黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的影响因素
黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚
胎发育的影响因素
第25卷第2期
2006年4月
华中农业大学学报
journalofHuazhongAgriculturalUniversity
V01.25No.2
Apr.2006,153~158
文章编号1000—2421(2006)02—0153—06
黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及
早期胚胎发育的影响因素
龙翔?余荣?耿利英周木清.熊家军?杨利国h
(“南京农业大学动物繁育研究所,南京210095;华中农业大学动物科技学院,武汉430070~
武汉开隆高新农业发展有限公司,武汉430345)
摘要从屠宰场收集黄牛卵巢,取皮质深层卵母细胞进行体外成熟,体外受精和早期胚胎体外培养,分析影
响其效果的因素.结果
明,在成熟培养液中添加促卵泡素(FSH)(10IU/mL),人绒毛膜促性腺激素(HCG)
(20IU/mL)和17雌二醇(17)(1~/mL)对卵母细胞受精后早期胚胎发育能力有极显着的促进作用.等
量牛卵泡液(BFF)与初生犊牛血清(NCS)效果差异不显着,以添加15BFF为最宜.颗粒细胞与输卵管上皮
细胞均能显着提高卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎的发育率,颗粒细胞+输卵管上皮细胞对克服胚胎阻滞现
象效果最显着.
关键词卵母细胞;体外受精;胚胎
中图法分类号S823.3文献标识码A
随着胚胎移植技术的推广应用,体外受精,核移
植,转基因等胚胎
技术取得了很大进展,进而对
牛胚胎的需求量日益增加l】].迄今,这些技术主要
利用具有完全发育能力的卵母细胞进行体外受精,
而对卵巢皮质内数量众多的直径小于2mm卵泡内
卵母细胞并未得到充分利用.为了扩大优质卵母细
胞的来源,最大限度地发挥优良母牛的遗传潜力,一
些学者对腔前卵泡卵母细胞进行了研究,初步证实
腔前卵泡在体外具有一定的发育能力,但要发育到
成熟卵母细胞,需要相当长的时间l2_引.
所有哺乳动物在胚胎发育时期约有3O万个卵
母细胞,但在自然繁殖条件下牛一生只有6,8个卵
母细胞被利用,随着个体的生长发育和卵泡的发育,
可被利用的卵母细胞逐渐减少[6].为了充分利用潜
在的牛卵母细胞资源,本研究以来源广泛的黄牛卵
巢内直径小于2mm卵泡卵母细胞为模型,从激素
种类,用量等方面分析影响直径小于2mm卵泡卵
母细胞体外成熟,体外受精及其早期胚胎发育的因
素,旨在为建立牛小腔卵泡卵母细胞体外培养,体外
受精及其受精卵体外培养的
奠定基础,为实施
奶牛和肉牛体细胞克隆,生物反应器等胚胎工程技
术提供大量受体卵.
1材料与方法
1.1卵巢处理与卵母细胞的获取
从武汉清真牛羊加工公司屠宰车间取刚屠宰后
的黄牛卵巢,置于装有38?灭菌生理盐水的保温瓶
中,在2h内带回实验室.随后,去除卵巢周围脂肪
组织及系膜,用灭菌生理盐水冲洗卵巢至无血为止,
用带l6#针头的注射器吸除卵巢表面直径大于
2mm卵泡后,用灭菌吸水纸吸干,备用.
将采过表面卵泡的卵巢置于8cm培养皿内,用
手术刀片对卵巢皮质进行纵横方向l,2mm间距
切割,然后用含lO9,6新生牛血清(NCS,GIBCO,
1121073)的D-PBS液反复冲洗,去除组织块,在培
养箱中静置5,10min,置体视显微镜下检出卵丘
卵母细胞复合体(COCs).
1.2卵母细胞体外成熟
选择卵胞质均匀,包被完整卵丘细胞的卵母细
收稿日期:2005-07-04
*国家三峡移民科技开发专项(2002EP090019),湖北省自然科学基金项目(2005ABA147),武
汉市攻关项目(20022005132—19)资助
**通讯作者.E-mail:ylg@mail.hzau.edu.on)Tel:027—87281813
龙翔,男,1972年生,讲师,南京农业大学动物遗传育种与繁殖专业硕士研究生,南京
210095.E-maihlongxiang402460(~163.cOm
华中农业大学学报第25卷
胞,用成熟培养液洗涤3,4次,转人预孵2h的
IVM微滴中,每个微滴转人卵母细胞1O枚,置于
38.5?,5COz,饱和湿度的CO2培养箱中进行成
熟培养.
按参考文献1-71中的方法,在受精前2h用成熟
培养液制作体外成熟(IVM)微滴,用含肝素钠(Jz
海伯奥,010903)的BO液制作体外受精(IVF)微
滴.BO液组成及含量(g/I):NaCl6.5500,KC1
0.3000,CaCI20.2429,Nail2PO,?12H2O0.2929,
MgCI2?6H2O0.1060,NaHCO~3.1040,葡萄糖
2.5000,丙酮酸钠0.1375,BSA3.0000,青霉素
0.0310,最后用蒸馏水溶解至1000mI.
1.3精子体外获能与体外受精
取2支黄牛细管冻精快速解冻后,采用上浮法
收集精子,用精子洗涤液(含咖啡因3.884mg/mI
的BO液)离心(1500r/min,10min)洗涤2次后,
在获能液(BO液+0.01mg/mI肝素钠)中获能
30min.
取50I精子悬浮液加至已预孵2h的受精微
滴中,将培养24h的卵母细胞用成熟培养液洗涤
3,4次,转人受精微滴中,每1微滴转人10,15枚
卵母细胞.8,10h后将与精子悬浮液共培养的卵
母细胞转人胚胎培养液(含50t~mol/I牛磺酸,上
海伯奥,030918)中,每24h按半量换液,48h后开
始统计卵裂率.
1.4颗粒细胞单层的制备
在15mI规格离心管中加人吸除卵母细胞的
颗粒细胞液和4mIM199液及2mI0.2透明质
酸酶(Sigma,030224)溶液,5min后,离心
(1800r/min,5min),弃除上清,加人适量的成熟
培养液洗涤3次,使颗粒细胞终浓度为1x10
个/mI.吸取10I该液,加人已在COz培养箱中
平衡好的培养液微滴中,使其终浓度为1x10.,
2x10个/mI.置CO.培养箱中培养32,48h备
用.
1.5牛卵泡液(BFF)的制备
用一次性注射器抽取卵巢表面上直径为2,
6mm的卵泡液,离心(1800r/min)5~10min,吸取
上清液,重复洗涤,离心1次,吸取上清液,然后分装
于Eppendorf管,在--20?下冷冻保存备用.
1.6输卵管上皮细胞单层的制备
将牛输卵管用35~37?灭菌生理盐水洗3,4
次,剪除纤维组织,用灭菌生理盐水洗3次,纵向剪
开,分别用灭菌生理盐水和0.76EDTA(Sigma,
030712)溶液洗3次,置0.76EDTA液中培养
1.5,2.0h,再用成熟培养液洗3次,然后用灭菌玻
片轻轻刮取输卵管上皮组织,收集刮取物于离心管
内,用成熟培养液离心(2000r/min,每次5min)并
洗涤2次;弃上清液,沉淀物用培养液稀释(5xl0
个/mI),吸取10I输卵管上皮细胞悬浮液,注人
于C()z培养箱预平衡2h的卵母细胞成熟培养液滴
中(100luI/滴),置CO2培养箱继续培养[8].
1.7试验设计
1)激素对卵母细胞体外成熟与体外受精的影
响.对照组卵母细胞体外成熟用M199液(GIB(,0,
1204859)和10oANCS进行培养,试验组在此基础上
除添加10IU/mIFSH(030406)和1t~g/mI17la-
E2(天津金耀,0303061)外,还添加15IU/mILH
(030428),10IU/mIIH或20IU/mIHOG
(030226)(以上3种激素均购自宁波激素二厂).卵
母细胞体外成熟受精后,转人胚胎培养微滴(M199
液+10FCS+50t~mol/I牛磺酸)中培养.
2)卵泡液对体外受精胚发育的影响.试验一
以M199液+10IU/mIFSH+20IU/mIHCG+
1t~g/mI17f}-E2为基础液,以添加10NCS为对
照组,以添加10BFF为试验组.试验二以上述
基础液为对照组,试验组则在基础液中添加各种浓
度(5,10,15,20)的BFF液,用于培养.卵
母细胞体外成熟受精后转人各组相对应胚胎培养微
滴中培养(各组胚胎培养液为各自未添加激素的成
熟培养液+50t~mol/I牛磺酸).
3)细胞因子对体外受精和早期胚胎发育的影
响.本试验在卵母细胞体外成熟条件相同的前提
下,将受精卵的培养共分为4组,对照组用基础培养
液(M199液+10FCS+50t~mol/I牛磺酸)培养,
试验组用单层颗粒细胞培养微滴(MGC组),单层
输卵管上皮细胞培养微滴(MOEC组)培养,或先在
单层颗粒细胞培养微滴中培养,待胚胎发育至6一,
8一细胞后,再转人单层输卵管上皮细胞培养微滴中
继续培养(MGC+MOEC组).
1.8数据分析
卵母细胞在体外受精培养48h后,观察卵裂
数,以后每天观察胚胎发育情况,统计发育至各阶段
的胚胎数.体外受精率以卵裂率,即发生卵裂的胚
胎数占培养的卵母细胞总数的百分比计算,胚胎发
育率以检出的4一,8一细胞胚胎数或桑椹胚数占卵裂
第2期龙翔等:黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的影响因素155
胚胎数的百分比表示.各组间的百分数值统计差异
比较,采用检验.
2结果
2.1激素对卵母细胞体外成熟与受精及早期胚胎
发育的影响
用基础液(M199+10NCS)培养的卵母细胞
(图1)中,只有29.8受精(发生卵裂,图2),其中,
38.7的受精卵发育至4一细胞(图3),8一细胞期
图1培养24h的牛卵母细胞
Fig.1Abovineoocytecultivatedfor
24hoursinvitrofLeica.BFX100)
(图4),发育至桑椹胚的胚胎只占受精卵总数的
l6.】%.相反,在基础培养液中添加IH或HCG
进行培养的329枚卵母细胞中,受精率达34.7,
其中77.2的受精卵发育至4一,8一细胞期,45.6
的受精卵发育至桑椹胚(图5).比较在基础培养液
中添加的激素种类和剂量对体外受精和胚胎发育的
影响,发现卵裂率和桑椹胚发育率以HCG处理组
最高(分别为38.0和50.0),4一----8一细胞胚胎发
育率以15IU/mIIH处理组最高(80.6,表1).
图2牛2.细胞胚
Fig.2Abovineembryoat2-~llstage
fLeica,BF×400】
表1LH和HoG及LH剂量对牛卵母细胞体外成熟和受精及早期胚胎发育的影响?
TablelEffectofsupplementsofluteinizingl10mloI.e(LII),humanchorionlcgonadotropin(HCC}and
LHcontentonnmturationandfertilizationofoocytesandearlydevelopmentof锄bry0sinvitroincattle
1)同列百分数与基础培养液组比较.肩首字母相同,且均为大写或小写,表示统计差异不显着(P>O.05),字母不同?且均为大写,表示
统计差异显着(P<O.05);字母不同.且均为小写.表示统计差异极显着(P<O.01);基础液为M199q-10~NCS
Valuesn1arkedindifferentcapitalsindicatesignificancelevelofstatisticdifferenceP>0.05?andvalu
esindifferentsmalllettersrepre—
sentthesignificancelevelP(O.O1,ascomparedwiththosetreatedwithbasicmedium;?BasicmediumcontainslOneonatecalfserum
inTCM199medium.
2.2BFF对卵母细胞体外受精后早期胚胎发育的
影响
卵母细胞成熟液以M199液+10IU/mI
FSH+20IU/mIHCG+1t~g/mI1713-E~为基础
液,胚胎培养液以M199液-t-10~50~mol/I牛磺
酸为基础液,比较在基础液中添加l0BFF或l0
NCS的效果.结果发现,在基础液中添加10~BFF
与添加10NCS相比,体外受精卵发育至桑椹胚的
比率以BFF组最高(P<0.05),但卵裂率和4一,8一
细胞胚发育率在2组间没有差异(P>0.05)(图6).
华中农业大学学报第25卷
图3牛4.细胞胚
Fig.3Abovineern)at
4-cellstage
(Leica.EFX400)
图4牛8-细胞胚
Fig.4Abovineerrt)at
8-cellstage
(Leica.BFX400)
图5牛桑葚胚(左)和晚期桑葚胚(右)
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断
NCS雪”雪lr]
ilil雪l_雪.:..冒?:
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4.X
埽
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蒙删毕M0mb
洲tJ怕.Ass~sncnt|~ranct~rs
图6培养液中添加BFF和NCS对牛卵母细胞体外受精及
早期胚胎发育的影响(*表示组间差异显着.P<O.05)
Fig.6Effectofsupplementsofbovinefollicularfluidand
neonatecalfserumoninvitrofertilizationand
earlyembryodevelopmentofthecattle
卵母细胞成熟基础液和胚胎培养基础液与上述
相同,然后在基础液中添加不同浓度的BFF液,结
果发现,在基础液中添加各种比例BFF的423枚卵
母细胞中,卵裂率为36.17,其中77.78发育至
4一,8一细胞胚,55.56发育至桑葚胚,极显着高于
基础液组.
比较添加各种浓度BFF的效果,发现以添加
15BFF效果最佳,其卵裂率,4-,8一细胞胚及桑葚
胚发育率均显着高于添加5,1OBFF组;在基础
液中添加15BFF,卵裂率,4一,8一细胞胚发育率与
Fig.5Abovineembryoatmorular(1eft)and添加2O9/6BFF差异不显着,但桑葚胚发育率显着高
latemc~lar(right)fLeica,LMC40X400)stage于2OBFF组(表2).
表2不同浓度BFF对小腔卵泡卵母细胞体外受精后早期胚胎发育的影响
Table2Effectofbovinefollidefluid(BW)contentsonearlydevelopmentof
invitrofertilizedoocytesfrominteriorfolliclesofCOWS
2.3细胞因子对卵母细胞体外受精后早期胚胎发
育的影响
将体外受精后的卵母细胞转入4种不同培养体
系中进行培养,结果发现卵裂率差异不明显;进入4一
细胞期以后,4种培养体系开始出现明显差异.各种
细胞因子组桑葚胚的发育率均极显着高于基础培养
液组;MOEC组,MGC+MOEC组4一,8一细胞胚与桑
葚胚发育率均显着高于MGC组;MOEC+MGC组桑
葚胚发育率优于MOEC组,但未达到显着水平
(表3).
3讨论
3.1激素对卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎发
育的影响
在卵母细胞]VF过程中,激素发挥着重要的作
用.在COCs的体外培养过程中,成熟液添加
FSH,IH,E2被普遍采用,但对卵巢皮质内直径小
于2ITlm卵泡卵母细胞的研究报道较少.本试验在
直径小于2mm卵泡内卵母细胞成熟过程中添加激
素,能显着的提高受精后胚胎的发育能力,这与王
第2期龙翔等:黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的影响因素157
表3细胞因子对卵母细胞体外受精及其早期胚胎发育的影响
Table3Effectofcytokineoninvitrofertilizationofoocytesfrominteriorfolliclesandearlyemb~odevelo
pmentinvitroofcows
1)基础液为M199液+10~50tLmol/l牛磺酸+10~NCS
Basicmediumcontains10%neonatecalfserum(NCS)and10%5O/imol/loftaurineinTCM199mediu
m.MGC=micro-dropwith
monolayergranularcells,MOEC=Micro-dropwithmonolayeroviductepithelia】cells
锋【9报道的基本一致.但有研究者认为1H在卵母
细胞培育过程中并未发挥作用.Izadyar{等认为
在不含血清的成熟培养液中,只有FSH能影响卵母
细胞的成熟,而1H没有作用;Bevers【1lJ等认为小
于8mm的牛卵泡中,颗粒细胞上只有FSH受体
mRNA,而没有1H受体tuRNA.HCG具有与
FSH/IH相似的效果,是小鼠,猪卵母细胞体外成
熟中通常添加的激素,而在牛卵母细胞体外成熟中
并不常用[1.本试验中以HCG取代1H与添加
1H作试验比较,结果表明其效果好于添加1H.
3.2BFF对卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎发
育的影响
血清可以为卵子提供营养,防止透明带硬化,血
清中包含的各类激素以及一些已知或未知的因子对
卵母细胞成熟和受精后早期胚胎发育具有促进作
用,在卵母细胞体外成熟与胚胎培养中被普遍使用.
但卵母细胞体内的生长是在卵泡液中,BFF为卵母
细胞成熟的介质,含有大量来自血清的生长因子和
颗粒细胞及卵泡细胞的分泌因子,BFF中适量的
VEGF,TGF-13,II,6及孕酮等可能有助于卵母细胞
的成熟.Fukui等认为体内卵母细胞的成熟与卵
泡液中所含雌激素的量和代谢物质有关【】.周颂
成等认为在成熟卵泡液中含有多种有效物质,对于
完善卵母细胞的成熟不仅具有单一的作用,还起相
互协同的促进作用【】引.本试验过程中,为使卵母细
胞尽量接近体内生长环境,以等量的BFF取代
NCS,卵裂数,4一,8一细胞胚发育率差异不显着,但
添加BFF的桑葚胚发育率高于NCS,说明在卵母细
胞体外成熟中用BFF取代NCS是可行的.为探讨
BFF在卵母细胞培养液与胚胎培养液中添加量,本
试验设置了4种添加浓度,发现以15为宜,与徐
照学等的结论略有出入L8].当BFF浓度为2O9/6时,
虽然卵裂数,胚胎发育率与l5浓度在统计学上差
异不显着,但桑葚胚发育却有降低的趋势.
3.3细胞因子对卵母细胞体外成熟受精后早期胚
胎发育的影响
哺乳动物早期胚胎在体外培养过程中具有发育
阻滞的现象,这是体外胚胎培养的主要困难;为了克
服阻滞现象,目前主要采用2种方法,一是利用临时
中间受体,二是与体细胞共培养.体细胞作为饲养
层是克服发育阻滞常用的手段,可以改善胚胎体外
培养的条件,模拟体内的自然环境,促进早期胚胎的
体外发育,其作用机理虽未十分明朗,但推测与以下
因素有关l7引:?分泌营养因子;?去除培养液中抑
制成分;?调节pH,提供胚胎代谢基质.从本次试
验可以看出,体细胞对帮助早期胚胎通过阻滞期具
有明显的效果,单一的输卵管上皮细胞作为饲养层,
效果优于单一的颗粒细胞.从已有的研究报道中发
现,以单一的输卵管上皮细胞,颗粒细胞等作为饲养
层为常见[mJ.从本试验还可看出,以颗粒细胞结
合输卵管上皮细胞的连续培养体系效果最佳,要好
于单一的体细胞培养体系.
4结论
本试验表明,在直径小于2mm卵泡内卵母细
胞体外成熟过程中添加一定量的激素,对体外受精
后早期胚胎的发育具有明显的促进作用,添加HCG
的效果优于IH;在培养液中添加BFF,对卵母细胞
体外受精胚胎的发育具有显着效果;以等量的BFF
取代NCS具有同等效果,以添加15为宜;体细胞
对6一,8一细胞胚通过阻滞期具有明显的作用,桑葚
胚率显着提高,以颗粒细胞结合输卵管上皮细胞的
连续培养体系效果最为明显.
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BovineOocytesfromInteriorFollicles
I.ONGXiang?YURong?GENGI.i—ying?ZHOUMu-qing.?XIONGJia-junYANGI.i—guo,?
(“AnimalReproductionInstitute,NanjingAgriculturalUniversity,Naing210095,China;
CollegeofAnimalScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wutmn430070,China;
WuhanResearchCenterofAnimalEmbryoTransplantingTechnology,Wuhan430345,China)
AbstractFactorsinfluencinginvitromaturation,fertilizationandembryo?sfurtherdevelopment
ofbovineoocytesderivedfrominteriorovary(IO)follicleswasstudied.Theadditionoffolliclestimula-
tinghormone(FSH)(10IU/mI),HCG(20IU/mI)(humanchorionicgonadotropin)and17E2(1ug/
mI)estradiolinmaturationmediumhadasignificantinfluenceontheabilityoffertilizationofoocytes
andembryo?sdevelopmentofIO-oocytes(P<O.01).Thesimilareffectwasobservedinthegroupof
BFF(bovinefolliclefluid)insteadofNCS(neonatecaltsserum).ThebestdoseofBFFaddedwas
15percent.Thecultivationwithmonolayergranularcells(MGC)andmonolayeroviductepithelialcells
(MOEC)sinmaturationmediumincreasedthedevelopmentalrateof4一to,8一eellembryoss(P<
0.05)andmorulae(P<O.01).Therefore,MGC+MOECisthebestcultivatedsystem.
Keywordsoocyte;invitrofertilization;embryo
(11-任编辑:边书京)