大鼠骨髓内皮祖细胞移植对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏损伤的修复

大鼠骨髓内皮祖细胞移植对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏损伤的修复 大鼠骨髓内皮祖细胞移植对单侧输尿管梗 阻大鼠肾脏损伤的修复 3118重庆医学2009年12月第38卷第24期 ? 论着? 大鼠骨髓内皮祖细胞移植对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏损伤的修复 王代红,李芙蓉,程悦,侯卫坪,袁发焕 (第三军医大学新桥医院肾内科,重庆400037) 摘要:目的探讨大鼠骨髓内皮祖细胞移植对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的修复作用.方法应用 密度梯度离心法分离骨 髓单个核细胞,内皮祖细胞选择性培养液培养后移植到单侧输尿管梗阻大鼠.应用 PAS,HE,Masson染色方法判断梗阻大鼠损 伤和修复情况,应用免疫组织化学检测a—SMA和HIF1a表达,应用Westernblot检测HIF表 达.结果各组间肝功能,肾功能 无显着性差异;与假手术组比,UUO组肾脏病理积分显着增加,移植组肾脏病理积分显着低 于UUO组(P<0.05);UUO组a— SMA在14,21d显着高于假手术组(P<0.05),移植组”一SMA在14,21d显着低于UUO组 (P<O.05);假手术组仅有少量HIF 表达,且主要表达在胞质,UUO组HIF表达随病程进展逐渐增加(P<o.05),移植组HIF表达 显着低于UUO组(P<0.05).结 论EPCs移植改善了UU0大鼠梗阻肾脏的损伤,纤维化和低氧状况. 关键词:单侧输尿管梗阻;内皮祖细胞;低氧 中图分类号:R365.693文献标识码:A文章编号:1671—8348(2009)24—3l18一O4 Effectofendothelialprogenitorcellsonrenalimpaivementofunilateralureteralobstructionrats WANGDaihong.LJFurong.ZHANGYing,eta1. (DepartmentofNephrology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China) Abstract:ObjectiveToreasercheffectofendothelialprogenitorcellsonrenalimpairmentofunilateraluretera[obstruction (UUO)rats.MethodsMononuclearcells(MNCs)inratbonemarrowwereisolatedbydensitygradientcentrifugationandwere culturedaccordingtopreviouslydescribedtechniques,thentransplantedbydirectrenalarteryinjection.Hist0pathol0gicaichanges inkidneyslicesandseveritywerejudgedbyinterstitiallesionscoringbyHE,PAS,andMassonmethods.TheexpressionofmSMA andHIF-1wasdetectedbyimmunohistoehemistrymethod.TheproteinexpressionofHIF-1dwasassessedbyWesternblotmeth— od.ResultsHepaticfunctionandrenalfunctiondidnotvaryamongtransp1antationgroupandUUOgrou patthesametime.The interstitialfibrosisandtubularinjuryintransp1antationgroupwaslighterthanthatinUU0group.Compa redwithshamgroup,ex— pressionofalphaSMAwassignificantlyhigherinUUOgroupon14,21d(P<O.05),butthatintransp1a ntationgroupwaslower thanthatinUUOgroup(P<0.05)respectivelyon14,2ld.TherewastraceamountofexpressionofHIFi nshamgroup.Butin UUOgroupthatwassignificantlyincreased(P<0.05),andon21dreachedatpeak.Andexpressionintr ansplantationgroupwas lowerthanthatinUUOgrouprespectivelyon7,14,21d(P<0.05).ConclusionEPCstransplantationim proverenalinterstitial damage,fibrosisandhypoxiaofUUOrats. Keys:unilateralureteralobstruction;endothelialprogenitorcells;hypoxia 近年研究发现,肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严 重程度和判断预后最重要的指标],.肾问质纤维化(renalinter— stitialfibrosis,RIF)几乎是所有肾脏疾病进展到终末期肾功能 衰竭的共同病理途径_2J.RIF受低氧,高血压,蛋白尿等因素 的调节.引起低氧的因素包括贫血,血管活性物质的紊乱,肾 脏耗氧增加,纤维化后氧的弥散距离增加和肾小管周毛细血管 的丢失_3j.因此通过改善缺氧对于延缓甚至逆转CKD的进 展具有重要意义.本研究通过移植内皮祖细胞(EPCs),初步 探讨EPCs对单侧输尿管梗阻UUO大鼠的损伤修复. 1材料与方法 1.1动物与试剂6周龄SD雄性大鼠(由第三军医大学大坪 医院实验动物中心提供),体质量100,150g.M199培养液 (Hyclone公司),胎牛血清(Gibico公司),血管内皮生长因子 (Biovision公司),碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司), 大鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司),DAB显色剂 (北京中衫生物技术有限公司),兔抗大鼠aSMA抗体,低氧诱 导因子la(HIFla)抗体(北京博奥森生物技术有限公司),通用 型二步法(非生物素)检测试剂盒,BeyoECLPlus(碧云天生物 技术研究所),彩色预染蛋白质相对分子质量(碧云天生物 技术研究所),兔抗大鼠-actin抗体(北京博奥森生物技术有 限公司). 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓EPCs的培养和鉴定大鼠骨髓来源的 EPCs的分离培养参照文献E6]的方法,提前1h用纤维连接蛋 白包被100mL培养瓶和12孔培养板中的盖玻片.2,4周龄 SD大鼠断头处死,应用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞. EPCs选择性培养液培养.通过形态,荧光双染鉴定EPCs功 能. 1.2.2动物饲养及分组,构建uu0SD大鼠饲养于普通级 动物室,饮用水为自来水,室温,光照与黑暗为12h交替.试验 期间自由饮水,进食,适应性饲养7d后,随机分为4组:假手术 对照组,移植对照组,UU0组和移植组.UU0组及移植组大 鼠以2戊巴比妥钠(40mg/Kg)腹腔注射麻醉后,双结扎左侧 输尿管近肾盂段.UUO组经左肾动脉注射PBS.移植组注射 EPCs悬液,局部压迫止血.然后逐层缝合.假手术组和假手 术+EPCs组以同样方法暴露肾脏后仅游离不结扎左侧输尿 管,分别通过左肾动脉注射PBS或EPCs悬液lmI. 1.2.3生化检查,肾脏病理检查采用OlympusAU270全自 重庆医学2009年12月第38卷第24期 动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨 酸氨基转移酶(AST),尿素氮,肌酐值.肾脏组织固定于4 多聚甲醛24h后,脱水,透明,浸蜡,石蜡包埋,制成3m切片, 作PAS染色,Masson染色(马松染色),HE染色. 1.2.4肾脏病理评分评分参照文献[7]方法,对小管间质损 伤进行评分,每个标本随机选择不重复1O个视野,包括皮质, 髓质,皮髓交界处,包括6项具体项目:(1)肾小管扩张.(2)肾 小管萎缩.(3)肾小管上皮细胞空泡形成.(4)肾小管上皮细 胞坏死.(5)肾问质纤维化.(6)肾间质炎症细胞浸润,即肾间 质局灶性炎细胞浸润为轻度损害;弥漫性散在的炎症细胞浸润 为中度损害;弥漫性密集的炎症细胞浸润为重度损害.对每一 个项目按照病理损害的程度分为0分:正常;1分:轻度损害 (病变小于2o);2分:中度损害(病变2O,4O);3分:重 度损害(病变大于4O). 1.2.5免疫组化染色检测”一SMA和HIF1a表达.肾脏组织 固定于4多聚甲醛24h后,脱水,透明,浸蜡,石蜡包埋,制成 3”m切片,作免疫组化染色.二甲苯脱蜡,梯度酒精水化;抗 原修复液(o.01mol/I构橼酸盐缓冲液,pH6.O),微波炉高火 加热至沸腾,低火维持15rain,自然冷却;0.5Triton37?孵 育30rain,0.0lmol/LPBS漂洗3rain×3次;0.3H202甲醇 溶液室温孵育25rain以阻断内源性过氧化物酶;5正常山羊 血清室温封闭20rain,加一抗(q—SMA1:200;HIF一1d1: 2OO),阴性对照以0.Olmol/LPBS代替一抗,4.C过夜,依次加 两步法免疫组化试剂盒试剂1,试剂2室,DAB显色,苏木素复 染,封片后镜下观察. 1.2.6Westernblot检测HIF一1d表达取肾组织1OOmg,加 入1mLRIPA,lOgIPMSF,眼科剪将组织剪碎;电动匀浆,匀 浆液转人1.5mEEP管离心,4.C2oOOOg,离心30rain,取4Og 蛋白质8SDS—PAGE电泳,然后转移至PVDF膜;用含5脱 脂牛奶TBST室温封闭lh;加入l:500稀释的兔抗大鼠HIF- 1d,兔抗大鼠口一actin抗体4?过夜;用TBST洗膜20rain×3 后,分别加入含5脱脂牛奶的羊抗兔IgG/HRP抗体(1: 5000稀释)室温孵育lh;TBST洗膜20rain×3后,ECI反应 2rain,凝胶成像系统扫描分析条带光密度值. 1.3统计学方法数据以j?S表示,所有数据采用SPSS 13.O统计软件统计,采用单因素方差分析比较其差异,P< 0.05为差异有统计学意义. 3119 2结果 2.1肾脏大体结构改变大鼠以2戊巴比妥钠(80mg/kg) 腹腔注射麻醉后,固定于手术台上,沿腹正中线作,纵向切口, 依次切开皮肤,肌层及腹膜,暴露双侧肾脏,观察肾脏病变情 况.UUO术后7d,梗阻侧(左肾)肾脏体积明显较对侧(右肾) 增大,颜色暗红,肾脏包膜增厚,出现肾盂积水,右肾外观无明 显改变.随着梗阻时间延长,左侧肾脏显着增大,包膜增厚,实 质逐渐变薄.与对应时间点的UU()组相比,移植组左肾肿大 程度较轻,色泽较红润. 2.2各组大鼠左肾/体质(rag/g)的比较比较各组左肾 重/体质量发现,各时相点似于术绑和假手术+EPCs组无显 着性差异,术后第7天,UU()组及移植组左肾重/体质量值均 较假手术组为高(P<0.05).术后第14,21天,随着肾盂积 水的加重,肾实质变薄,UUO组及移植组左肾重/体质量值逐 渐下降,但移植组高于同期UU()组(P<O.05),见表1. 2.3不同时相点4组大鼠m清ALT和AST水平的变化静 脉血清AIT,AST在不时问点4组大鼠间差异无统计学意 义(P>O.05),见表2. 表l四组大鼠不同时间点肾重/体质量变化(mg/g)(i?s) 与假手术组相比,:P<O.05;与UU()组相比,?:P<O.05. 2.44组大鼠不同时相点血清尿素氮和肌酐水平的变化各 时相点假手术组和假手术+EPCs组尿素氮无显着性差异, UuO组和移植组大鼠在术后7d有一过性增加,与假手术组相 比,差异有统计学意义(P<o.05).其余时相点差异无统计学 意义(P>0.05)(表3).各时相点假手术组和假手术+EPCs 组血肌酐水平差异无统计学意义,UUO组和移植组大鼠在术 后7d,血肌酐水平有一过性增加,与假手术组相比,差异有统 计学意义(P<0.05).其余时相点差异无统计学意义(P> 0.05),见表3. 表24组大鼠不同时间点血清AIT的变化(IU/I)(i?S) 2.54组大鼠不同时相点肾组织形态学变化和病理积分假 手术组和假手术+EPCs组肾组织形态学未发现明显异常. UUO组梗阻肾脏随时间的延长体积逐渐增大,肾盂内积液逐 渐增加,肾实质逐渐变薄,肾包膜增厚.梗阻后第7天可见肾 小管扩张,小管上皮细胞空泡变性,间质水肿,间质内有炎性细 胞浸润.术后第14天,皮质变薄,肾小管上皮细胞萎缩,管腔 扩张更加明显,弥漫的炎性细胞浸润,纤维化形成.术后第2l 天,皮质明显变薄,肾小管上皮细胞变性,萎缩明显,仍可见明 3l2O重庆医学2009年12月第38誊第2f4期 表3_组大鼠不同时间点血清尿素氮(mmol/l)和肌酐【lxmol/1)的变化(?) 与假手术组相比,:P<O.05. 显扩张的小管,大量炎性细胞浸润,纤维化更加明显,肾小管基 底膜明显增厚. UUo组与移植组大鼠不同时相点肾小管问质的病理积 分变化.随时间延长,两组大鼠肾小管问质损害逐渐加重.比 较uu0组与移植组肾小管间质病变的病理积分结果显示:术 后第7天,两组积分之间差异无统计学意义(P>0.05),术后 14d和21d移植组大鼠肾小管问质病变的病理积分均低于 UU0组,差异有统计学意义(P<0.05),见表4. 2.6不同时相点a-SMA表达的变化似于术组和似手术+ EPCs组3周内肾组织内除了大血管外未见明显的SMA表 达,两组问无显着性差异.UUO组随疾病进展aSMA表达逐 渐增加,小管和问质均可见阳性表达,在术后14d和21d与假 手术组相比,差异有统计学意义(P<0.05).UUO组和移植 组同时相点相比,移植组aSMA表达较弱,第21天显着低于 UUO组(P<O.05),见网1,表5. 表4UUO组与EPLs+UUO组大鼠不同时相点肾小管 间质的病理积分(?) 表5免疫组化检测不同时相点大鼠肾脏ccSMA表达(IOD)(i?S) :与假手术组比,P<O.05;?:与UUO组同时相点比,P<o.05. A:假手术组;B:UUO组7d;C:UUO组14d;D:UUO组21d;E:移 植组7d;F:移植组14d;G:移植组21d(×400). 图1不同时相点各组a—SMA表达 A:假手术组;B:UUO组7d;C:UUO组14d;D:UUO组21d;E 移植组7dA;F:移植组14d;G:移植组21d(×400). 图2不同时相点各组HIF_1d表达 要集中在髓质小管胞质.与似l丁术组比,UUO组第7天HIF- 1a即表达显着增加(P<O.05),随疾病进展表达逐渐增强.移 植组各时相点均低于UUO组(P<ff0.05),仅在14d和21d强 于假手术组(P<O.05). 765432, ,}I,___?—謦枷__螂_,120kd I_ _____一__一42kd {2. 1. 旱 莹0.一zharn7d14d21d 1:假手术组;2,4,6:分别为UUO组7d,14d,2ld;3,5,7:分别为移 植组7d,14d,21d.*:与假于术组比,P<O.05;?:与UUO组同时相 点比,P<0.05. 图3Westernblot检测各组不同时相点HIFlc~表达 3讨论 2?7不同时相点各组大鼠肾脏HIF1”的表达见图2,3.结自体或异体EPC体外扩增后通过静 脉注射或局部注射 果显示,HIF1a主要表达在肾小管,正常对照仅有少量表达,主给活体动物,可成功归巢到缺血 组织,参与组织的修复.这 重庆医学2009年l2月第38卷第24期 些研究主要集在心,脑和外J古j廊管疾病.在肾脏,Chade 等发现在实验性慢性肾m管疾病模型白体EPCs移植后, EPCs改善了肾脏组织学和功能.有研究发现肾血管性高皿 压促进了EPCs动员,急性肾缺血后,EPCs能聚集到损伤部 位,并通过分化为血管内皮和旁分泌作用参损伤的修复”j. 由此可见,EPCs能参与肾脏损伤后的修复,在慢性肾脏病, EPCs数艟减少,功能缺J{f=j/2].放通过体外扩增EPCs,移植入 CKI)内能改善由于疾病状态FEICs功能的缺陷和数世的不 足,从促进损伤组织的修复.应用_十细胞因子和/或粒细胞 集落刺激因子虽方法简单,但冈动员的细胞不仅仅是EPCs,还 有其他的细胞,甚至包括成纤维细胞f细胞rla141,冈『f【i可能导 致纤维化的加重,[大1此单纯的EPCs移植显示出独特的优势. 作者的研究发现,UUO术后第l4火和第21灭,移植组的 问质病变病理积分均低于Uu0组(P<0.05).提示通过 EPCs移植后,能减轻UUO模型肾质损伤.研究中作者还 发现,术后7d,UUO组和移植组肾最/体质量显着增加,这与 ujJ旺水肿和增反应一致,随后U【JO组肾重/体质付下降, 移植组虽仃下降,但高于UUO组,这与EPCs移植后病理损伤 减轻一致uu()组和移植组在术后7d,血清尿素氮,肌酐水 平与假手术比寿井均有统计学意义(P<O.05),但迅速恢复 正常.分析原是该模为单侧输尿管结扎,急悱梗后对侧 肾脏迅速代偿,早期存在代偿不完全,出现一过性的肌酐,尿素 氮增加,随着机体适应性反应,完全代偿,肾功能恢复正常,这 并不受EPCs移植的影响. c(-SMA被认为是肌成纤维细胞的标志,显示了成纤维细 胞的活化和上皮问充质转分化(epithelial—mesenchymaltrans— formation,EMT),这些细胞能分泌大量的胶原和纤维连接蛋 白,参与问质纤维化.作者的研究发现UUO组—SMA在 第7天已经开始增加,在第14,2】天显着高于财照组,定位显 示在小管细胞和问质均有表达.移植组表达仍强于假手术组, 但显着低于uu()组.结果提示EPCs移植减轻了EMT和问 质成纤维细胞的活化,闪而能改善间质纤维化. 低氧诱导因子(hypoxicinduciblefactor1,HIF)足机体低 氧适应性反应的转录调控因子,在低氧条件下稳定表达,而在 常氧条件下迅速泛素化降解,一定程度上反应了低氧的存在. 作者的研究发现,UU()模型随病程进展,HIF表达增加,在第 2l天表达最强.EPCs移植后,HIF的表达有下降,但仍显着 高于假手术组.结果提示在UUO模型确实存在低氧,随病程 进展,低氧逐渐加重.EPCs移植后改善了低氧,HIF表达下 降,为进一步探讨EPCs移植参与问质血管修复提供了依 据,EP(s可能参与肾脏微循环的重建,改善问质低氧,从 而修复了UUO模型肾脏间质的损伤. 参考文献 [1] E2} SamuelN,HeymanI,MogherKhamaisi,eta1.Hypoxia responseandtheprogressionofchronickidneydisease _J].AmJNepbrol,2008,28:998. 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