【word】 外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂合性缺失、微卫星不稳定性观察

【word】 外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂合性缺失、微卫星不稳定性观察 外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因杂 合性缺失、微卫星不稳定性观察 山东医药2012年第52卷第2期 外阴鳞癌组织中HPV检测及FHIT基因 杂合性缺失,微卫星不稳定性观察 范余娟,蒙亚晴,杨开选,徐红 (1广西医科大学第一附属医院,南宁530021;2四川大学华西第二医院) 摘要:目的观察外阴鳞癌(VSCC)组织中HPV感染情况及脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的杂合性缺失 (LOH),微卫星不稳定性(MSI),并探讨其意义.方法选取VSCC组织24例,外阴尖锐湿疣(VCA)42例,正常外 阴组织20例,用PCR法检测上述组织中的HPV6,11,16,18,31,33亚型,用PCR一单链构像多态性分析(PCR-SSCP) 法检测FHIT基因D3S1300位点的LOH和MSI.结果在正常外阴,VCA,VSCC组织中低危型HPV(HPV6/11)阳 性分别为2,38,21例,高危型HPV(HPV16/18/31/33)阳性分别为0,13,10例;VCA,VSCC组织与正常外阴组织比 <0.05.在正常外阴,VCA,VSCC组织中,FHIT基因D3S1300 较,P均 位点上LOH,MSI阳性分别为0,9,13例, VSCC与VCA,正常外阴组织比较,P均<0.05.VSCC组织中 HR—HPV感染与FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI 相关(r=0.438,P<0.05).结论VSCC组织中存在较高的低危型,高危 型HPV复合感染及FHIT基因LOH和 (或)lVISI;二者在VSCC的发生发展中发挥重要作用. 关键词:人乳头瘤病毒;脆性组氨酸三联体基因;杂合性缺失;微卫星 不稳定性.夕阴鳞癌;外阴尖锐湿疣 中图分类号:R737.3文献标志码:A文章编 号:1002-266X(2012)02-0021-03 ObservationofHPVinfectionandlossofheterozygosity,microsatelliteinstability offFHITgeneinvulvarsquamouseellcarcinomatissue FANYuuanl. MENGY口一qing,YANGKai—xuan,XUHong (1FirstAffilicatedHospital,GuangxiMedicalUnivenity,Nanning530021,P.R.China) Abstract:ObjectiveToobserveHPVinfectionandlossofheterozygosity(LOH),microsatelliteinstability(isi)on FHITgeneinvulvarsquamouscellcarcinomatissue,andexploreitssignificance.MethodsHPVDNA6,l1,16,18,31, 33weredetectedbyPCRinVSCC(24cases),VCA(42cases)andnormalvulva(20cases).PCR—SSCPwasusedtode- tecttheLOH,MSIforamplificationwithD3S1300onFHITgene.ResultsInnormalvulva,VCAandVSCCgroups,the numberofpatientswithLR—HPV(HPV6/11)were2,38and21cases,andHR —HPV(HPV16,18,31,33)infectionwere 0.13and10cases,therewerestatisticssignificantdifferencesbetweennormalvulvaandVCA,normalvulvaandVSCC(all P<0.05).Innormalvulva,VCAandVSCCgroups,thenumberofLOHandMS!positiveonD3S1300were0,9,13cases respectively,therewerestatisticssignificantdifferencesbetweenVSCCandVCA,VSCCandnormalvulva(allP<0.05). HR—HPVinfectionswerepossiblyrelevanttotheLOHand/orMSIOllFHITgene(therelatedcoefficientwas0.438.P< O.05)inVSCC.ConclusionInVSCC,therearehighLR—HPVandHR—HP VcoinfeetionandhighLOH,MSIonFHIT gene;bothplayimportantrolesinthecarcinogenesisofVSCC. Keywords:humanpapillomavims;fragilehistidinetriadgene;lossofhaterozygosity;microsatelliteintabihity;vulva squamouscellcancer;vulvacondylomaacuminatum 脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一种候选抑 癌基因,恶性肿瘤及其癌前病变组织中常存在FHIT 基因异常,如杂合性缺失(LOH),微卫星不稳定性 (MSI)等,与人乳头瘤病毒(HPV)感染可能有 关_l”j.高危型人乳头瘤病毒(HR—HPV)与宫颈癌 和宫颈上皮内瘤变有关,包括HPV16,18,31,33, 基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自0640106). 通讯作者 35,39,45,5l,52,56,58,59,68等亚型;低危型人乳 头病病毒(LR.HPV)与外生殖器尖锐湿疣等良性病 变有关,包括HPV6,11,42,43,44,54亚型等J. 2006—2010年,我们观察了外阴鳞癌(VSCC)组织 中HPV6,11,16,18,31,33基因型别感染情况及 FHIT基因的LOH,MSI,探讨二者在VSCC发展中的 作用及相互关系. 1材料与方法 21 1.1材料选取2004,2008年经病理确诊的24 例VSCC及42例外阴尖锐湿疣(VCA)患者的病变 组织蜡块,以外阴良性病变切除的正常外阴组织20 例作为对照;试剂为dNTP,Taq酶;FHIT基因 D3S1300位点引物核苷酸序列:F为5,_AGCTCA— CATrCTAGTCAGCCT一3,R为5一GCCAATrCCCCA— GATG~,产物片段长度为217,241bp.HPV6,11, 16,18,31,33亚型引物核苷酸序列,见表1,由上海 生工生物技术服务有限公司合成. 表1HPV亚型引物核苷酸序列 HPV亚型引物序列产物片段 山东医药2012年第52卷第2期 上记为L0H. 1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件.组间 比较用X检验或Fisher精确概率法,相关性分析用 Spearman等级相关分析法.P40.05为差异有统计 学意义. 2结果 在正常外阴,VCA,VSCC组织中HR—HPV (HPV6/11)阳性分别为2,38,21例,HR.HPV (HPV16/18/31/33)阳性分别为为0,13,10例; VCA,VSCC组织与正常外阴组织比较,P均<0.05. HPV的PCR产物扩增电泳图,见图1. 长度(bp)MHPv6HPv1lHPvl6HPvl8HPv3lHPv33 1.2HPV感染与FHIT基因LOH,MSI检测方法 用PCR法检测HPV6,11,16,18,31,33亚型,用 PCR一单链构像多态性分析(PCR.SSCP)法检测FHIT 基因D3S1300位点的LOH和MSI.采用标准酚一 氯仿一异戊醇法抽提组织DNA,TE溶解后4?保 存备用.PCR扩增体系(25IxL):DNA模板100, 200ng,引物各0.5mmolfL,每种dNTP各200 mol/L,Taq酶1U.反应条件:94?预变性5rain; 35个循环的94?变性30S,53.6?(D3S1300, HPV6,11为50.9?,HPV16,18为52.3?, HPV31,33为47.6oC)退火30S,72?延伸30S;72 ?再延伸5min.结束后经2%琼脂糖凝胶电泳鉴 定扩增产物.根据HPV扩增产物的相应长度判断 亚型结果(HPV6,11,HPVl6,18,HPV31,33扩增长 度分别为263,144,471,268,448,462bp).取 D3S1300扩增的PCR产物,变性后于12%非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色并观察结果.若病 变组织比病变旁组织条带增多,位置改变或浓度增 加等记为MSI;若条带消失或相对密度减少50%以 22 图1HPV各型的PCR产物 在正常外阴,VCA,VSCC组织中,FHIT基因 D3S1300位点上LOH,MSI阳性分别0,9,13例; VSCC与VCA,正常外阴组织比较,P均<0.05. FHIT基因D3S1300位点PCR产物扩增见图2, PCR.SSCP电泳图见图3. 600be 500be 400bp 300bp 200be 100blp 图2D3S1300PCR产物 NT 3a3b 图3LOH和MSI 注:T:肿瘤组织,N:癌旁组织;3a:LOH阳性,3b:MSI阳性 相关分析显示,VSCC组织中HR.HPV感染与 FHIT基因D3S1300位点LOH/MSI相关(r:0.438, P<0.05),LR—HPV与FHIT基因LOH/MSI不相关 (r=0.158,P<0.05).VCA组织中LR-HPV及 HR.HPV感染与FHIT基因LOH/MSI均不相关(r 分别为0.169,0.027,P均<0.05). 3讨论 自从1996年发现FHIT基因以来,大量研究发 现FHIT基因在头颈部恶性肿瘤,肺癌,消化道恶性 —U—U—UOO0?如??加 山东医药2012年第52卷第2期 肿瘤,乳腺癌及宫颈癌等各类恶性肿瘤中存在广泛 异常,提示FHIT基因与恶性肿瘤的发生发展有关. 恶性肿瘤及其癌前病变组织中FHIT基因的异常与 HPV感染可能有关. 林云等研究发现,在VSCC中HPV16/18的 感染率比正常对照组高,提示HPV感染可能在 VSCC发生发展中起一定作用.本研究结果显示, VSCC和VCA中均存在LR.HPV和HR.HPV的复合 感染,且二者比较并无统计学差异.目前,尚无证据 表明HR—HPV感染与VSCC的发生相关. 本研究结果显示,VSCC组织中FHIT基因 D3S1300位点LOH,MSI阳性率为54.2%,表明 FHIT基因广泛出现异常,与其他报道一致?; VCA组织中也已出现FHIT的异常(阳性率为 21.4%),但较VSCC低(P<0.05).这提示FHIT 基因异常与VSCC发生可能相关,VCA可能是 VSCC的前期病变,FHIT基因异常可能是VSCC癌 前病变的分子标志.D3S1300位点位于FHIT基因 第1编码外显子(E5)附近,该位点出现高频率的 LOH和(或)MSI与FHIT基因异常转录本中E5的 缺失相吻合,提示FHIT基因缺失在VSCC中较常 见. 3p14.2,3p21被认为是LOH集中发生的亚区 域,而FHIT基因定位于3p14.2.有研究者认为, HPV病毒可直接整合到FHIT基因脆性位点,引起 染色体基因组的不稳定,这可能是HR—HPV致癌的 机制之一.Buher等研究发现,FHIT基因LOH与 HPV16,31感染有显着相关性;而有研究发现, FHIT基因突变与HPV感染无关,二者是参与宫颈 癌发生的两个独立致病因素.本研究结果表明,在 VSCC组织中FHIT基因LOH/MSI与HR.HPV感染 有关,提示其感染可能是FHIT基因LOH和(或) MSI发生的因素.另外,本研究结果仅反映出FHIT 基因片段的LOH和(或)MSI与VSCC的发生有关, 不能证实其改变是癌前病变或早期诊断的分子标志 物,还是参与VSCC进展的晚期事件,或作为判定患 者预后的指标.因此,还有必要扩大样本量,进一步 明确FHIT基因的异常在VSCC中的生物学作用以 及与其他因素的关系. 参考文献: [1]shyh—KuanTai,JanetI.Lossofflfitexpressioninheadandneck squamouscellcarcinomaanditspotentialclinicalimplication[J]. 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