半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的生物合成

半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的生物合成 半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926 的生物合成 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010,41(2) 半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的生物合成 沈晓放,陈少欣 (上海医药工业研究院,上海200040) ?141? 摘要:综述了继替考拉宁之后的第二代半合成糖肽类抗生素达巴万星前体 A40926的研究进展,包括其结构,发酵生产, 生物合成以及结构修饰.重点阐述了A40926的生物合成基因簇以及合成途径.达 巴万星是A40926的半合成化合物, 目前处于III期临床研究,它具有比万古霉素和替考拉宁更强的生物活性. 关键词:A40926;生物合成;结构修饰;达巴万星;综述 中图分类号:Q939.92文献标志码:A文章编号:1001—8255(2010)02—0141—07 BiosynthesisofA40926,APrecursor ofSemisynthesisGlycopeptideAntibioticDalbavancin SHENXiaofang,CHENShaoxin (ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200040) ABSTRACT:ItwasreviewedthattherecentadvanceonA40926,aprecursorofasecond— generationglycopeptides antibiotic,dalbavancin,developedafterteicoplanin,includingthestructure,fermentationpr oduction,biosynthesis andstructuralmodificationofA40926.Thebiosynthesisgeneclustersandsyntheticrouteof A40926wereespecially introduced.Dalbavancin,anovelsemisyntheticderivativeofA40926,showingmorepotentt hanvancomycinand teicoplanin.iSnowinthephaseIIIclinicaltrials. KevW0rds:A40926;biosynthesis;structuralmodification;dalbavancin;review 糖肽类抗生素临床常用于由革兰阳性菌—— 尤其是葡萄球菌(Staphylococcussp.),肠球菌 (Enterococcussp.)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)所致严重感染性疾病的治疗".其中, 万古霉素(vancomycin)和替考拉宁(teicoplanin) 已经广泛用于临床治疗,对多重耐药菌具有较好 的效果.达巴万星(dalbavancin)是继万古霉 素和替考拉宁之后的抗多重耐药菌的新型半合成 收稿日期:2009—06.15;修回日期:2009—10—23 基金项目:国家"重大新药创新"科技重大专项资助 (2009ZX09301,007),国家科技支撑计划(2007BAI29B04) 作者简介:沈晓放(1985一),女,硕士研究生,专业方向:微生物 与生化药学. 通信联系人:陈少欣(1972一),男,研究员,从事微生物与生化药 学研究. 11:021.624798O8×455 E-mail:sxzlb@263net 糖肽类抗生素E33,目前处于III期临床研究.其前 体A40926(1)是由野野村放线菌属(Nonomuraea sp.)ATCC39727产生的天然糖肽类抗生素,进行 化学结构修饰后可得达巴万星.本文就1的生 物合成和近年来的研究进展阐述如下. 11的结构 1由野野村放线菌属ATCC39727菌株发酵 产生,有5个主要组分:PA,PB,A,B0和 B1[6(结构见图2),B0和B1统称为B组分,其 中B0占90%...这5组分均含有2个氯原子和2 个糖基——甘露糖和葡糖胺.结构与替考拉宁相似, 在葡糖胺上有一脂肪酸链,PA和A中是正十一 烷基,PB和B中是异十二烷基.1结构中有2个 羧酸,因此在中性条件下带有净负电荷.A,B和 PA,PB的区别在于甘露糖C一6位上的乙酰基.在 发酵液中PA,PB含量占优,但在纯化过程中,长 时间在碱性环境中温育时,PA,PB会慢慢转化为A, B.因此,一般用于活性研究为A,B组分,含量 约35%和65%. 21的发酵生产 由于1的衍生物临床应用前景良好,对1进行 规模化生产十分重要.2003年,Gunnarsson等 在研究野野村放线菌ATCC39727分批发酵过程中 培养基成分对菌体生长和产抗的影响时发现:初始 葡萄糖浓度较高抑制菌体的初期生长,高浓度的磷 酸盐有利于提高菌体生物量,但高浓度的铵盐严重 损害菌体生长.野野村放线菌开始合成1的时机与 培养基中残余葡萄糖,磷酸盐和铵盐的浓度没有直 接关系,但初始磷酸盐和铵盐浓度较低,1的最终 发酵单位会有所提高. 2004年,Technikova.Dobrova等研究了一 系列以无机盐为主要成分的培养基对野野村放线 菌ATCC39727生长及产抗的影响.结果显示,培 养基中含有磷酸盐,菌株生长缓慢,产抗量低.同 时菌株对铵离子敏感,当培养基中氯化铵浓度超过 60mmol/L时,菌株的生长被完全抑制,抗生素的 产量也下降.钙离子的存在可以促进菌株生长,却 影响抗生素的生成.发酵液中的三一谷氨酰胺,,. 天冬酰胺及一谷氨酸也会对野野村放线菌产抗有 一 定影响.含有.谷氨酰胺的MM一1O3培养基中 1产量较高,达122.6mg/L. 1组分问的差异主要在于葡糖胺上脂肪酸链的 不同.Jovetic等研究发现,丁酸,异丁酸和丙 酸为脂肪酸链的起始物,将这些化合物作为前体物 质加至发酵培养基中可以提高1中某组分的比例. 同时,细胞中脂肪酸的结构和含量也显着影响1的生物合成及产物的产量,这是由于1的脂肪酸链是 由自身细胞膜上脂肪酸经过B.氧化作用缩短而得. 另外,一些分支氨基酸可为含脂肪酸链的抗生素提 供生物合成的前体,达到定向合成某一组分的目的. Beltrametti等…研究发现,缬氨酸是1B0组分的 分支酰基链的潜在前体,因此在发酵培养基中加入 三一缬氨酸可以增加产物中B0组分的比例,同时提 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010,41(2) 高1总产量. 31的生物合成 虽然已经克隆了1的生物合成基因簇,但对其 生物合成的机理了解尚少.根据参与1生物合成的 基因信息推断大致包括三个步骤.?非蛋白质氨基 酸的合成.?通过非核糖体肽合成酶(NRPS)将氨 基酸连接成七肽骨架,具体过程如下:i)识别和激 活;ii)氨基酸硫酯的形成和肽链的后继延伸;iii) 连接在合成酶复合体上的完整肽链在硫酯酶结构域 的作用下被解离,非蛋白质氨基酸在差向异构酶结 构域的作用下进行差向异构化,线性肽链在氧化酶 的作用下进行环化.?七肽骨架的修饰?:i)在 葡糖胺转移酶的作用下于4位氨基酸连接葡糖胺; ii)在酰基转移酶的作用下将来自自身细胞膜的脂 肪酸进行部分分解后,形成酰基链连接到葡糖胺的 氨基上?;iii)7位氨基酸上甘露糖的连接,葡糖 胺的氧化以及?末端的甲基化u.?产物输出. 研究表明?,参与1合成的基因位于一个总 长约77kb的基因簇上(命名为dbv基因),它共 含有37个开放阅读框(ORF1,0I37,图1). 3.1非蛋白质氨基酸的合成 1七肽骨架的组成需要三个非蛋白质氨基酸的 参与?,分别是羟苯基甘氨酸(HPG),二羟苯甘 氨酸(DPG)和B.羟酪氨酸(DHT).其中,HPG 位于4,5位,DPG位于7位,6HT位于6位(在 万古霉素家族中位于2,6位).酪氨酸和对羟基 苯丙酮酸盐是4一羟基苯丙酮酸盐的前体.苯丙酮 酸在羟基扁桃酸盐合成酶(HmaS)的作用下合成4. 羟基苯扁桃酸,再在羟基扁桃酸盐氧化酶(Hmo) 的作用下氧化成4.羟基苯乙醛酸,这两个酶分别 由ORF1,ORF2编码.最后在转氨酶Pgat的作用 下将4.羟苯基乙醛酸转化成(S).HPG引. DPG和13HT的生物合成过程尚未研究透彻. ORF31,ORF34分别表达DPG形成过程中必需的 合成酶DpgA,DpgD.其中DpgA是将丙二酸单 酰辅酶A前体转化为3,5一二羟苯基乙酸的关键酶. 然后在DpgB和DpgD的作用下形成乙酸苯酯.最 后,在转氨酶的作用下将二羟苯甘氨酸乙醛酸转化 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010.41(2) ---------- ? 5.6.7.17 鲁Iij鲁螂 国一氨基酸合成:圉--NRPS;口一交联;目一裁剪步骤;圈一转运;?一抗性;圈一调 节;?一未知 — +:转录单元;—?:Dbv4控制的dbvl4一dbv8~Idbv30一dbv35操纵子 图1dbv基因簇结构图m 为(S)一DPG.编码羟苯基丙酮酸盐和3,5一双脱氧羟 苯基丙酮酸盐的氨基转移酶基因在ORF37上,这 是HPG合成酶HpgT的一个类似物,是产生HPG 和DPG所必需的7,18]. 将ORF28进行基因置换,得到一个相对分子 质量比1小16的代谢产物.经鉴定,它与1的区 别在于缺少了13HT的羟基部分.据此推测ORF28 可能编码B一羟化酶,参与将含有硫酯的酪氨酸转 化为6HT的转化过程,并且推测该过程是在NRPS 激活酪氨酸之前完成的. 3.2七肽骨架前体的合成及卤化 1七肽骨架前体是由NRPS催化合成的. ORF16,ORF17,ORF25和ORF26编码1形成所 需7个模块的NRPS_1引.其中,ORF25编码模块1 和2,ORF26编码模块3,ORF17编码模块4,6. 经比较,dbv基因簇的ORF16和其他糖肽类的模块 7具有高度同源性.另外,ORF15和ORF36可能 也参与七肽的合成.其中,ORF15编码一个短的, 高度保守的未知功能的肽段,它在很多含有NRPS 基因的放线菌基因簇中都存在.ORF36编码一个 II型硫酯酶,它通常在含有NRPS的基因簇或多肽 合成酶基因中存在,这个硫酯酶可能作用于水解发 生错误的NRPS的T区域. 氨基酸之间的交联有利于七肽环的稳定,并 为结合细胞壁靶标提供亲和位点.在balhimycin中 已得到证明,这是由P450单加氧酶来完成的.研 究发现,在dbv基因簇中ORF11,ORF14均编码 P450单加氧酶,分别参与氨基酸5—7,4—6,1-3和 2—4的交联…. 研究发现,在dbv中只有ORF10编码一个单 一 的卤化酶,这和bal(balhimycin合成基因簇), cep(chloroeremomycin合成基因簇)以及tcp(替 考拉宁合成基因簇)一样,而在sta(A47934合成 基因簇)基因簇中,却有两个卤化酶?.删除 ORF10,产物中的两个氯原子也随之消失,说明这 一 个基因同时对两个位点进行卤化.据报道,氯原 子可以提高某些糖肽类抗生素的抗菌活性. 3I3苷元的修饰及输出 1七肽骨架前体形成后,需进行结构修饰才能 得到成熟的1并输出.修饰包括:4号氨基酸羟基 上葡糖胺的添加,葡糖胺残基的?.酰基化修饰,7 号氨基酸羟基上甘露糖残基的添加和葡糖胺的氧 化,末端HPG残基的?-甲基化等.该过程共有5 个蛋白质参与,分别由ORF9,ORF23,ORF20, ORF29和ORF27编码.其中,ORF9编码用于4 号氨基酸糖基化的糖基转移酶,删除了ORF9的菌 株缺失了连接葡糖胺的功能?.ORF23参与葡糖 胺残基的?_酰基化过程.ORF20编码一个甘露糖 基转移酶,参与1的甘露糖化.ORF29编码己糖氧 化酶,负责葡糖胺的氧化.推测ORF27可能催化 末端HPG残基的?_甲基化.除了ORF9和ORF27 以外,另三个修饰是其他糖肽类抗生素所不具备的. 与产物输出有关的ORF主要有4个.ORF24 和ORF35分别编码ABC一跨膜转运蛋白和离子依 赖的跨膜转运蛋白,其相似基因也存在于其他糖肽 类抗生素基因簇中.ORF19编码另一个ABC一型转 运体,而ORFl8编码跨膜配体.在这些转运蛋白 的作用下将合成的1转运至细胞外.另外,ORF7 编码一个含有典型修饰的VanY-家族的羧肽酶,参 与将新生肽的末端丙氨酸残基进行胞外转移,以降 低糖肽类抗生素结合自身分子靶标的程度. 3.4调节基因 ORF3和ORF4是两个调节基因.其中,ORF4 的产物Dbv4通过结合或靠近ORF4,ORF14和 ORF30的启动子来激活这些基因的转录,是一个 正调节子.并且Dbv4还控制着其它两个ORF操纵 子,其中一个编码参加DPG合成的蛋白质,另一 个参与七肽骨架的交联,卤化,糖基化及酰基化. 虽然ORF6和ORF22并不相连,但它们编码 一 个二元信号传导系统,这也是dbv基因簇的特别 之处.ORF30可能编码一个硫酯酶,在多肽衍生 的氨基酸合成过程中参与促进DPG前体的释放. 目前尚未找到ORF8和ORF20产物类似物的功能, 前者对于其它糖肽类抗生素来说是独一无二的,而 后者的类似物也同样存在于bal和cep中. Alduina等纠分析了不同培养时间下含磷酸 盐的培养基中dbv基因的转录,ORF4,ORF14, ORF8以及ORF30,ORF35随着培养基中磷酸盐 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010,41(2) 的耗竭,转录产物明显增加,可见磷酸盐对上述 ORF具有负调节作用.并且提出了这样的假设: Dbv4可能在生物合成中作为正调节子结合在, dbv14和dbv30的启动子上,从而启动它们的转 录.为了证明这一假设,在大肠杆菌中表达及纯化 Dbv4,通过凝胶阻滞分析,发现dbvl4和dbv30的 上游区域能与之结合,使dbvl4和dbv30的表达上 调.用Dbv4的类似物Bbr进行试验也得到相同的 结果. 由此可知,随着培养基中磷酸盐的耗竭,诱 发dbv4的转录表达,产物Dbv4结合到多顺反子 ORF14,ORF8和ORF30,ORF35的启动子上游 区域,对其进行正调节,从而提高相应操纵子的表 达水平.这是磷酸盐对于糖肽类产物调节作用的分 子机理的首次报道. 41的结构修饰 经研究表明,1各组分的抗菌活性基本和替 考拉宁相似,对大多数甲氧西林耐药的葡萄球菌 (MRSA)和链球菌(Streptococcisp.)以及凝固酶阴 性葡萄球菌(CoNS)有较好的抑菌效果,而对革 兰阴性菌基本无效(表1).但是,淋病奈瑟球菌 (Neisseriagonorrhoeae)例外.研究发现,1具有 较好的抗淋病奈瑟球菌的活性,这是其它糖肽 类抗生素所不具备的特性. 表11的抗菌活性谱 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010,41(2) 1的作用机制与万古霉素,替考拉宁等糖肽类 抗生素相似.首先非特异性地与细胞壁的外层 结构相结合,然后与细胞壁肽聚糖合成的前体—— UDP.N-乙酰胞壁酸所接五肽上的D.丙氨酰.D一丙 氨酸特异性结合,抑制细胞壁的合成.由于细胞壁 缺损,菌体内的高渗压在等渗环境中因水分不断渗 入致使细菌膨胀直至破裂.同时,1可引起细胞 内UDP一?_乙酰胞壁酰五肽的积累,这对细菌的生 长同样具有抑制作用.另外,1在糖基上连有长的 脂肪酸链,因此与膜具有更强的亲和力. 为进一步提高1的生物活性,对其结构进行化 学修饰.目前促使糖肽类抗生素活性增强的修饰方 法有2个:一是修饰不直接碰撞结合口袋的位 点,包括糖基的移除或替代,和在一些易接近的功 能区进行修饰,如7位氨基酸的C.末端,氨基酸 的?-末端以及羟基等;二是直接修饰结合区域. 一 般以第一种方法为主,第二种方法容易导致结合 口袋的破坏而失去与靶标结合的能力,从而丧失抗 菌活性. 1的衍生物很多,修饰位点主要有2个,一 个在葡糖胺上,另一个是C末端.结构见图 2,其抑菌活性见表2,4.抗菌活性较突出的是 MDL63246(RA.A.1)和MDL63042(RA—A.2).其 中MDL63246半衰期甚至较替考拉宁长.. 表21(A)和A一酰胺类的体外抗菌活性(MIC/pg?ml) R A(CH2)9CH3 PA(CH2)gCH3 B0(CH2)8CH(CH3)2 B1(CH2)IoCH3 PB(CH2)8CH(CH3)2 R' oH CO2CH3 0H 0H CO2CH3 AMIDES — A一1 一 A一2 . A一3 .A一4 一 A一5 A:X=COOH.Y=oH.R=OH MA:X=COOCH3.Y:OH,R=OH RA:X=CH2oH.Y=OH.R.一OH AMIDES:Y=NR".R=OH 图2A40626及其衍生物结构图 , c.c , HN HH , 一一一一一 ? 146?中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2010,41(2) 表3MA衍生物的体外抗菌活性(MIC/~tg?ml) 表4RA衍生物的体外抗菌活性(MIc/g?ml) 1的半合成化合物A—A.1(即达巴万星)是 在1七肽骨架的C.末端加上了一个?,?_二甲基丙 胺,因而具有更强的抗葡萄球菌的活性,尤其 是更强的抗CoNS的活性.达巴万星具有和其他糖 肽类相似的抗菌谱,但具有比万古霉素和替考拉宁 更强的活性和半衰期,目前处于III期临床研究,有 望成为新一代的糖肽类抗生素. 5总结 达巴万星是新的糖肽类抗生素,为能治疗多重 耐药的金黄色葡萄球菌(Staph>,lococcusaureus)和 肠球菌属感染性疾病的少数药物之一,且具有万古 霉素和替考拉宁没有的抗淋病奈瑟球菌的作用,半 衰期更长.1是达巴万星的合成前体,其工业化生 产具有诱人前景.但目前1的文献报道不多,微生 物发酵法生产1的研究,包括菌种的改良,发酵条 件的优化,产物的分离纯化的报道甚少. 参考文献: [1]PootoolalJ,NeuJ,WrightGD.Glycopeptideantibiotic resistance[J].AnnuRevPharmaeolToxicol,2002,42 [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 38l-408. MalabarbaA,CiabattiR.Glycopeptidederivatives[J].Curt MedChem,2001,8(14):1759一l773. 谭玲,刘爱民,孙春华.新糖肽类抗生素达巴万星[J]. 中国新药杂志,2006,15(12):1020—1023. ZhangZ,WangY'RuanJ.ReclassificationofThermo— monosporaandMicrotetraspora[J].IntJSystBacteriol, 1998,48(2):411-422. 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