【word】 外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂合性缺失、微卫星不稳定性观察
外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂
合性缺失、微卫星不稳定性观察
山东医药2012年第52卷第2期
外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因
杂合性缺失,微卫星不稳定性观察
范余娟,蒙亚晴,杨开选,徐红
(1广西医科大学第一附属医院,南宁530021;2四川大学华西第二医院)
摘要:目的观察外阴鳞癌(VSCC)组织中HPV感染情况及脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的杂合性缺失
(LOH),微卫星不稳定性(MSI),并探讨其意义.方法选取VSCC组织24例,外阴尖锐湿疣(VCA)42例,正常外
阴组织20例,用PCR法检测上述组织中的HPV6,11,16,18,31,33亚型,用PCR一单链构像多态性分析(PCR-SSCP)
法检测FHIT基因D3S1300位点的LOH和MSI.结果在正常外阴,VCA,VSCC组织中低危型HPV(HPV6/11)阳
性分别为2,38,21例,高危型HPV(HPV16/18/31/33)阳性分别为0,13,10例;VCA,VSCC组织与正常外阴组织比
<0.05.在正常外阴,VCA,VSCC组织中,FHIT基因D3S1300 较,P均
位点上LOH,MSI阳性分别为0,9,13例,
VSCC与VCA,正常外阴组织比较,P均<0.05.VSCC组织中
HR—HPV感染与FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI
相关(r=0.438,P<0.05).结论VSCC组织中存在较高的低危型,高危
型HPV复合感染及FHIT基因LOH和
(或)lVISI;二者在VSCC的发生发展中发挥重要作用.
关键词:人乳头瘤病毒;脆性组氨酸三联体基因;杂合性缺失;微卫星
不稳定性.夕阴鳞癌;外阴尖锐湿疣
中图分类号:R737.3文献标志码:A文章编
号:1002-266X(2012)02-0021-03
ObservationofHPVinfectionandlossofheterozygosity,microsatelliteinstability
offFHITgeneinvulvarsquamouseellcarcinomatissue
FANYuuanl.
MENGY口一qing,YANGKai—xuan,XUHong
(1FirstAffilicatedHospital,GuangxiMedicalUnivenity,Nanning530021,P.R.China)
Abstract:ObjectiveToobserveHPVinfectionandlossofheterozygosity(LOH),microsatelliteinstability(isi)on
FHITgeneinvulvarsquamouscellcarcinomatissue,andexploreitssignificance.MethodsHPVDNA6,l1,16,18,31,
33weredetectedbyPCRinVSCC(24cases),VCA(42cases)andnormalvulva(20cases).PCR—SSCPwasusedtode-
tecttheLOH,MSIforamplificationwithD3S1300onFHITgene.ResultsInnormalvulva,VCAandVSCCgroups,the
numberofpatientswithLR—HPV(HPV6/11)were2,38and21cases,andHR
—HPV(HPV16,18,31,33)infectionwere
0.13and10cases,therewerestatisticssignificantdifferencesbetweennormalvulvaandVCA,normalvulvaandVSCC(all
P<0.05).Innormalvulva,VCAandVSCCgroups,thenumberofLOHandMS!positiveonD3S1300were0,9,13cases
respectively,therewerestatisticssignificantdifferencesbetweenVSCCandVCA,VSCCandnormalvulva(allP<0.05).
HR—HPVinfectionswerepossiblyrelevanttotheLOHand/orMSIOllFHITgene(therelatedcoefficientwas0.438.P<
O.05)inVSCC.ConclusionInVSCC,therearehighLR—HPVandHR—HP
VcoinfeetionandhighLOH,MSIonFHIT
gene;bothplayimportantrolesinthecarcinogenesisofVSCC.
Keywords:humanpapillomavims;fragilehistidinetriadgene;lossofhaterozygosity;microsatelliteintabihity;vulva
squamouscellcancer;vulvacondylomaacuminatum
脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一种候选抑
癌基因,恶性肿瘤及其癌前病变组织中常存在FHIT
基因异常,如杂合性缺失(LOH),微卫星不稳定性
(MSI)等,与人乳头瘤病毒(HPV)感染可能有
关_l”j.高危型人乳头瘤病毒(HR—HPV)与宫颈癌
和宫颈上皮内瘤变有关,包括HPV16,18,31,33,
基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自0640106).
通讯作者
35,39,45,5l,52,56,58,59,68等亚型;低危型人乳
头病病毒(LR.HPV)与外生殖器尖锐湿疣等良性病
变有关,包括HPV6,11,42,43,44,54亚型等J.
2006—2010年,我们观察了外阴鳞癌(VSCC)组织
中HPV6,11,16,18,31,33基因型别感染情况及
FHIT基因的LOH,MSI,探讨二者在VSCC发展中的
作用及相互关系.
1材料与方法
21
1.1材料选取2004,2008年经病理确诊的24
例VSCC及42例外阴尖锐湿疣(VCA)患者的病变
组织蜡块,以外阴良性病变切除的正常外阴组织20
例作为对照;试剂为dNTP,Taq酶;FHIT基因
D3S1300位点引物核苷酸序列:F为5,_AGCTCA—
CATrCTAGTCAGCCT一3,R为5一GCCAATrCCCCA—
GATG~,产物片段长度为217,241bp.HPV6,11,
16,18,31,33亚型引物核苷酸序列,见表1,由上海
生工生物
技术服务有限公司合成.
表1HPV亚型引物核苷酸序列
HPV亚型引物序列产物片段
山东医药2012年第52卷第2期
上记为L0H.
1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件.组间
比较用X检验或Fisher精确概率法,相关性分析用
Spearman等级相关分析法.P40.05为差异有统计
学意义.
2结果
在正常外阴,VCA,VSCC组织中HR—HPV
(HPV6/11)阳性分别为2,38,21例,HR.HPV
(HPV16/18/31/33)阳性分别为为0,13,10例;
VCA,VSCC组织与正常外阴组织比较,P均<0.05.
HPV的PCR产物扩增电泳图,见图1.
长度(bp)MHPv6HPv1lHPvl6HPvl8HPv3lHPv33
1.2HPV感染与FHIT基因LOH,MSI检测方法
用PCR法检测HPV6,11,16,18,31,33亚型,用
PCR一单链构像多态性分析(PCR.SSCP)法检测FHIT
基因D3S1300位点的LOH和MSI.采用标准酚一
氯仿一异戊醇法抽提组织DNA,TE溶解后4?保
存备用.PCR扩增体系(25IxL):DNA模板100,
200ng,引物各0.5mmolfL,每种dNTP各200
mol/L,Taq酶1U.反应条件:94?预变性5rain;
35个循环的94?变性30S,53.6?(D3S1300,
HPV6,11为50.9?,HPV16,18为52.3?,
HPV31,33为47.6oC)退火30S,72?延伸30S;72
?再延伸5min.结束后经2%琼脂糖凝胶电泳鉴
定扩增产物.根据HPV扩增产物的相应长度判断
亚型结果(HPV6,11,HPVl6,18,HPV31,33扩增长
度分别为263,144,471,268,448,462bp).取
D3S1300扩增的PCR产物,变性后于12%非变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色并观察结果.若病
变组织比病变旁组织条带增多,位置改变或浓度增
加等记为MSI;若条带消失或相对密度减少50%以
22
图1HPV各型的PCR产物
在正常外阴,VCA,VSCC组织中,FHIT基因
D3S1300位点上LOH,MSI阳性分别0,9,13例;
VSCC与VCA,正常外阴组织比较,P均<0.05.
FHIT基因D3S1300位点PCR产物扩增见图2,
PCR.SSCP电泳图见图3.
600be
500be
400bp
300bp
200be
100blp
图2D3S1300PCR产物
NT
3a3b
图3LOH和MSI
注:T:肿瘤组织,N:癌旁组织;3a:LOH阳性,3b:MSI阳性
相关分析显示,VSCC组织中HR.HPV感染与
FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI相关(r:0.438,
P<0.05),LR—HPV与FHIT基因LOH/MSI不相关
(r=0.158,P<0.05).VCA组织中LR-HPV及
HR.HPV感染与FHIT基因LOH/MSI均不相关(r
分别为0.169,0.027,P均<0.05).
3讨论
自从1996年发现FHIT基因以来,大量研究发
现FHIT基因在头颈部恶性肿瘤,肺癌,消化道恶性
—U—U—UOO0?如??加
山东医药2012年第52卷第2期
肿瘤,乳腺癌及宫颈癌等各类恶性肿瘤中存在广泛
异常,提示FHIT基因与恶性肿瘤的发生发展有关.
恶性肿瘤及其癌前病变组织中FHIT基因的异常与
HPV感染可能有关.
林云等研究发现,在VSCC中HPV16/18的
感染率比正常对照组高,提示HPV感染可能在
VSCC发生发展中起一定作用.本研究结果显示,
VSCC和VCA中均存在LR.HPV和HR.HPV的复合
感染,且二者比较并无统计学差异.目前,尚无证据
表明HR—HPV感染与VSCC的发生相关.
本研究结果显示,VSCC组织中FHIT基因
D3S1300位点LOH,MSI阳性率为54.2%,表明
FHIT基因广泛出现异常,与其他报道一致?;
VCA组织中也已出现FHIT的异常(阳性率为
21.4%),但较VSCC低(P<0.05).这提示FHIT
基因异常与VSCC发生可能相关,VCA可能是
VSCC的前期病变,FHIT基因异常可能是VSCC癌
前病变的分子标志.D3S1300位点位于FHIT基因
第1编码外显子(E5)附近,该位点出现高频率的
LOH和(或)MSI与FHIT基因异常转录本中E5的
缺失相吻合,提示FHIT基因缺失在VSCC中较常
见.
3p14.2,3p21被认为是LOH集中发生的亚区
域,而FHIT基因定位于3p14.2.有研究者认为,
HPV病毒可直接整合到FHIT基因脆性位点,引起
染色体基因组的不稳定,这可能是HR—HPV致癌的
机制之一.Buher等研究发现,FHIT基因LOH与
HPV16,31感染有显着相关性;而有研究发现,
FHIT基因突变与HPV感染无关,二者是参与宫颈
癌发生的两个独立致病因素.本研究结果表明,在
VSCC组织中FHIT基因LOH/MSI与HR.HPV感染
有关,提示其感染可能是FHIT基因LOH和(或)
MSI发生的因素.另外,本研究结果仅反映出FHIT
基因片段的LOH和(或)MSI与VSCC的发生有关,
不能证实其改变是癌前病变或早期诊断的分子标志
物,还是参与VSCC进展的晚期事件,或作为判定患
者预后的指标.因此,还有必要扩大样本量,进一步
明确FHIT基因的异常在VSCC中的生物学作用以
及与其他因素的关系.
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(收稿日期:2011-10-05)
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