音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞的研究

音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞的研究 音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞转化 为神经元样细胞的研究 380中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第5期ChineseJournalof却ineand却inalCord,2006,Vo1.16,,.5 音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞 转化为神经元样细胞的研究 胡慧敏,罗卓荆,胡学昱,丁坦 (第四军医大学西京医院全军骨科研究所710032陕西省西安市) 【摘要】目的:研究体外使用音猬因子(sonichedgehog,SHH)诱导人骨髓基质干细胞(BMSCs)分化为神经元样 细胞(神经干细胞,神经细胞,神经胶质细胞)的可行性.方法:从健康志愿者髂骨抽取骨髓5ml,离心,分离 BMSCs.接种于含lO%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液中,BMSCs体外扩增,纯化到第五代后分别种于含 有不同浓度诱导液的24孔板中:A组为空白对照;B组加SHH700nml,碱性成纤维生长因子8(fibroblast growthfactor一8,FGF一8)140n~ml;C组由?SHH500ng/ml,FGF一8100ng/ml;D组加SHH250rig/ml,FGF一8 50ns/ml;E组加SHH125n~ml,FGF一825ngJ,m1.诱导BMSCs分化.使用免疫组化及免疫荧光鉴定微管相关蛋 白(MAP一2),胶质纤维酸性蛋白(GFAP),神经元烯醇化酶(NSE)的表达.结果:诱导7d后,部分BMSCs胞体收 缩,突起伸出,表现出神经元样细胞的形态.除A组外其余各组免疫组化及免疫荧光染色NSE,MAP一2均为阳 性,各组免疫组化及免疫荧光染色均有GFAP阳性细胞存在,且以B组,C组的MAP一2,GFAP,NSE染色阳性 细胞数最多.结论:人BMSCs具有较强的自我更新和多向分化潜能,一定浓度的 SHH可以在体外有效诱导人 BMSCs转化为神经元样细胞. 【关键词】骨髓基质干细胞;神经细胞;细胞分化;音猬因子(SHH) 中图分类号:R329.2.Q813.5文献标示码:A文章编号:1004-406x(2006)-05—0380一 O4 Differentiationofbonemarrowstromalcellsintoneuron—m 【ecellsinducedbysonichedgehog/HU Huimio.LUOZhuojing.HUXueyu.etai//ChineseJournalofSpineandSpinalCord.2006.16(5):380-383 【Abstract】 Objective:ToinvestigatethepossibilityofinducinghumanbonemaFrowstromalceHs(BMSCs)in. totlleneural-likeand/orglia— likeceHsbysonichedgehog(SHH).Method:BMSCsharvestedfromnormalhu. mallma/TowwerepassagedandpurifedinDMEM/F12mediacontaining10%FBS.Afterfivepassage,thepu- rifedhumanBMSCswereinducedbySHHwithdifferentconcentrations(groupA,controlnormalgroup;group B,SHH700ng/ml,FGF一 8140ng/ml:groupC,SHH500nghnl,FGF-8100nghnl;groupD,SHH250ng/ml,FGF一8 50ng/ml;groupE,SHH125ng/ml,FGF-825n~m1)anddetectedbyimmunocytochemistrystainingforGFAP, MAP-2,NSE.Result:Aftertlleinductionof7days.someBMSCsceHsexhibitedimmunoreactivity.NSEand MAP一 2positiveceHsexistinallgroupsexceptofcontrolgroup,GFAPpositiveceHsexistinallgroups.The amountofNSE,MAP一 2,GFAPpositiveceHsincreasedmarkedlyinBandCgroups.Conclusion:HumanBM. SCspossessethepotentialofselfrenewingandproliferating,SHHcaninducehumanBMSCs intotheneural— likeand/orglia-likeceHsundercertainconcantration. 【Keywords】BonemaFrowstromalcells;NeuronsceHs:Differentiation;Sonichedgehog 【Author'saddress】DepartmentofOrthopaedics,XijingHospital,theFourthMilitaryUniversity,Xian,710032, China 由于骨髓基质干细胞(bonemarrowstromal ceils,BMSCs)具有多向分化,易于增殖,便于基因 操作等特点【l】,所以目前对BMSCs的研究较多.大 量实验证实该细胞在不同的诱导条件下能够分化 基金项目:国家863高技术研究发展资助项目 (2002AA216101, 第一作者简介:男(1981一),硕士研究生,研究方向:脊柱脊髓损伤 电话:(029)82502111E-mail:juedi一101@sohu.com 为多种中胚层来源的间质细胞,如软骨细胞,成骨 细胞,脂肪细胞,成肌细胞等,进一步的体内和体 外实验【2还发现BMSCs可以横向分化为神经干 细胞,神经元细胞和神经胶质细胞. 音猬因子(sonichedgehog,SHH)是胚胎发育 过程中由脊索产生的一种因子,作为一种重要的 调控因子,SHH参与调控神经系统的发育,分化 过程[61,且SHH在碱性成纤维生长因子8 中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第5期ChineseJournalofSpi,~andSpinalCord,2006,Vol?16,No?5381 (fibroblastgrowthfactor-8,FGF一8)的协同作用下 在该过程中起重要作用[7,81.本研究拟探讨其在 BMSCs诱导分化为神经元样细胞中的作用. 1材料和方法 1.1实验材料 人BMSCs取自健康志愿者.DMEM/F12培养 基(Sigma公司),青霉素,链霉素,胎牛血清(FBS) (Hyclone公司),神经元烯醇化酶(NSE),胶质纤 维酸性蛋白(GFAP),微管相关蛋白(MAP一2)抗体 (上海中山公司),SABC试剂盒及DAB显色液 (武汉博士德公司),荧光抗体(Sigma公司),倒置 相差显微镜(LEICA),荧光显微镜(LEICA). 1.2人BMSCs的分离及扩增 从健康志愿者髂骨处抽取骨髓5ml,加入5ml 含lO%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液,充 分混匀,转入离心管,2000r/min离心lOmin,弃去 上清和脂肪层,小心吸取白膜层细胞移入培养瓶 中.加入含lO%FBS的DMEM/F12培养液4ml 混匀.培养瓶置于37oC,5%CO,饱和湿度的CO 孵箱培养,2d后更换培养液,通过用力震荡培养 瓶和换液分离非黏附细胞,弃去未贴壁细胞,3— 4d换液1次,每次换液时均用力震荡培养瓶.接 近融合的BMSCs用含0.1mmol/LEDTA的0.25% 胰酶室温消化5一lOmin,200Or/min离心lOmin,弃 上清,沉淀按1:3比例传代. 1.3人BMSCs向神经元样细胞的定向诱导分化 传至第5代的细胞以lxl05个/L密度接种于 铺片的24孔板中.各孔中分别加入不同浓度的 SHH:A组,不加SHH和FGF一8:B组,SHH 700ng/ml,FGF一8140ng/ml;C组,SHH500ng/ml, FGF一8100ng/ml;D组,SHH250ng/ml,FGF一8 50ng/ml;E组,SHH125ng/ml,FGF一825ng/ml. 1.4形态学观察 应用倒置相差显微镜追踪观察细胞数量和诱 导后形态的改变并拍照. 1.5免疫荧光染色鉴定 培养诱导细胞第7d观察到有明显的长突起 改变后,采用SABC法进行免疫荧光染色,分别检 测GFAP,MAP一2,NSE.一抗分别为GFAP(鼠抗, 1:300),MAP一2(鼠抗,1:300),NSE(鼠抗,1:300). 二抗为羊抗鼠的FITC(1:50).细胞爬片经4%多 聚甲醛固定20min,PBS震洗3遍后分别滴加一 抗过夜.第2天PBS洗3遍后滴加荧光二抗.使 用荧光显微镜观察,发绿色荧光的为阳性细胞. 1.6统计学分析 使用SPSS10.0软件包进行方差分析和组间 比较.每个指标在每张染色片随机取lO个视野 (×l00),使用互表示. 2结果 2.1形态学观察 培养的骨髓基质干细胞经过用力震荡和换液 去除大部分杂细胞后,接种的细胞在24h后已经 贴壁,23d时有35%左右的融合,细胞呈梭形,圆 形,三角形等不规则形态(图1,后插页?).9一lOd 后BMSCs细胞呈单层.可以达到9O%以上的融 合,细胞以长梭形为主,并呈旋涡状生长(图2,后 插页?).随着传代次数的增多,不规则形态的细 胞逐渐减少,细胞形态以梭形为主.经SHH诱导 后7d可以发现一些细胞在诱导后出现突起伸长, 胞体回缩,立体感和折光性增强等形态学变化(图 3—5,后插页?),但还有一部分细胞在诱导后并 没有出现明显的形态学变化.提示BMSCs细胞中 只有一部分发生分化. 2.2免疫荧光染色观察 诱导7d后的免疫荧光染色发现B组,C组, D组,E组均有绿色荧光表达(图3,4,后插页 ?),表明这些细胞具有神经元性状.胶质细胞标 记物GFAP免疫荧光染色A组,B组,C组,D组, E组均有绿色荧光表达(图5,后插页?),提示各 组中均有星形胶质细胞存在.统计学分析结果显 示,A组MAP一2,NSE,GFAP阳性细胞数明显小 于其余各组(P<O.001).B组,C组与D组,E组比 较在MAP一2,NSE,GFAP阳性细胞数上有显着性 差异(P<O.05),但B组,C组间的MAP一2,NSE, GFAP阳性细胞数上没有显着性差异(P>O.05) (表1),但C组的浓度较低,因此更加合理. 表l诱导后各组MAP-2,NIF-200,GFAP阳性细胞数 注:?与A组比较P<O.O1,?与B,C组比较P<O.05 382中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第5期 ChineseJourndo/Sp/,~andf,lnfCord,2oo6,o/.16,?0?5 3讨论 20世纪7O年代中期,Fridenstein等就提出了 在骨髓中存在能贴附塑料培养皿,呈成纤维细胞 样克隆生长的细胞,他们将其称为"成纤维细胞集 落形成单位(CFU—F)".后来的研究表明, Fridenstein粗糙分离所得到的细胞是骨髓造血微 环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调 控造血的作用,因为具有多向分化潜能,在不同的 诱导条件下,能够分化为多种中胚层来源的间质 细胞,如软骨细胞,成骨细胞,脂肪细胞,成肌细胞 等.故又称其为"间质干细胞".近年来研究发现 BMSCs具有向神经细胞分化的潜能,通过一定的 诱导条件,BMSCs可显示神经系统细胞的一些形 态特征并表达一些标志性蛋白. 目前对体内及体外条件下BMSCs向神经细 胞分化的研究都有较多报道.并且取得了鼓舞人 心的成果.体内诱导主要采用将BMSCs细胞直接 注入到神经系统或静脉内.示踪结果发现这些注 入的细胞不但能够成活,还能够分化为具有神经 特性的细胞,并使得受损伤的神经系统功能出现 明显的改善.但是.由于细胞融合因素的影响及体 内诱导环境过于复杂.使得这种方法在可控性和 说服力上明显逊于体外诱导实验.目前体外诱导 实验的方法主要分为三种:(1)神经营养因子和细 胞因子(如RA,BDNF,FGF等)诱导;(2)化学试 剂(二甲基亚砜,2一巯基乙醇,丁羟茴醚等)诱导: (3)基因转染或修饰.使用化学诱导剂在数小时后 即可出现MSC形态改变且表达神经特异性蛋白. 但在随后的研究发现诱导后细胞的形态和功能不 能够维持,且放线菌酮不能够阻止这种定向诱导 (即不伴有新蛋白的生成),因此Lu等191认为这是 一 种细胞毒性的改变而不是细胞分化的过程.真 核生物在基因转染或修饰中存在稳定性差,表达 率低,细胞损害等问题,这大大限制了基因转染或 修饰的应用.神经营养因子和细胞因子诱导同体 内发育过程相似,且可以部分模拟体内环境.因此 日益受到重视.目前神经营养因子和细胞因子诱 导主要主要依靠全反式维甲酸(RA),脑源性神经 生长因子(BDNF),碱性成纤维生长因子(FGF), 神经生长因子(NGF),表皮生长因子(EGF)等因 子的不同组合与时序的应用,但效果不甚理想,仍 然需要寻找更为有效的组合和因子 SHH是胚胎发育过程中由脊索产生的一种 因子.它是一种重要的发育调控因子,参与体内多 种发育过程,包括神经管的定型,肢体的发育,细 胞表型的定向诱导等Oo].在神经系统的发育中, SHH信号通路的主要作用为诱导整个中枢神经 系统形成背腹两侧分区,当这一信号通路受到破 坏时.将导致整个中枢神经系统腹侧表型神经元 的完全丧失.初步的研究显示,SHH信号分子可 以维持大脑中神经前体细胞生存的微环境【ll1. 研究表明is.91.FGF一8与SHH有协同作用,诱 导浓度比例为1:5.本研究发现采用SHH/FGF一8 方案诱导7d后.BMSCs细胞可以出现细胞突起 伸长,胞体回缩,立体感和折光性增强等形态学变 化.但还有一部分细胞在诱导后并没有出现明显 的形态学变化.提示BMSCs细胞中只有一部分发 生了分化.神经元特异性抗体MAP一2,NSE免疫 荧光染色发现B组,C组,D组,E组均有绿色荧 光表达,表明这些细胞具有神经元性状.胶质细胞 标记物GFAP免疫荧光染色A组,B组,C组,D 组,E组均有绿色荧光表达.提示各组中均有星形 胶质细胞存在.统计学分析结果显示C组组合 (SHH5o0nIIll,FGF一8lOOng/m1)为最佳浓度, 在较少SHH和FGF一8时诱导产生的神经样细胞 最多.为进一步研究BMSCs分化成神经样细胞的 分子机制,获得足量高活性的神经组织工程种子 细胞提供了新的思路与方案. 4参考文献 1.KrauseDS.Plasticityofmarrow-derivedstemcells叫.Gene Ther,撇,9(11):754—758. 2.DengW,ObrockaM,FischerI,eta1.Invitrodifferentiationof humanmarrowstromalceilsintoearlyprogenitorsofneural cellsbyconditionsthatincreaseintracellularcyclicAMP啪. BiochemBiophysResCommun,2001,282(1):148-152. RamosJ,SongS,Cardozo-PelaezF,eta1.Adultbone 3.Sanehez— marrowstmmalcellsdifferentiateintoneuralcellsinvitrol【J】. ExpNeurol,2O0o,154(2):247-256. 4.WoodburyD,ReynoldsK.BlacklB.Adultbonemarrowstromal stemcellsexpressgennline,ectodermal,endodermal,andm~.8o- dermagenespriortoneurogenesis叫JNeuroseiRes,2002,69 (10):908-917. 5.WoodburyD,SehwarzEJ,ProckopDJ.eta1.Adultratand humanbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneurons;叨. JNeurosciRes,2O0o,61(4):364—370. 6.ChristianJ.BMP.?tandHedgehogsignals:howfarCallthey g0叫.CurtOpinCellBiol,20oo,12(2):2249. 7.LeeSH,LumelskyN,StuderL,eta1.Efficientgenerationof midbrainandhindbrainneuroD8fromInout~embryonicstem 中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第5期 ChineseJourruiofSpineandsei,~Cord,2006,Vol?16,No?5383 cells[j].NatureBiotechnology,2000,18(5):675—679. 8.WichterleH,LieberamI,PorterJA,eta1.Directeddifferentita- tionofembryonicstemcellsintomctorneurons.Ceu,2002, 110(3):385—397. 9.LuP.BleschA,TuszynskiMH.InductionofbonenlalTowstro- realcellstoneurons:differentiation,transdifferentiationorarti- fact[J].NeurosciRes,2004,77(2):174-191. 10.BriscoeJ,SussolL,SetupP,eta1.HomeoboxgeneNkx2.2 andspecificationofneuronalidentitybygradedsonic hedgehogsignaling.Nature,1999,398(6728):622-627. 11.MacholdR,HayashiS,RutlinM,eta1.Sonichedgehogisre. qniredforprogenitorcellmaintenanceintelecephalicstem cellniches[J].Neuron,2003,39(6):937-950. (收稿日期:2005-08-08惨回日期:2006-02-08) (英文编审蒋欣) (本文编辑彭向峰) T5脊髓完全『生损伤并发急性胰腺炎1例 姚爱明,许铁,冯斌,冯虎,秦宏敏 (徐州医学院附院创伤外科221002江苏省徐州市) 中图分类号:R683.2,R576文献标识码:B文章编号:100l4-4o6X(20o6)_o5—0383— 01 患者男性,39岁.因"摔伤后躯体及双下肢感觉运动 障碍6h"人院.患者于6h前,采石时从山上摔下,致胸部 以下及双下肢感觉运动障碍,胸闷,呼吸困难,无昏迷,恶 心,呕吐,送往当地医院简单处理后转入我院.人院查体: BP50/30mmHg,神志淡漠.头部,胸背部,四肢多处皮肤挫 裂伤,右侧胸廓塌陷,扪之有骨擦感,伴皮下握雪感,右肺 呼吸音低.腹部平坦.腹软,叩呈鼓音.在T6—1_7水平棘突 出现阶梯样畸形伴压痛.神经学检查示双侧剑突以下感觉 运动完全消失.鞍区感觉运动完全消失.人院后.给予快速 输液扩容抗休克治疗,血压维持在90/60mmHg左右后行 胸腹部,胸椎CT及胸椎X线检查,示I"5,1'6,1'7椎体骨 折,T6H脱位,T6椎管内有碎骨片,右侧多发肋骨骨折伴 血气胸.腹部CT示肝,脾,胰及双肾未见明显异常.初步诊 断为:3'5,T6,T7椎体骨折,T6厂7脱位,T5完全性脊髓损 伤,右侧多发肋骨骨折伴血气胸,创伤性休克.胸外科会诊 后,行右侧胸腔闭式引流,引流出血性液体约200Inl,继续 输液补充血容量,患者胸闷较前稍好转.患者于受伤12h 后,感上腹部明显不适,尤以剑突下为重,并伴有血压再次 下降至80/50mmHg左右,考虑有应激性溃疡可能.行胃管 负压引流,未见有咖啡色胃液,胃液潜血实验阴性.行腹腔 穿刺未抽出液体,请普外科会诊未找到明确原因.后收入 EICU病房予以抗休克,营养神经,抗感染,预防应激性溃 疡等治疗,并继续观察病情变化.伤后16h.患者血压仍不 平稳,上腹部不适仍未明显减轻,腹部叩诊出现可疑移动 性浊音,行腹腔穿刺,抽出5ml黄色浑浊液体.行常规及淀 粉酶检查,结果提示:彤vaha试验阳性,涂片示脓细胞满视 野,腹水淀粉酶3220U几.血清淀粉酶360U几:尿淀粉酶 877U/L.腹部B超示胰腺未见明显肿胀,腹腔少量积液.根 据腹水,血尿淀粉酶以及腹部B超检查结果.考虑并发急 性胰腺炎,给予禁食,抑制胰液分泌.补充能量.维持水电 解质平衡等治疗,患者1d后上腹部不适感渐消失.复查 血,尿淀粉酶为16U/L和25U/L.2d后患者生命体征平稳. 由EICU转出.后因经济原因未行手术回当地保守治疗. 讨论脊髓损伤后,消化系统常见的并发症有应激 性溃疡,麻痹性肠梗阻,急性胃扩张等哪,并发急性胰腺炎 罕见,国内文献尚未见报告.通过MEDLINE查阅国外文 献.亦只有少数报告.脊髓损伤后并发急性胰腺炎的发病 机制有如下可能:(1)脊髓损伤平面以下交感神经功能障 碍,迷走神经功能亢进,0ddi括约肌强烈痉挛,胰液排泄 受阻[21;(2)患者原有胆管结石,迷走神经功能亢进,Oddi 括约肌强烈痉挛,胰液排泄受阻删;(3)胰腺闭合性损伤; (4)休克后缺血再灌注损伤,导致胰腺炎.本例患者并发急 性胰腺炎的发病原因考虑有三种可能:(1)患者有从山坡 滚落的外伤史,不除外胰腺闭合性钝挫伤;(2)休克后缺血 再灌注;(3)脊髓损伤后交感神经功能障碍,迷走神经功能 亢进,0ddi括约肌强烈痉挛.胰液排泄受阻.由于本例患 者的脊髓损伤平面位于T5,脊髓损伤平面以下的感觉,运 动消失,急性胰腺炎所表现的腹部症状与体征不典型.是 其不能被及时发现的主要原因.对于脊髓损伤并发急性胰 腺炎的治疗原则本身并无特殊之处.关键在于早期发现并 及时处理,如怀疑胰腺损伤严重,需剖腹探查.通过对该病 例的回顾性分析,我们认为,急性胰腺炎虽是脊髓损伤的 罕见并发症,但对于脊髓损伤后伴上腹部明显不适或疼痛 的患者,在排除了应激性溃疡后,应考虑有并发急性胰腺 炎或合并有胰腺损伤的可能. 参考文献 1.胥少汀,郭世绂编着.脊髓损伤基础与临床fM1.第2版.北京:人 民卫生出版社.2002.883—884. 2.NobelD,BaumbergerM,EserP,eta1.Nontraumaticpancreatifis inspinalcordinjury[J].Spine,2002,27(9):228-232. 3.TolaVB,ChamberlainS,KostykSK,eta1.Symptomaticgall- stonesinpatientswitlIspinalcordinjuryJGastrointest Surg,2000,4(6):642-647. (收稿日期:2005—12—o5惨回日期:20064~-05) (本文缡辑王晓梅) 音稽因子体外诱宁人骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞的研完 目5cI7一?t《.}I证蜒也 …VI雌伴仲牲【Xl{)11I 国4f:|1l导7Ij晴Nsl电畦世啦也mNSF H^it,n牲K赵l_.』t"~lll1n连【xlf?1