取物 紫草素 紫草素 (mol/L) (倍) (次) 收率(%) 含量(%) 收率(%) 1 1 1 1 1 0.6839 75.15 0.5180 2 1 2 2 2 0.8585 75.10 0.6447 3 1 3 3 3 1.5108 73.62 1.1123 4 2 1 2 3 0.7397 82.93 0.6134 5 2 2 3 1 1.5725 64.36 1.0121 6 2 3 1 2 1.9352 77.61 1.5019 7 3 1 3 2 0.6331 84.40 0.5343 8 3 2 1 3 1.5022 77.62 1.1660 9 3 3 2 1 1.7309 83.58 1.4484 I 2.275 1.6657 3.1859 2.9785 9 II 3.1274 2.8228 2.7065 2.6809 G=?Y=8.5511 i i=1 III 3.1487 4.0626 2.6587 2.8917 2 I 5.1756 2.7746 10.1499 8.8715 2G 2II 9.7806 7.9682 7.3251 7.1872 CT= 2III 9.9143 16.5047 7.0687 8.3619 9 RR 24.8705 27.2475 24.5437 24.4206 S,,CT 3 S 0.1656 0.9579 0.05663 0.0156 表2-8 方差分析 Table2-8 Analysis of variance 来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性 A 0.1656 2 0.0828 10.62 F<0.10 B 0.9579 2 0.4790 61.41 F<0.05 C 0.05663 2 0.0283 3.628 D 0.0156 2 0.0078 1 F(2,2)=9.0 F(2,2)=19 F(2,2)=99.0 1-0.101-0.051-0.01 2.4.5 碱液置换时间的选择 结果如表2-9所示，放置4小时，提取物的收率和含量都较低，放置8-48h，得到的 样品含量和收率差别不大，但以放置24h得到的样品的含量最高，因此选择碱液放置时间 15 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 为24h。 表2-9 不同置换时间的结果比较 Table2-9 Result compare of different steting time 碱液放置时间(h) 提取物收率(%) 含量(%) 紫草素收率(%) 4 1.5692 2.30 1.1345 8 1.6941 85.62 1.4505 16 1.6998 84.61 1.4382 24 1.6281 88.30 1.4376 48 1.6566 82.33 1.3639 2.4.6 酸沉条件的研究 结果如表2-10所示，加酸量为碱液量的2倍得到的样品的含量和收率均最高，因此选择加酸量为碱液量的2倍。 表2-10 不同加酸量的结果比较 Table2-10 Result compare of different adding sour quantity 加酸量(为碱液量的倍数) 1 1.5 2 收率(%) 1.4215 1.5822 1.7844 含量(%) 84.09 85.38 85.89 2.4.7 干燥温度的确定 结果如表2-11所示，此干燥温度对紫草提取物的含量影响不大，而文献中国药房中记载紫草中的成分在温度高于60?时不稳定，温度应控制在60?以下，但本实验结果与其不同，紫草提取物在90?下，有效成分并没有发生变化。从干燥时间更有利于工厂提高工作效率的方面考虑，选择90?进行干燥。 表2-11 不同干燥温度的结果比较 Table2-11 Result compare of different drying temperature 干燥温度(?) 干燥时间(h) 含量(%) 收率(%) 60 10 89.54 1.7268 80 8 88.98 1.7198 90 6 88.06 1.7021 2.4.8 验证试验 结果如表2-12所示，紫草提取物中左旋紫草素的含量都达到50%，最佳提取工艺稳定可行，与其他工艺相比，操作更加方便，得到的有效成分含量也更高，更加适合工业化生产。最终确定原料紫草提取物的最佳提取生产工艺为:紫草粗粉，加入8倍药材量的石油醚，冷浸24小时，滤出冷浸液，加入8倍药材量0.25mol/L的氢氧化钠，萃取1次，分 16 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 取碱液，放置24小时后，再加入16倍药材量0.5mol/L的硫酸，得沉淀，过滤，沉淀水洗至中性，90?干燥，即得紫草提取物。 表2-12 验证试验的结果 Table2-12 Result of verification test 批号 紫草量(Kg) 溶剂量(Kg) 紫草提取物(g) 收率(%) 含量(%) 071202 30 240 200 0.6667 78.5 071209 30 240 268.2 0.894 70.9 071225 30 240 176.2 0.5872 59.7 17 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第三章 制剂的工艺研究 3.1 材料与仪器 3.1.1 材料 左旋紫草素对照品:购自中国药品生物制品检定所，批号:769-200204 紫草提取物:来源于吉林省中医药科学院，批号:071202，071209，071225 3.1.2 仪器 DG-160分析天平 (北京光学仪器厂) N-2000双通道色谱工作站 (浙江大学智能信息工程研究所) LC-8A高效液相色谱仪 (日本岛津) SPD-6A 可变波长紫外检测器 (日本岛津) KQ-250DB型数控超声波清洗器 (昆山市超生仪器有限公司) DZF-1B型真空干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) 电热恒温水浴锅 (河北省黄骅航天仪器厂) 3.2 实验方法 3.2.1 前列宁拴成型工艺路线 基质 水浴，熔化 过80目筛 熔融基质 紫草提取物 搅匀 铸栓 放冷、打开 栓剂 3.2.2 栓剂基质的选择 紫草提取物以脂溶性成分为主，所以我们选择了脂溶性基质半合成脂肪酸甘油酯为基质，但发现放置数天后，栓剂变硬变脆。为了降低栓剂的硬度，依次选用了甘油与液体石蜡;为了降低栓剂的脆性，又依次选用了羊毛脂和凡士林。分别用紫草提取物1g，半合成脂肪酸甘油酯占60%，其余各占20%，制成栓剂，从色泽、光洁性和完整性三方面，比 18 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 较甘油与液体石蜡，羊毛脂与凡士林中哪个与半合成脂肪酸甘油酯组合效果更好。结果见表3-2。 3.2.3 加药量的摸索试验 理论上疗效的好坏与药量的大小有关，药量大则疗效好。根据药理实验结果，现分别取紫草提取物0.5g、1.0g和2.0g结合上述选出的基质制成栓剂，对加药量进行摸索试验。结果见表3-3。 3.2.4 成型工艺条件的正交设计 经反复试验表明，本栓剂的成型与铸栓温度、基质比例、加药量等因素有关，为选择出最佳成型工艺，采取了正交试验，为确保正交试验的准确性，设计了平行试验。 3.2.4.1 因素水平的确定 如前述工艺研究资料，基质比例以半合成脂肪酸甘油酯为60%，液体石蜡为20%，凡士林为20%较为适宜，同时凡士林不能低于20%，为进一步探讨半合成脂肪酸甘油酯与液体石蜡的比例，在此设计了三个水平，它们是半合成脂肪酸甘油酯、液体石蜡、凡士林分 30%、20%;60%、20%、20%;70%、10%、20%。在工艺研究资料中表明加别为50%、 药量以1.0%左右为宜，不能超过2.0%，为更准确的确定加药量，在此设计了三个水平，它们分别是加药量为0.8%、1.0%、1.2%。在铸栓温度上考虑到温度不宜超过80?，防止温度过高，紫草素成分发生变化，故设计的三个水平分别是80?、60?、40?，以空白试验为对照，因此，因素水平确定如下表3-1。 表3-1 因素水平表 Table3-1 Level table of factor 因素 A 铸栓温度 B 基质比例 C 加药量 D 水平 (?) 半 液 凡 (%) (空白) 1 80 50% 30% 20% 0.8 2 60 60% 20% 20% 1.0 3 40 70% 10% 20% 1.2 表中:半为半合成脂肪酸甘油酯;液为液体石蜡:凡为凡士林 3.2.4.2 样品的制备与测定 4按L9(3)正交试验表精密称取已过80目筛的紫草提取物药粉，加入已于水浴上彻底熔融基质中，搅匀，边搅边倾入涂有脱模剂的栓模中，放冷，打开模型，推出栓剂，即得。将所制得的18份(正交试验9份加上平行实验9份)样品就其外观的完整性、光洁性、色泽的均匀性进行观察并权衡其对成型性的贡献进行评分，0分为差、1分为适中、2分为好。并按中国药典2005年版一部中融变时限的测定方法分别测定18份样品的融变时限，由于融变时限值越小栓剂越好，故在评分时取融变时限的倒数的10倍作为计分方法。 19 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 结果见表3-4，3-5。 3.2.5 验证试验 因正交实验得出的最佳成型工艺，是已经做过的正交试验中没有出现过的。所以需要中试放大，验证最佳成型工艺是否符合实际工业化生产，方法为按正交实验得出的最佳成型工艺，制备三批前列宁拴样品，并用高效液相色谱法测定其含量，测定方法同2.3.3.2，结果见表3-6。 3.3 结果与讨论 本品与目前市场上治疗前列腺炎其他的药品相比，不具毒副作用，采用的栓剂与其他剂型比较，对肝肾功能不会造成损害，纯度高，到达病变部位药物浓度高，用药剂量小，与西药注射剂的剂量水平相当，有效单体含量可达70%，见效快，作用时间更长，疗效更好，具有其它同类药无法比拟的优点，是一种治疗前列腺炎的理想制剂，并且填补了国内五类中药栓剂的空白。 3.3.1 栓剂基质的选择 从表3-2结果表明，以半合成脂肪酸甘油酯含60%、液体石蜡含20%、凡士林含20%为基质较好，因为从色泽、光洁性和完整性来看，都较好，其余的组合三方面都有一方面不好，所以选择半合成脂肪酸甘油酯含60%、液体石蜡含20%、凡士林含20%为基质，同时经实验表明，凡士林用量以20%左右为宜。若含10%则制成的栓剂较脆，若含30%则制成的栓剂较粘。 表3-2栓剂基质的选择 Table3-2 Selection of suppository base 紫草提取物量(g) 基质比例 色泽 光洁性 完整性 半 甘 羊 1.0037 较暗 较差 不好 60% 20% 20% 半 甘 凡 1.0029 较暗 好 好 60% 20% 20% 半 液 羊 1.0034 较好 较差 不好 60% 20% 20% 半 液 凡 1.0001 较好 较好 较好 60% 20% 20% 表中:半指半合成脂肪酸甘油酯，甘指甘油，羊指羊毛脂凡指凡士林 3.3.2 加药量的摸索试验 结果如表3-3所示，加药量最高应在1.0%左右为好，若太高则不易混匀，色泽不好。 20 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表3-3 加药量的摸索试验 Table3-3 Crocidismus experiment of add dosage 紫草提取物量 半合成脂肪酸甘油酯液体石蜡凡士林 色泽 (g) (g) (g) (g) 0.5002 59.7 19.9 19.9 均匀 1.0034 59.4 19.8 19.8 均匀 2.0012 58.8 19.6 19.6 不均匀 3.3.3 成型工艺条件的正交设计 正交试验结果见表3-4，方差分析见表3-5。 表3-4 正交试验结果 Table3-4 Result of orthogonal experiment 试验A B C D 完整光洁色泽均融变综合评分 号 性 性 匀性 时限 1 1 1 1 1 0 0 1 2 3 2 1 2 2 2 0 1 2 0.714 3.714 3 1 3 3 3 0 2 0 0.625 2.625 4 2 1 2 3 1 0 2 2.5 5.5 5 2 2 3 1 2 1 0 1 4 6 2 3 1 2 2 2 1 0.833 5.833 7 3 1 3 2 1 0 0 2 3 8 3 2 1 3 1 1 1 0.833 3.833 9 3 3 2 1 1 2 2 0.714 5.714 I9.339 11.5 12.666 12.714 9 II15.333 11.547 14.928 12.547 =37.219 G=?YIII12.547 14.172 9.625 11.958 i 2I87.2169 132.25 160.4276 161.6458 i=1 2 II235.1009 133.33 222.8452 157.4272 CT =153.9171 200.8452 III157.4272 92.6406 142.9938 6 RS,,CT 3466.428 R 479.745 475.9134 462.0668 8 1.55916 S 5.9979 4.7207 0.105167 7 21 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表3-5 方差分析表 Table3-5 Analysis of variance 方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 A 5.9979 2 2.99895 57.04161 B 1.559158 2 0.779579 14.828 C 4.720682 2 2.30341 44.89493 误差 0.105149 2 0.0525745 1 F(2,2)=9.0 F(2,2)=19 F(2,2)=99.0 1-0.101-0.051-0.01 根据方差分析结果可以看出，A、B、C因素各水平之间都存在显著差异，由于A>A>A，B>B>B，C>C>C，因此最佳工艺应为ABC，即成型最佳工艺为:以半231321213232 合成脂肪酸甘油酯70%、液体石蜡10%、凡士林20%为基质，加药量为1.0%，铸栓温度为60?为宜。 3.3.4 验证试验 结果如表3-6所示，前列宁拴中左旋紫草素的含量都不少于0.5%，成品率也达到99%以上，达到了工艺要求，所以这个最佳的成型工艺稳定可行，适合工业化生产。 表3-6 验证试验的结果 Table3-6 Result of verification test 批号 紫草提取物取量理论成品量 成品数 成品率 含量 (g) (支) (支) (%) (%) 080515 80.0025 10000 9992 99.92 0.6484 080530 80.0036 10000 9995 99.95 0.7358 080522 80.0014 10000 9991 99.91 0.7216 22 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第四章 原料及制剂的质量标准研究 4.1 实验材料 左旋紫草素对照品:购自中国药品生物制品检定所，批号:769-200204 原料:紫草提取物，来源于吉林省中医药科学院，批号:071202，071209，071225，080304，080306，080308，080310，080312，080314，080314，080316，080320，080325 制剂:前列宁拴，来源于吉林省中医药科学院，批号:080515，080530，080522，080701，080702，080703，080704，080705，080706，080707，080708，080709，080710 新疆紫草药材:长春同仁堂、长春北草堂、吉琛药店 4.2 仪器与试剂 4.2.1 仪器 KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) LC-8A高效液相色谱仪(日本岛津) SPD-6A 可变波长紫外检测器(日本岛津) DZF-1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂) 箱式电阻炉SX2-4-10(上海跃进医疗器械厂) 电热恒温水浴锅(河北省黄骅航天仪器厂) DG-160分析天平(北京光学仪器厂) 美国 Water公司高效液相色谱仪 Sedex型蒸发光散射检测器 ZB-1C智能崩解仪(天津大学精密仪器厂) 日本shimadzu Uv,265FW紫外分光光度计 日本shimadzu 2201紫外分光光度计 4.2.2 试剂 甲苯，醋酸乙酯，甲酸，乙醇(无水)，硫酸，硝酸 ，盐酸，醋酸，氨试液，乙醚， 酚酞指示液，无砷氢氧化钙，三氯甲烷，甲醇(色谱纯)，蒸馏水，冰醋酸。 4.3 实验方法 4.3.1 理化性质 从样品的性状、干燥失重、炽灼残渣、重金属、砷盐、有机溶剂残留量，重量差异，融变时限，微生物限度，薄层鉴别的方面进行了研究。 4.3.1.1 性状 原料为紫红色粉末，味特异，微苦。溶于乙醚、乙醇等有机溶剂和稀碱液，在水中几 23 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 乎不溶。制剂为栓剂，呈紫红色。 4.3.1.2 干燥失重 原料按中国药典(2005年版一部附录IXG)项下干燥失重测定法，取三批样品于50?减压干燥至恒重，测定并计算干燥失重，结果见表4-1。 干燥失重(%)=(干燥前重-干燥后重)/样品干燥前重×100% 4.3.1.3 炽灼残渣 原料按中国药典(2005年版一部附录IXJ)项下炽灼残渣检查法，取三批样品测定，结果见表4-2。 炽灼残渣(%)=炽灼后重/炽灼前重×100% 4.3.1.4 有机溶剂残留量 原料按照中国药典(2005年版二部附录?P)和气相色谱法(中国药典2005年版二部附录VIE)测定，因原料在提取中使用的有机溶剂只有石油醚，因此，有机溶剂残留量只检测石油醚。取九批样品测定，石油醚残留量见表4-3。为了证明测定的石油醚残留量的准确性，又进行了精密度试验。具体方法如下: ? 色谱条件与系统适用性试验 HP-5弹性石英毛细管柱，30m×0.53mmI.D×1.0μm膜厚， 保留5分钟，以每分钟20?程序升温至260?。理论板数以石油醚峰计算应大柱温:50? 于3000。 ? 标准溶液的制备 精密量取石油醚4.7μl，置20.0ml顶空瓶中，加5mol/L氢氧化钠10.0ml，密封，混匀，即得。 ? 供试品溶液的制备 精密称取本品约0.5g，置20.0ml顶空瓶中，加5mol/L氢氧化钠溶液10.0ml，密封，混匀，即得。 ? 测定法 将制备好的标准溶液和供试品溶液瓶在60?恒温水浴中加热60分钟，用注射器抽取顶空气体60.0μl，进样，重复进样3次，计算，即得。 ? 精密度试验 取同一供试品连续测定五次，测得精密度结果见表4-4。 4.3.1.5 重金属 原料及制剂的重金属检查均按中国药典(2005年版一部附录IXE)重金属检查法项下第二法，各对三批样品进行实验。结果见表4-5，4-6。 4.3.1.6 砷盐 原料及制剂的砷盐检查均按中国药典(2005年版一部附录IXF)第一法，各对三批样品进行实验。结果见表4-7，4-8，见附图4-1，4-2。 4.3.1.7 重量差异 制剂根据药典栓剂(中国药典2005年版一部附录IW)项下规定，测定三批样品，结果见表4-9。 4.3.1.8 融变时限 24 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 制剂按中国药典(2005年版一部附录X?B)项下要求测定三批样品，结果见表4-10。 4.3.1.9 微生物限度 制剂按中国药典(2005年版一部附录XIIIC)项下规定检查三批样品。 4.3.1.10 薄层色谱鉴别 以简单、易行为要求，选择薄层色谱条件如下: ? 展开剂的选择 甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5:1:0.1)为展开剂 ? 对照品溶液的制备 取左旋紫草素对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。 ? 供试品溶液的制备 取紫草提取物，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为原料的供试品溶液。取前列宁拴1粒，置于离心管中，加入乙醇10ml，50?水浴加热溶解，自然冷却，离心，滤过，置10ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，作为制剂的供试品溶液。 ? 鉴别左旋紫草素的方法 照薄层层析法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯,醋酸乙酯,甲酸(5:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，观察是否在与对照品相应的位置上出现相同颜色的斑点。结果见附图4-3，4-4。 4.3.2 左旋紫草素的含量测定 样品含量测定方法在建立时应考虑主要的定量分析方法认证的分析参数，如线性范围、精密度、稳定性，准确度等。精密度是指用该方法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度，通常以重复测定次数(n?5)的测定值的相对标准差(RSD)来表示，不能超过2%，准确度是指测得结果与真实值接近的程度，由于“真实值”无法准确知道，通常采用加样回收率试验来表示，其结果越接近100%表明分析方法准确度越高，但实际上往往达不到100%，只要每次测得的回收率稳定在某一水平上(甚至50%以上)时也可采用，回收率的RSD一般应为2%以内，线性度是在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力，目前广泛采用的表示方法是用标准曲线的相关系数(r)，要求控制r?0.9990。现考察采用高效液相色谱法对原料及制剂中左旋紫草素含量测定的方法如下，含量测定计算方法见2.3.2.2。 4.3.2.1 色谱条件的选择 我们曾经选择多种流动相系统，通过多次试验，选择氯仿-甲醇-水-冰醋酸(8:50:36:6)为流动相，分离度好，保留时间适中。用十八烷基键合硅胶为填充剂;检测波长为270nm;理论板数按左旋紫草素峰计算应不低于1700。 4.3.2.2 线性关系的考察 对照品溶液的制备及标准曲线的制备方法见2.3.2.2。 4.3.2.3 供试品溶液的制备 25 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 原料的供试品溶液的制备方法见2.3.2.2。 制剂的供试品溶液的制备方法:取本品前列宁拴10粒，研碎，混合均匀，取约0.9g，精密称定，置50ml量瓶中，加入乙醇40ml，50?水浴加热溶解，室温冷却，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。 4.3.2.4 稳定性试验 分别吸取原料及制剂的供试品溶液的续滤液10μl，在24h内，间隔30min测定一次，各测定6次，观察峰面积随时间变化的情况。结果见表4-12，4-13。 4.3.2.5 精密度试验 分别吸取原料及制剂的供试品溶液的续滤液10μl，连续测定6次，观察峰面积变化的情况，结果见表4-14，4-15。 4.3.2.6 重复性实验 分别取同一批号的原料与制剂样品，同法各制备5份供试品溶液，分别按高效液相色谱法测定含量，结果见表4-16，4-17。 4.3.4.6 回收率试验 精密称取(批号为071202)样品5.5mg，5份，置于50ml量瓶中，分别加入左旋紫草素对照品4.5mg，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得原料的供试品溶液。取(批号为080515)前列宁拴1粒，5份，分别置50ml量瓶中，分别加入精密称定的左旋紫草素对照品5.0mg，加乙醇40ml，50?水浴加热溶解，自然冷却，加乙醇稀释至刻度，摇匀。即得制剂的供试品溶液。分别取其续滤液5ul进样测定，测得回收率结果见表4-18，4-19。 回收率(%)=(测得量-样品含量)/加入对照品量×100% 4.3.4.7 样品测定及含量限度 用高效液相色谱法对十批原料样品及三批制剂样品进行左旋紫草素的含量测定，并制定原料及制剂中左旋紫草素的含量限度。结果见表4-20，4-21色谱图见附图4-5，4-6。 4.3.3 羟基萘醌总色素的含量测定 因左旋紫草素属于羟基萘醌总色素这类成分中的一个有效成分，且所占的含量最高，为了深入研究左旋紫草素含量的最大限度，现对羟基萘醌总色素的含量进行测定，因羟基萘醌总色素不是单一成分，不能使用高效液相色谱法，所以现使用紫外分光光度法对羟基萘醌总色素的含量进行测定，含量测定计算方法见2.3.2.1，并考察此测定方法是否可行，从而制定出原料及制剂中左旋紫草素含量的最大限度。方法如下: 1%4.3.3.1 的测定 E1cm 精密称取左旋紫草素5.1mg，置于50ml容量瓶中，加无水乙醇超声溶解，并稀释至刻度，此溶液为原溶液。分别精密量取原溶液2.5ml，1.3ml，各置于10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，用日本shimadzuUv,265FW仪器，分别在516nm测定吸光度，并 26 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 1%分别计算。再各自精密量取原溶液2.5ml，1.25ml，各置于10ml容量瓶中，加无水乙E1cm 1%醇稀释至刻度，改用日本shimadzu 2201仪器测定吸光度，再分别计算。从而得到更E1cm 1%加准确的，选择更准确的测量仪器。 E1cm 4.3.3.2 线性关系的考察 对照品溶液的制备及标准曲线的制备方法见2.3.2.1。 4.3.3.3 供试品溶液的制备 原料供试品溶液的制备方法同2.3.2.1。 制剂供试品溶液的制备方法:取同一批号的前列宁拴50粒，研碎，混合均匀，取约0.45g，置250ml量瓶中，加入乙醇200ml，50?水浴加热溶解，室温冷却，加乙醇稀释至刻度，摇匀即得。 4.3.3.4 精密度试验 取原料及制剂的供试品溶液，分别测定吸光度，各连续测定6次，观察吸光度的变化，结果见表4-23，4-24。 4.3.3.5 稳定性试验 取原料及制剂的供试品溶液，间隔30min测定一次，各连续测定6次，观察吸光度随 4-26。 时间的变化，结果见表4-25， 4.3.3.6 重复性试验 取同一批原料及制剂各制备5份供试品溶液，分别测定吸光度，计算含量，结果见表4-27，4-28。 4.3.3.7 回收率试验 精密称取(批号为080304)样品1.25mg，5份，置100ml量瓶中，分别加入左旋紫草素对照品1.20mg，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得原料的供试品溶液。 取(批号为080701)前列宁拴50粒，研碎，混合均匀，取约0.2g，精密称定5份，置250ml量瓶中，分别加入左旋紫草素对照品2.0mg，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得制剂的供试品溶液。分别测定吸光度，计算回收率，计算方法见4.3.4.6，结果见表4-29，4-30。 4.3.3.8 样品测定及含量幅度 十批原料及制剂样品采用紫外分光光度法进行含量测定，并制定出原料及制剂中左旋紫草素含量的最大幅度。结果见表4-31，4-32。 4.3.4 紫草药材样品测定及含量限度 不同紫草药材中，萘醌含量相差很大，在选择原料药材时，应对紫草药材进行质量控制。因为紫草提取物中的紫草素，大部分是提取过程中，由其它萘醌转化而成，因此，不能采用高效液相色谱法直接测定紫草药材中的紫草素，而是应该使用紫外分光光度法测定紫草药材中总萘醌的含量，这样对于紫草提取物的提取更具有意义。 27 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 4.3.4.1 对照品溶液的制备 方法见2.3.2.2。 4.3.4.2 供试品溶液的制备及测定 精密称取三批紫草药材，各0.5g，分别置脂肪提取器中，加入60ml乙醚，回流提取至近无色，乙醚液用0.25mol/L氢氧化钠萃取3次，每次20ml，碱液合并，加0.5mol/L硫酸30ml，摇匀，加乙醚萃取8次，每次40ml，乙醚液合并，水浴回收乙醚，残渣加乙醇溶解，置于100ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，用高效液相色谱法测定药材含量，结果见表4-33，色谱图见附图4-9。 4.4 结果与讨论 4.4.1 干燥失重 结果如表4-1所示，三批原料样品的干燥失重均不超过1.0%，符合药典规定。 表4-1 紫草提取物干燥失重测定 Table4-1 Loss on drying determination of lithospermi extractive 批号 干燥前重(g) 干燥后重(g) 干燥失重(%) 071202 1.0040 1.0008 0.319 071209 1.0431 1.0405 0.249 071225 1.0082 1.0001 0.803 4.4.2 炽灼残渣 结果如表4-2所示，三批原料样品的炽灼残渣均不超过1.0%，符合药典规定，杂质很少。 表4-2 紫草提取物炽灼残渣测定 Table4-2 Ignited residue determination of lithospermi extractive 批号 炽灼前重(g) 炽灼后重(g) 炽灼残渣(%) 071202 1.0254 0.0056 0.55 071209 1.0362 0.0072 0.69 071225 1.0028 0.0064 0.64 4.4.3 有机溶剂残留量 结果如表4-3及表4-4所示，紫草提取物中石油醚残留量暂定为不得过0.035%。 表4-3 紫草提取物中石油醚残留量 Table4-3 Ligroin residual volume in lithospermi extractive 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 含量(%)0.0032 0.0291 0.0084 0.0032 0.0186 0.0176 0.0028 0.0171 0.0040 28 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表4-4 紫草提取物石油醚残留量精密度测定结果 Table4-4 The results of precision experiment to ligroin residual volume of lithospermi extractive 序号 1 2 3 4 5 峰面积 428854 394024 405141 407409 400142 统计 平均值=407114 RSD=2.899% 4.4.4 重金属 结果如表4-5，4-6所示，三批原料及制剂样品的重金属含量均未过10PPM，符合规 定，本品毒性小。 表4-5 紫草提取物重金属的检查 Table4-5 Heavy metal examination of lithospermi extractive 样品批号 重金属 071202 <10PPM 071209 <10PPM 071225 <10PPM 表4-6 前列宁栓重金属的检查 Table4-6 Heavy metal examination of Qianliening suppository 样品批号 重金属 080515 <10PPM 080530 <10PPM 080522 <10PPM 4.4.5 砷盐 结果如表4-7，4-8所示，三批原料及制剂样品含砷盐均未过2PPM，符合规定。 表4-7 紫草提取物砷盐检查 Table4-7 Arsenic salt examination of lithospermi extractive 样品批号 砷盐 071202 <2PPM 071209 <2PPM 071225 <2PPM 表4-8 前列宁栓砷盐检查 Table4-8 Arsenic salt examination of Qianliening suppository 样品批号 砷盐 080515 <2PPM 080530 <2PPM 080522 <2PPM 29 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 4.4.6 重量差异 结果如表4-9所示，前列宁栓重量差异符合中国药典(2005年版一部)栓剂项下规定，每支栓剂重量差异均符合规定。 表4-9 前列宁栓重量差异测定 Table4-9 Weight variation examination of Qianliening suppository 批号 取量(支) 重量差异(%) 超限度数量(支) 080515 10 符合规定 0 080530 10 符合规定 0 080522 10 符合规定 0 4.4.7 融变时限 结果如表4-10所示，前列宁栓融变时限均在30min之内融变，符合中国药典(2005年版)融变时限检查法项下的规定。 表4-10 前列宁栓融变时限测定 Table4-10 Determination of melt to change time limit of Qianliening suppository 批号 080515 080530 080522 样品 融变时限(min) 样1 18 18 17 样2 20 21 20 样3 18 18 19 4.4.8 微生物限度 三批前列宁拴样品符合中国药典(2005年版一部)附录XIIIC微生物限度检查栓剂项下的规定。 4.4.9 薄层色谱鉴别 如附图4-3及4-4所示，原料及制剂的供试品溶液在与对照品相对应的位置上，均显出相同的紫红色斑点，在阴性试验中，没有斑点，结果表明样品中含有对照品左旋紫草素，此鉴别条件可纳入质量标准，操作方便可行。 4.4.10 左旋紫草素的含量测定 4.4.10.1 线性关系的考察 结果如表4-11所示，可得到回归方程:Y=23426.7692X-2654.72，相关系数r=0.9999，在0.26—1.30μg之间，样品量与峰面积呈良好的线性关系。 30 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表4-11 左旋紫草素对照品量与峰面积对应关系 Table4-11 Corresponding relationship between control article quantity of L- alkannin and peak area 样品量 1μl 2μl 3μl 4μl 5μl (0.26μg) (0.52μg) (0.78μg) (1.04μg) (1.30μg) 峰面积 3597.5 9430 15387 21818 27858.3 4.4.10.2 稳定性试验 结果如表4-12，4-13所示，原料及制剂在24h内测定的峰面积均基本稳定，变异系数RSD均小于2%，说明此方法稳定性高。 表4-12 紫草提取物稳定性测定结果 Table4-12 Results of stability experiment of lithospermi extractive 序号 1 2 3 4 5 6 峰面积 20922 21281 20612 21352 21015 20850 统计 平均值=21005 RSD=1.316% 表4-13 前列宁栓稳定性测定结果 Table4-13 Results of stability mensuration of QianLieNing Suppository 序号 1 2 3 4 5 6 峰面积 22465 22176 22272 22814 22652 22735 统计 平均值=22519 RSD=1.146% 4.4.10.3 精密度试验 精密度结果如表4-14，4-15所示，连续测定的峰面积基本不变，相对标准偏差RSD均小于2%，表明该方法的精密度好。 表4-14 紫草提取物精密度测定结果 Table4-14 Results of precision experiment of lithospermi extractive 序号 1 2 3 4 5 6 峰面积 20820 20484 20542 21022 21288 21460 统计 平均值=20936 RSD=1.885% 表4-15 前列宁栓精密度测定结果 Table4-15 Results of precision mensuration of QianLieNing Suppository 序号 1 2 3 4 5 6 峰面积 22661 22095 22185 22908 22320 22599 统计 平均值=22461.3 RSD=1.392% 4.4.10.4 重复性试验 结果如表4-16，4-17所示，测得原料及制剂中左旋紫草素的含量的平均值分别为78.7%、5.5mg/粒，相对标准偏差RSD分别为1.498%、2.741%(n=5)，均小于3%，表明该方法的重复性好。 31 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表4-16 紫草提取物重复性试验结果 Table4-16 Results of repetitiveness experiment of lithospermi extractive 样品 1 2 3 4 5 含量(%) 78.5 77.5 77.8 79.6 80.2 统计 平均值=78.7% RSD=1.498% 表4-17 前列宁栓重复性测定结果 Table4-17 Results of repetitiveness mensuration of QianLieNing Suppository 样品 1 2 3 4 5 含量(mg/粒) 5.3 5.6 5.5 5.7 5.3 统计分析 平均值=5.5mg/粒 RSD=2.741% 4.4.10.5 回收率试验 结果如表4-18，4-19所示，测得原料及制剂中左旋紫草素的回收率的平均值分别为100.98%、99.23%，相对标准偏差RSD分别为2.243%，2.173%(n=5)，均小于3%，表明该方法测得的有效成分含量可靠。 表4-18 紫草提取物回收率测定结果 Table4-18 Results of recovery rate determination of lithospermi extractive 样品 样品含量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 1 3.9 4.4 8.27 99.32 2 4.3 4.8 9.23 102.71 3 4.3 5.0 9.36 101.2 4 4.3 4.3 8.57 99.30 5 4.4 4.2 8.7 102.38 统计分析 平均值=100.98% RSD=2.243% 表4-19 前列宁栓回收率测定结果 Table4-19 Results of recovery rate mensuration of QianLieNing Suppository 样品 样品含量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 1 5.54 5.7 11.42 103.16 2 5.47 5.0 10.42 99 3 5.52 5.3 10.59 95.66 4 5.51 4.9 10.35 98.78 5 5.39 4.6 9.97 99.57 统计分析 平均值=99.23% RSD=2.173% 4.4.10.6 样品测定及含量幅度 结果如表4-20，4-21所示，原料中左旋紫草素含量均在60.0-80.0%之间，故原料的含量幅度暂定为含左旋紫草素为60.0-80.0%。三批前列宁拴样品含量均在4.5mg/粒以上，故 32 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 制剂的含量限度暂定为含紫草提取物以左旋紫草素计，每粒不得少于4.5mg。 表4-20 紫草提取物含量测定结果 Table4-20 The results of of the content determination of lithospermi extractive 批号 含 量(%) 080304 68.63 080306 67.70 080308 68.09 080310 69.90 080312 73.78 080314 66.84 080314 72.96 080316 71.61 080320 76.04 080325 63.91 表4-21 前列宁拴含量测定结果 Table4-21 Results of of the content determination of of QianLieNing Suppository 批号 左旋紫草素含量(mg/粒) 080515 5.3 080530 6.1 080522 6.0 因紫草提取物进行高效液相色谱法(紫外检测器)测定时，高效液相色谱图仅显示一个峰，而薄层鉴别时，TLC照片中有2个斑点。为探讨原因，我们采用美国Water公司高效液相色谱仪，Sedex型蒸发光散射检测器，diamondialC色谱柱，甲醇为流动相，对左18 旋紫草素对照品和紫草提取物又进行测定，结果表明使用蒸发光散射检测器等通用型检测器时，紫草提取物显示两个峰，可以检测出来。而紫草提取物使用紫外检测器进行高效液相色谱法测定时，HPLC图谱仅显示一个峰的原因可能是紫草提取物中有的成分没有紫外吸收，所以在紫外检测器中检测不到，而因该成分的检测与否，不影响产品的质量，所以制定质量标准含量测定时，仍可使用紫外检测器进行液相色谱测定。采用美国Water公司高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器测定的左旋紫草素对照品和紫草提取物色谱图见附图4-7，4-8。 4.4.11 羟基萘醌总色素的含量测定 1%4.4.11.1 的测定 E1cm 1%结果表明:使用日本shimadzu Uv,265 FW测定，应以240计算;使用日本shimadzu E1cm 1%1%2201测定，应以242计算。以下实验均采用日本shimadzu 2201测定，以242计算。 EE1cm1cm 33 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 4.4.11.2 线性关系的考察 由表4-22所示，可得回归方程:Y=235.366C+0.01607，相关系数r=0.9998，在 1%0.513—3.078mg/100ml之间，样品浓度与吸光度呈良好的线性关系。根据测定结果，E1cm 1%实验的计算按为242计算。 E1cm 表4-22 左旋紫草素样品浓度与吸光度对应关系 Table4-22 Corresponding relationship between density of L- alkannin sample and optical density -3样品浓度(×10g/100ml) 0.513 1.026 1.539 2.052 2.565 3.078 吸光度 0.140 0.260 0.372 0.497 0.617 0.746 4.4.11.3 精密度试验 精密度结果如表4-23，4-24所示，原料及制剂样品测定的吸光度均基本不变，相对标准偏差RSD均小于2%，表明该方法的精密度很好。 表4-23 紫草提取物精密度测定结果 Table4-23 Results of precision mensuration of lithospermi extractive 序号 1 2 3 4 5 6 吸光度 0.601 0.600 0.597 0.596 0.597 0.599 统计 平均值=0.5983 RSD=0.32% 表4-24 前列宁拴精密度测定结果 Table4-24 Results of precision mensuration of QianLieNing Suppository 序号 1 2 3 4 5 6 吸光度 0.433 0.437 0.435 0.438 0.434 0.441 统计 平均值=0.436 RSD=0.68% 4.4.11.4 稳定性试验 稳定性结果如表4-25，4-26所示，原料及制剂在实验期间内测得的吸光度基本稳定，变异系数RSD均小于2%，说明此方法稳定性较好。 表4-25 紫草提取物稳定性测定结果 Table4-25 Results of atability mensuration of lithospermi extractive 序号 1 2 3 4 5 6 吸光度 0.598 0.601 0.587 0.598 0.592 0.589 统计 平均值=0.594 RSD=0.95% 表4-26 前列宁拴稳定性测定结果 Table4-26 Results of atability mensuration of QianLieNing Suppository 序号 1 2 3 4 5 6 吸光度 0.438 0.434 0.433 0.433 0.431 0.435 统计 平均值=0.434 RSD=0.55% 4.4.11.5 重复性试验 34 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 由表4-27，4-28可知，测得原料及制剂中左旋紫草素含量的平均值分别为87.66%、7.81mg/粒，相对标准偏差RSD均小于2%，表明该方法的重现性好。 表4-27 紫草提取物重复性试验结果 Table4-27 Results of repetitiveness mensuration of lithospermi extractive 样品 1 2 3 4 5 含量(%) 85.86 88.55 87.72 88.27 87.90 统计 平均值=87.66% RSD=1.21% 表4-28 前列宁拴重复性试验结果 Table4-28 Results of repetitiveness mensuration of QianLieNing Suppository 样品 1 2 3 4 5 含量(mg/粒) 7.81 7.94 7.76 7.70 7.77 统计 平均值=7.81mg/粒 RSD=1.15% 4.4.11.6 回收率试验 回收率测定结果如表4-29，4-30所示，测得原料及制剂中左旋紫草素回收率的平均值分别为100.2%、101.2%，相对标准偏差RSD均小于2%，表明该方法测得的有效成分含量可靠。 表4-29 紫草提取物回收率测定结果 Table4-29 Results of recovery rate mensuration of lithospermi extractive 样品 样品含量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均值(%) RSD(%) 1 1.21 1.23 2.44 100.0 2 1.20 1.25 2.43 98.4 3 1.22 1.24 2.48 101.6 100.2 1.19 4 1.16 1.24 2.41 100.8 5 1.17 1.24 2.41 100.0 表4-30 前列宁拴回收率测定结果 Table4-30 Results of recovery rate mensuration of QianLieNing Suppository 样品 样品含量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均值(%) RSD(%) 1 1.91 1.96 3.95 104.1 2 2.00 1.94 3.92 99.0 3 1.86 1.99 3.88 101.5 101.2 1.84 4 1.94 1.97 3.92 100.5 5 1.98 1.92 3.92 101.0 4.4.11.7 样品测定及含量幅度 结果如表4-31，4-32所示，紫草提取物中羟基萘醌总色素含量均在80.0-100.0%之间，故原料的含量幅度暂定为含羟基萘醌总色素以左旋紫草素计为80.0-100.0%。所测十批前列宁拴样品含量均在5.0-7.5mg/粒之间，故制剂的含量幅度暂定为含紫草提取物以左旋紫 35 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 草素计，每粒应为5.0-7.5mg。 表4-31 紫草提取物样品含量测定结果 Table4-31 Results of of the content determination of lithospermi extractive 批号 含量(%) 080304 87.66 080306 85.45 080308 86.43 080310 86.16 080312 92.75 080314 82.05 080314 90.88 080316 90.85 080320 94.70 080325 80.50 表4-32 前列宁拴样品含量测定结果 Table4-32 Results of of the content determination of QianLieNing Suppository 批号 含量(mg/粒) 080701 6.83 080702 6.90 080703 6.80 080704 5.37 080705 5.12 080706 7.04 080707 7.02 080708 6.38 080709 6.74 080710 6.20 4.4.12 紫草药材样品测定及含量限度 制备供试品溶液时，比较了乙醇提取和乙醚提取的样品中左旋紫草素的含量，结果乙 醚提取得到的样品左旋紫草素的含量比较高，所以选择用先乙醚提取药材。 三批紫草药材样品含量测定结果如表4-33所示，因中国药典2005年版一部紫草标准 中，含量测定限度规定为含萘醌以左旋紫草素(CHO)计不得少于0.8%，故本品的含量16165 限度暂定为含左旋紫草素(CHO)不得少于0.4%。色谱图见附图4-9。 16165 36 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表4-33 紫草样品含量测定结果 Table4-33 The results of of the content determination of the samples 药材来源 含量(%) 长春同仁堂 1.192 长春北草堂 0.194 吉琛药店 1.121 37 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第五章 稳定性试验 5.1 实验材料 紫草提取物，批号;080906、080910、080917，由吉林省中医药科学院提供。 前列宁栓，批号;081107、081109、081110，由吉林省中医药科学院提供。 5.2 仪器与试剂 5.2.1 仪器 KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) LC-8A高效液相色谱仪(日本岛津) SPD-6A 可变波长紫外检测器(日本岛津) DZF-1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂) 电热恒温水浴锅(河北省黄骅航天仪器厂) DG-160分析天平(北京光学仪器厂) ZB-1C智能崩解仪(天津大学精密仪器厂) 2.2 试剂 5. 乙醇(无水)，甲醇(色普纯)，蒸馏水，甲苯，醋酸乙酯，甲酸，三氯甲烷，冰醋酸，其它试剂均为分析纯。 5.3 实验方法 为了考察原料及制剂的质量是否稳定，分别对原料进行了初步、加速稳定性试验及影响因素试验，因为在高温的条件下，该拴剂易溶化，故栓剂只进行初步稳定性试验。 5.3.1 紫草提取物初步稳定性试验 取三批紫草提取物，分别用塑料瓶包装，5g/瓶，室温留样考察，考察时间为3个月，当月考察一次，以后每月考察一次，连续考察三个月，0、1、2、3月，考察项目:性状、鉴别、干燥失重、炽灼残渣、含量测定、微生物限度检查。方法同原料的质量标准研究。结果见表5-1、5-2、5-3。 5.3.2 紫草提取物稳定性加速试验 取三批紫草提取物，分别用塑料瓶包装，5g/瓶，置于恒湿密闭容器中，在温度为40??2?，相对湿度为75%?5%的条件下，留样考察，考察时间为6个月，当月考察一次，以后三个月每月考察一次，第六个月考察一次，0、1、2、3、6月，考察项目:性状、鉴别、干燥失重、炽灼残渣、含量测定、微生物限度检查。方法同原料的质量标准研究。结 38 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 果见表5-4、5-5、5-6。 5.3.3 紫草提取物影响因素试验 取批号080910的紫草提取物为供试品，按照中国药典2005年版二部附录XIXC的影响因素试验进行考察。将供试品置于培养皿中，摊成?5mm厚的薄层，进行以下实验。结果见表5-7。 5.3.3.1 高温试验 供试品开口置密封层析缸中，60?温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按原料稳定性考察项目进行检测。 5.3.3.2 高湿度试验 供试品开口置恒湿密闭容器中，在25?于相对湿度90%?5%条件下放置10天，于第5天和第10天取样，同法进行检测。 5.3.3.3 强光照射试验 供试品开口放在装有日光灯的光照箱内,于4500lx?500lx的条件下放置10天, 于第5天和第10天取样，同法进行检测。 5.3.4 前列宁栓初步稳定性试验 取三批前列宁拴，分别用聚氯乙烯片材包装，0.90g/粒，室温留样考察，考察时间为3个月，当月考察一次，以后每月考察一次，连续考察三个月，0、1、2、3月，考察项目为性状、鉴别、含量测定、重量差异、融变时限，微生物限度检查。考察方法同制剂的质量标准研究。结果见表5-8、5-9、5-10。 5.4 结果与讨论 虽然原料是色素类成分，但将其在棕色瓶中保存，经考察并不易发生变质，本品极易保存。这与其他文献中记载此类药的结果相比，稳定性更好。 5.4.1 紫草提取物初步稳定性试验 按新药(中药)稳定性实验要求，原料经室温留样观察，连续观察0—3个月，结果如表5-1、5-2、5-3所示，三批紫草提取物干燥失重及炽灼残渣均不超过1.0%，左旋紫草素含量均不少于50%，卫生学检查细菌及霉菌均少于10个/g，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌均为检出，表明原料的初步稳定性符合规定，可在常温下干燥保存，质量不发生改变。 39 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-1 紫草提取物初步稳定性试验报告 Table5-1 Rudiment stability test report of lithospermi extractiveive 样品名称:紫草提取物 批号:080906 生产日期:08.09.06 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 项目 本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉性 状 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 干燥失重 0.97% 0.55% 0.62% 0.35% 查 项 炽灼残渣 0.64% 0.35% 0.27% 0.39% 目 含量测定 74.3% 74.0% 72.6% 74.3% 细菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 卫 霉菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 生 学金黄色葡萄未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢未检出 未检出 未检出 未检出 菌 40 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-2 紫草提取物初步稳定性试验报告 Table5-2 Rudiment stability test report of lithospermi extractiveive 样品名称:紫草提取物 批号:080910 生产日期:08.09.10 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 项目 本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉性 状 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 干燥失重 0.25% 0.61% 0.42% 0.52% 查 项 炽灼残渣 0.95% 0.64% 0.89% 0.81% 目 含量测定 81.2% 82.4% 81.1% 81.9% 细菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 卫 霉菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 生 学金黄色葡未检出 未检出 未检出 未检出 检萄球菌 查 铜绿假单未检出 未检出 未检出 未检出 孢菌 41 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-3 紫草提取物初步稳定性试验报告 Table5-3 Rudiment stability test report of lithospermi extractiveive 样品名称:紫草提取物 批号:080917 生产日期:080917 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 项目 本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉本品为紫红色粉性 状 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 未;味特异，味苦 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 干燥失重 0.80% 0.64% 0.35% 0.53% 查 项 炽灼残渣 0.64% 0.73% 0.23% 0.37% 目 含量测定 80.4% 79.4% 79.1% 80.7% 细菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 卫 霉菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 生 学金黄色葡萄未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢未检出 未检出 未检出 未检出 菌 42 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 5.4.2 紫草提取物稳定性加速试验 按新药(中药)稳定性实验要求，原料经加速试验观察，连续观察0—6个月，结果如表5-4、5-5、5-6所示，结果与原料初步稳定性试验结果相同，原料加速稳定性符合规定，表明紫草提取物在温度为40??2?，相对湿度为75%?5%的条件下保存，质量不发生改变，原料可在此条件下干燥保存。 表5-4 紫草提取物稳定性加速试验报告 Table5-4 Accelerated stability test report of lithospermi extractive 样品名称:紫草提取物 批号:080906 生产日期:08.09.06 放置 时间 0月 1月 2月 3月 6月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 09.3.23 项目 本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色 性 状 粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异， 味苦 味苦 味苦 味苦 味苦 检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草鉴 别 素 素 素 素 素 干燥失重 5.8% 5.7% 4.8% 5.0% 5.0% 检查 项目 炽灼残渣 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 含量测定 0.38mg/ g 0.38 mg/ g 0.38 mg/ g 0.39 mg/ g 0.39 mg/ g 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 0.39 mg/ g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检萄球菌 查 铜绿假单未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 孢菌 43 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-5 紫草提取物稳定性加速试验报告 Table5-5 Accelerated stability test report of lithospermi extractive 样品名称:紫草提取物 批号:080910 生产日期:08.09.10 放置 时间 0月 1月 2月 3月 6月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 09.3.23 项目 本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色 性 状 粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异， 味苦 味苦 味苦 味苦 味苦 检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草 鉴 别 素 素 素 素 素 干燥失重 5.8% 5.7% 4.8% 5.0% 5.0% 检查 项目 炽灼残渣 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 含量测定 0.38mg/ g 0.38 mg/ g 0.38 mg/ g 0.39 mg/ g 0.39 mg/ g 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡萄未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 菌 44 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-6 紫草提取物稳定性加速试验报告 Table5-6 Aaccelerated stability test report of lithospermi extractive 样品名称:紫草提取物 批号:080917 生产日期:08.09.17 放置 时间 0月 1月 2月 3月 6月 结果 08.09.23 08.10.23 08.11.23 08.12.23 09.3.23 项目 本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色本品为紫红色 性 状 粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异，粉未;味特异， 味苦 味苦 味苦 味苦 味苦 检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草检出左旋紫草 鉴 别 素 素 素 素 素 干燥失重 5.8% 5.7% 4.8% 5.0% 5.0% 检查 项目 炽灼残渣 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 含量测定 0.38mg/ g 0.38 mg/ g 0.38 mg/ g 0.39 mg/ g 0.39 mg/ g 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡萄未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 菌 45 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 5.4.3 紫草提取物影响因素试验 影响因素试验结果如表5-7所示，高温度、高强度光照和高湿度对紫草提取物的质量影响不大，原料在高湿度下放置后，其干燥失重变化不大，表明本品不易吸潮，可长时间保存，温度、光照及湿度条件不影响原料的稳定性。 表5-7 紫草提取物影响因素试验报告 Table5-7 Influential factor test report of lithospermi extractive 样品名称:紫草提取物 批号:080910 生产日期:08.09.10 放置 高温试验 高湿度试验 强光照射试验 时间 结果 5天 10天 5天 10天 5天 10天 项目 本品为紫本品为紫本品为紫本品为紫本品为紫红本品为紫 红色粉未;红色粉未;红色粉未;红色粉未;色粉未;味特红色粉未;性 状 味特异，味味特异，味味特异，味味特异，味异，味苦 味特异，味 苦 苦 苦 苦 苦 检出左旋检出左旋检出左旋检出左旋检出左旋紫检出左旋 鉴 别 紫草素 紫草素 紫草素 紫草素 草素 紫草素 检 干燥失重 0.19% 0.15% 0.17% 0.15% 0.13% 0.18% 查 项 炽灼残渣 0.64% 0.35% 0.27% 0.39% 0.38% 0.45% 目 含量测定 79.69% 79.51% 83.38% 83.16% 84.62% 84.28% 细菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 卫 霉菌总数 ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g ,10个/g 生 学金黄色葡萄 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 菌 46 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 5.4.4 前列宁栓初步稳定性试验 结果如表5-8、5-9、5-10所示，前列宁栓重量差异均在?10%以内，融变时限均在30分钟内融变，制剂中左旋紫草素含量均不少于5.0mg/粒，微生物检查结果同原料检查结果，均不超标，表明该制剂在常温下保存，质量不易发生变化，制剂的初步稳定性符合规定。可在常温下保存。 表5-8 前列宁栓稳定性试验报告 Table5-8 Stability test report of Qianliening suppository 样品名称:前列宁栓 批号:081107 生产日期:08.11.07 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.11.12 08.12.14 09.01.13 09.02.12 项目 性 状 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 重量差异 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 查 项 融变时限 18分钟 17分钟 18分钟 20分钟 目 含量测定 5.8mg/粒 6.1mg/粒 5.9mg/粒 6.1mg/粒 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡萄 未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢 未检出 未检出 未检出 未检出 菌 47 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-9 前列宁栓稳定性试验报告 Table5-9 Stability test report of Qianliening suppository 样品名称:前列宁栓 批号:081109 生产日期:08.11.09 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.11.12 08.12.14 09.01.13 09.02.12 项目 性 状 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 重量差异 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 查 项 融变时限 16分钟 18分钟 18分钟 19分钟 目 含量测定 6.2mg/粒 5.8mg/粒 5.9mg/粒 6.1mg/粒 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡 未检出 未检出 未检出 未检出 检萄球菌 查 铜绿假单 未检出 未检出 未检出 未检出 孢菌 48 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 表5-10 前列宁栓稳定性试验报告 Table5-10 Stability test report of Qianliening suppository 样品名称:前列宁栓 批号:081110 生产日期:08.11.10 放置 时间 0月 1月 2月 3月 结果 08.11.12 08.12.14 09.01.13 09.02.12 项目 性 状 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 紫红色栓剂 鉴 别 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检出左旋紫草素 检 重量差异 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 查 项 融变时限 21分钟 17分钟 19分钟 17分钟 目 含量测定 6.0mg/粒 6.1mg/粒 6.2mg/粒 5.2mg/粒 细菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 卫 霉菌总数 <10个/g <10个/g <10个/g <10个/g 生 学金黄色葡萄 未检出 未检出 未检出 未检出 检球菌 查 铜绿假单孢 未检出 未检出 未检出 未检出 菌 49 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第六章 结论 本实验优选出了最佳的紫草提取物提取工艺和栓剂成型最佳工艺条件，即紫草粗粉，加入8倍量(药材量)石油醚，冷浸24小时，纱布过滤，加入8倍量0.25mol/L氢氧化钠萃取1次，分取碱液，放置24小时，加入16倍量0.5mol/L硫酸，得沉淀，过滤，水洗至中性，90?干燥，即得紫草提取物紫草素。称取紫草提取物9.0g，置于乳钵中研磨，过80目筛。取半合成脂肪酸甘油酯630g、液体石蜡90g、凡士林180g置于水浴(60?)上加热熔化，将药粉撒于已熔融的基质中，充分搅匀，边搅拌边倾入涂有脱模剂(液体石蜡)的栓模中，至略溢出模口为止。冷却后取出，制成1000粒，即得本品前列宁栓。 运用薄层层析法可鉴别出原料及制剂的供试品色谱与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的红色斑点。原料及制剂重金属、砷盐检查符合药典规定，原料干燥失重不得超过1.0%，炽灼残渣不得超过1.0%，有机溶剂石油醚残余量不得超过0.035%，紫草提取物中左旋紫草素的含量得不少于50%，前列宁栓中左旋紫草素的含量不得少于0.50%，制剂融变时限为在30分钟内融变，重量差异在?10%以内。 在考察期内，紫草提取物和前列宁栓的初步稳定性均符合规定，常温保存质量无明显变化。对紫草提取物进行了影响因素试验，结果表明，温度、光照和湿度对紫草素提取物的稳定性影响不大，高湿度下放置后，紫草提取物的干燥失重变化不大，表明本品不易吸潮。紫草提取物经加速试验观察，连续观察0—6个月，结果表明紫草提取物稳定性符合规定，原料质量不易发生改变。 本实验达到了研究的目的。 50 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 参考文献 [1] 辛玲，孙晖. 硬紫草研究概况. 中国医药技术经济与管理，2008年11月，第2卷第11期:63,68 [2] 葛锋，王晓东，王玉春. 药用紫草的研究进展. 中草药，2003年9月，第34卷第9期:5 [3] 徐德锋，管鹏健，毛志强，等. 紫草素的全合成研究进展. 有机化学，2005年，第25卷第7期:771 [4] 李晓瑾，谭秀芳，马媛，等. 药用植物紫草的研究进展. 新疆师范大学学报，2005年12月，第24卷 第4期:70,73 [5] 王文杰，白金叶，刘大培，等. 紫草素抗炎及对白三烯β-4生物合成的抑制作用[J]. 药学学报，1994 年，第29卷第3期:161 [6] 李惠兰，秦剑，何洪静，等. 滇紫草、新疆紫草和露蕊滇紫草提取物药效学研究[J]. 中国民族民间 医药杂志，2002年，第56卷第2期:174-175 [7] 罗学娅，李明辉，伦永志，等. 左旋紫草素抗副流感病毒作用[J]. 中草药，2005年，第36卷第4 期:568,569 [8] CHEN X,YANG L,ZHANG N,et al. Shikonin, a component of Chinese herbal medicine, inhibits chemokine recep tor function and supp resses human immunodeficiency virus type 1 [J]. Antim icrob Agents Chem other,2003,47(9):2810,2816 [9] SINGH F,GAO D,LEBWOHL M G,et al. Shikoninmodulates ce-llp roliferation by inhibiting ep idermal growth factor recep tor signaling inhuman ep idermoid carcinoma cells [J]. Cancer Lettr,2003,,200(2):115,121 [10] HASH IMOTO S,XU M,MASUDA Y,et al. beta2hydroxyisovaleryl-shikonin inhibits the cell growth of various cancer cell lines and induces apop tosis in leukemia HL260 cells through a mechanism different from those of Fas and etoposide [J]. J B iochem (Tokyo),1999,125(1):17,23 [11] PLYTA Z F,L I T,PAPAGEORGIOU V P,et al. Inhibition of topo-isomerase I by naphthoquinone derivatives [J]. B ioorg Med Chem Leff,1998,8(23):3385,3390 [12] 刘燕，买尔旦?马合木提，尼加提?热合木. 新疆紫草提取物对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J]. 新 疆医科大学学报，2006年，第29卷第6期:471,473 [13] 法韫玉，刘建华，孙桦，等. 紫草对药物流产临床效果的影响[J]. 生殖与避孕，1996年，第16卷 第3期:199,202. [14] 彭浩，罗成群. 复方紫草油对于烧伤创面一氧化氮、内皮素、丙二醛含量的影响[J]. 中国现代医学 杂志，2002年，第12卷第9期:17,19 [15] Nahrstedt A et al. Planta Medica [J],1990,56:395,395 [16] [张贵峰. 紫草成分对溶血小板激活因子乙酰转移酶的抑制作用[J]. 国外医学中医中药分册，2003 年，第25卷第2期:124. [17] Sankawa U et al. Chem. Pharm.Bull[J]. 1991,39(11):2956,2962 [18] 姜爱莉，孙丽芹，刘玉鹏. 紫草抗氧化成分的提取及其活性研究[J]. 精细化工，2002年，第19卷 51 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 第1期:51,53. [19] 袁定芬，邓辉，阎春林，等. 紫草素对内皮细胞血管新生活性的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学， 2006年，第11卷第1期:10. [20] 刘青梅. 不同剂量紫草醇提取物对表皮细胞过度增殖的实验研究[J]. 临床医药实践杂志，2003年， 第12卷第7期:485,487 [21] 严松柏，谈献和，胡玉涛. 紫草的研究进展. 时珍国医国药，2003年，第14卷第2期:103,104 [22] 孔令冰. 紫草的临床应用概况. 中国现代药物应用，2008年6月，第2卷第12期:117,118 [23] 王平，刘金军，李安华. 紫草油的制备及临床应用. 中国民族民间医药杂志，2004年，第6卷:224 [24] 杨东红，朱力. 紫草油治疗带状疱疹24例临床观察. 长春中医学院学报，2004年，第20卷第1期: 12 [25] 杨东红，于波. 复方紫草油治疗褥疮72例临床体会. 中国社区医师，2006年，第8卷第22期:1 [26] 张光亚，周岩，何春雨. 自制紫草油纱治疗慢性皮肤溃疡53例.实用医药杂志，2007年，第24卷第1 期:66 [27] 于庆芝，汤艳娟，李玉霞. 复方紫草汤治疗过敏性紫癜47例. 新中医，2003年，第35卷第11期:61 [28] 刘军. 紫草煎治疗玫瑰糠疹56例. 中医中药，2006年，第28卷第4期:281 卷第1期:43 [29] 邵现周. 复方紫草油治疗趾间感染性溃疡. 河南中医学院学报，2003年，第18[30] 侯英芳. 紫草油外涂治疗外阴溃疡. 中国民康医学，2004年，第16卷第7期:443 [31] 李有勇. 紫草油治疗烫伤40例疗效观察. 中国乡村医药杂志，2006年，第13卷第4期:56 [32] 胡玉玲，马通喜，杨秀琴. 紫草油外治宫颈糜烂的疗效观察. 宁夏医学杂志，2004年，第26卷第1 期:605 [33] 杨东红. 紫草油治疗接触性皮炎26例. 中国社区医师，2004年，第7卷第8期:62 [34] 李云. 紫草油治疗皮肤损伤586例疗效观察. 中国学校卫生，2003年，第24卷第6期:576 [35] 张兴镇，王秀萍. 中西医结合以紫草油外涂治疗烧烫伤285例临床观察. 中西医结合杂志，1986 年，第6卷第11期:695 [36] 曹松山. 紫草油的临床应用. 中国医院药学杂志，1992年，第12卷第11期:502,503 [37] 谢培增，庞继尧. 紫草油治疗烧烫伤. 中医杂志，1988年，第29卷第4期:41 [38] 陈晓秋. 紫草油骨外科应用之妙. 中医药信息，1994年，第2卷:43 [39] 杨葆稚,等. 紫草油治疗宫颈糜烂临床疗效观察. 中西医结合杂志，1986年，第6卷第4期:237 [40] 丁德祥. 加味紫草油外用治疗冻疮. 《中国临床医生》，2004年，第32卷第4期:29 [41] 李彦华. 用新疆中药紫草治疗鼻出血的探讨. 新疆中医药，2006年，第24卷第2期:45 [42] 孙国龙. 综合疗法治疗慢性前列腺炎216例. 中国民间疗法，2007年3月，第15卷第3期:55 [43] 刘忠. 中药直肠给药治疗慢性前列腺炎30例. 河北中医药学报，1997年，第12卷第4期:19 [44] 陈晓光，朱斌，曾琪. 用四川紫草提取紫草素的工艺研究. 四川职业技术学院学报，2008年11月， 第18卷第4期:121,122 52 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 [45] 胡昆，张爱英，张永煜，等. 紫草素的分离制备方法研究. 天然产物研究与开发，2004年，第116 卷第13期:239,240 [46] 林岱，李沙，黄静雯. 紫草剂型及临床用途研究新进展. 今日药学，2009年，第19卷第1期:30, 31 [47] 方武，彭荣章，龙向阳，等. 紫草素对膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的影响及其机制研究. 天津药学， 2006年4月，第18卷第2期:12 [48] 罗学娅，李明辉，伦永志，等. 左旋紫草素抗副流感病毒作用. 中草药，2005年4月，第36卷第4 期:568,570 [49] Abdel,Hameed M H，et al. International Journal of Oriental Medicine，1992，17(3):152 [50] Masahiro NISHIZAWA,a Masahiro KOHNO,a Minemitsu NISHIMURA,et al. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull，2005，53(7):796,799 [51] 张秀娟，刘佰华，穆坤，等. 紫草及其提取物生物学活性研究进展. 中国微生态学杂志，2007年 12月，第19卷第6期:578,579 [52] 赵雪梅，王桂玲，费洪荣，等. 紫草有效成分的提取及其抗炎作用. 研究中药药理与临床，2008 36,38 年，第24卷第4期: [53] Dayuan GAO, Makoto HIROMURA, Hiroyuki YASUI,et al. Direct Reaction between Shikonin and Thiols Induces Apoptosis in HL60Cells. Biol. Pharm. Bull，2002，25(7):827,832 [54] 周延萌，高允生. 中药紫草的药理作用与临床应用. 医药导报，2008年7月，第27卷第7期:786, 787 [55] 李劲，林奕，陈闻纳，等. 中药紫草对离体人乳头瘤病毒DNA作用的实验研究. 成都中医药大学 学报，2006年12月，第29卷第4期:52,54 [56] 侯盼飞，江新泉，赵英会. 紫草的抗病毒作用研究进展. 泰山医学院学报，2007年，第128卷第13 期:239,240 [57] 丁怀宇，徐萍. 紫草素提取及抗氧化性能研究. 食品工业科技，2009年，第01期:252,254 [58] 赵华，游勇基. 紫草药材化学成分的测定. 海峡药学，2007年，第19卷第4期:35,37 [59] 李晓瑾，谭秀芳，马媛，等. 新疆紫草质量稳定性研究. 新疆医科大学学报，2006年，第29卷第11 期:1045,1046 [60] 蔡裴茜. 紫草油在妇科应用的初步观察. 山东医刊，1959年，第10期:34 [61] 简洋辉，周迎新，张海道. 中药紫草类的质量研究. 中国中药杂志，1991年，第16卷第9期:524, 526 [62] 中村恭政. 齿界展望，1981年，第57卷第7期:1351(日文) [63] 姚凤舞. 中国药学杂志，1990年，第11卷第4期:185,186 [64] 殷子斐，胡玉芝，苏永华. 中药紫草对妊娠的影响. 中西医结合学报，2007年9月，第5卷第5 53 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 期:494,495 [65] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，2005版一部 [66] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，2005版二部 [67] 简洋辉等. 常用中药材品种整理和质量研究(南方组). 福建科学技术出版社，1994年，第1册: 170 [68] 傅善林. 新疆软紫草中萘醌色素的研究[J]. 中草药，1986年，第17卷第10期:2 [69] 向桂琼，卢馥荪. 新疆紫草细胞培养物的化学成分研究. 植物学报，1992年，第34卷第6期:455 [70] 王国珍，孙安一，李其兰，等. 烧伤涂膜剂的研制[J]. 中草药,1984年，第15卷第10期:23 [71] 李忠良，张敏，郭兰建. 紫草中紫草素的含量测定. 药物分析杂志,1986年，第6卷第1期:41 [72] 赵燕霞，罗雅玲，赖文岩，等. 紫草素抑制人气道平滑肌细胞的增殖. 南方医科大学学报，2008 年，第28卷第5期:805 [73] 潘秀琴，徐淑卿. 紫草中有效成分提取方法的研究. 医药世界，2006年，第5期:81,82 [74] 杨荣，万阜昌，冷柏. 6种紫草的药理活性比较. 中国医药学报，1992年，第7卷第3期:34 [75] 叶勇，潘渭樵. 温度对紫草素及其衍生物稳定性的影响. 中国药物与临床，2007年7月，第7卷 第7期:540,541 . 正交试验优选紫草提取工艺. 中药新药与临床药理，2006年，第4[76] 白 研，宋粉云，毋福海，等 期:288,290 [77] 宓伟，王志强，邱世翠，等. 紫草体外抑菌作用研究. 时珍国医国药，2007年，第18卷第9期:2217 [78] 朴美兰，张善玉，崔京浩. 紫草的制剂学研究进展. 中国野生植物资源，2004年4月，第23卷第2 期:12,14 [79] 王春英. 长白山紫草化学成分的研究. 中国实用医药，2008年4月，第3卷第11期:106 [80] 马丽萍. 超临界CO2从滇紫草中提取紫草素的研究. 精细石油化工，2000年3月，第2期:40,41 [81] 王艳亭，刘冰冰. 复方紫草油治疗难愈性压疮67例临床疗效观察. 中国全科医学，2004年11月，第 7卷第21期:1613 [82] 高明哲，肖洪斌，韩莹. 高效液相色谱/紫外/质谱鉴定紫草中紫草素类成分. 中国科学院，2007年 [83] 高秀云. 紫草油外用3则. 中医药信息，1995年，第2卷:21 [84] 孙文晓，张海港，李晓辉，等. 狼紫草水提物抗皮肤溃疡与镇痛作用的实验研究. 第三军医大学学 报，2007年10月，第29卷第19期:1892,1893 [85] 赖维湛，吴晖，陈志能. 宁泌泰胶囊和前列安栓治疗难治性慢性前列腺炎100例报告. 热带医学杂 志，2005年12月，第5卷第6期:800,801 [86] 熊元君，李勇，邓兵，等. 人工种植新疆紫草不同时期紫草素含量比较研究. 中国林副特产，2005 年8月，第4期:10 [87] 赵寒. 神奇的紫草. 食疗食养，2006年，第8期:18 [88] 赵雪梅，费洪荣，王桂玲，等. 泰山紫草与新疆紫草抗炎作用的初步研究(简报). 草业学报，2008 54 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 年8月，第17卷第4期:166,168 [89] 冯新星，陈建勇，陈子毫，等. 天然染料紫草染色织物的迷彩伪装防护性能. 纺织学报，2005年 10月，第26卷第5期:72 [90] 戴冰，周新蓓，尹爱武. 新疆软紫草四种溶媒系统提取物紫草素含量测定及急性毒性的实验研究. 中国中医药科技，2005年5月，第12卷第3期:168,169 [91] 林江，韩福刚，王开正. 新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究. 泸州医学院学报，2003年， 第26卷第2期:102 [92] 张阳，王英丽，齐红，等. 新疆紫草素抗肝癌的实验研究. 实用肿瘤学杂志，2006年，第20卷第4 期:294,295 [93] 许今博，买尔旦?马合木提,，于亚鹭. 新疆紫草提取物对果蝇寿命的影响. 新疆医科大学学报，2007 年3月，第30卷第3期:228 [94] 李洪玲，乔秀文，曾宪佳，等. 新疆紫草中紫草素的微波提取工艺优选. 时珍国医国药，2007年， 第18卷第1期:148 [95] 范如意，商亚贞，边怡超，等. 应用紫草膏防护诺维苯致静脉炎. 河北职工医学院学报，2004年6 月，第21卷第2期:28,29 7月，第17[96] 白研，宋粉云，毋福海等. 正交试验优选紫草提取工艺. 中药新药与临床药理，2006年 卷第4期:288,290 [97] 邵德荣. 复方紫草膏治疗慢性前列腺炎疗效观察. 中级医刊，1988年，第23卷第2期:115,116 55 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 附图 标准砷斑 空白 样品 样品 样品 附图4-1 紫草提取物砷斑图片 标准砷斑 样品 样品 样品 附图4-2 前列宁栓砷斑图片 56 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 左旋紫草素对照品 紫草提取物 阴性 附图4-3 紫草提取物薄层鉴别色谱图 左旋紫草素对照品 前列宁栓 阴性 附图4-4 前列宁栓薄层鉴别色谱图 57 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 左旋紫草素对照品色谱图 紫草提取物样品色谱图 阴性样品色谱图 附图4-5 紫草提取物高效液相色谱图 左旋紫草素对照品色谱图 前列宁栓样品色谱图 阴性样品色谱图 附图4-6 前列宁栓高效液相色谱图 58 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 附图4-7 紫草素对照品液相色谱图(蒸发光散射检测器) 附图4-8 紫草提取物液相色谱图(蒸发光散射检测器) 59 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 左旋紫草素对照品色谱图 紫草药材色谱图 附图4-9 紫草药材高效液相色谱图 60 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 致谢 伴随着论文的完成～硕士阶段的学习即将结束～此时此刻～首先要感谢我的导师李超生老师对我的指导及培养～在我的学习与生活中～给予了我极大的关心和支持。 感谢宋慧老师对我论文写作的悉心指导～宋老师严谨的治学态度～孜孜以求的工作精神使我受益匪浅。 感谢吉林省中医药科学院在实验仪器等方面给予的极大的帮助。 感谢吉林省中医药科学院的杨铭老师在药理实验方面给予的帮助。 感谢吉林省中医药科学院的王晶实验员在实验中对我的支持和帮助。 61 吉林农业大学硕士学位论文 中药五类新药前列宁栓的药学研究 个人简介 姓名:于昆 性别:女 出生日期:1981.12.10 籍贯:吉林省吉林市 最后学历(学位):农学硕士 毕业院校:吉林农业大学 学习经历:2001.9,2005.7:吉林农业大学生物技术专业学习; 2006.9,2009.6:吉林农业大学作物生物技术专业学习。 62