【doc】广王不留行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻模型逼尿肌肌球蛋白表达的影响

【doc】广王不留行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻模型逼尿肌肌球蛋白达的影响 广王不留行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻 模型逼尿肌肌球蛋白表达的影响 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2012VOI.23NO3时珍国医国药2012年第23卷第3期 广王不留行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻 模型逼尿肌肌球蛋白表达的影响 徐发彬,崔学教,邱云桥,谢建兴,陈铭,潘恩山,邓国梁,m,gu3,]. (1.广州中医药大学第一附属医院,广东广州510407; 2.广州中医药大学外科研究生,广东广州510407;3.南方医科大学,广东广州510400) 摘要:目的研究益肾通方中单味中药广王不留行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻模型逼尿肌中的平滑肌肌球蛋白表达 的影响,探讨其影响平滑肌细胞分子病理学改变方面的作用及意义.方法将实验大鼠随机分为空白组,造模组,实验组 各15只.参照文献资料制作大鼠膀胱颈梗阻模型其中空白组未进行造模而给药,造模组造模不给药,实验组造模并 给药.应用半定量RT—PCR法检测平滑肌肌球蛋白的表达水平.结果电泳鉴定结果显示平滑肌肌球蛋白的表达空白 组条带最清晰,造模组最弱,而实验组介于两者之间.结论动物实验提示广王不留行醇提物可能通过抑制膀胱逼尿肌 平滑肌细胞的退化状态,从而改善逼尿肌功能. 关键词:膀胱逼尿肌;平滑肌肌球蛋白;广王不留行 DOI标识:doi:10.3969/i.issn.1008-0805.2012.03.076 中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编号:1008-0805(2012)03—0681—02 前列腺增生症(BPH)是一种老年性常见病,西医治疗本病多 以手术为主,但对于单纯应用抑制前列腺增生的药物与手术切除 所无法解决的部分下尿路症状,探索能够综合调节前列腺形态及 膀胱逼尿肌,膀胱颈括约肌功能的药物是一个值得注意的新方 向. 本研究源自我院泌尿外科专家崔学教教授治疗BPH的经验 方益.肾通方….组方配伍正是基于长期实践而形成补气,益肾, 通络的治疗法则,选用典型药物组方而成,包括广东地方药物 广王不留行.临床研究益肾通治疗BPH患者后,尿流率,逼 尿肌收缩力较治疗前高,在改善膀胱逼尿肌和前列腺功能方面有 优势.实验研究..也初步证实了益肾通方对大鼠慢性膀胱颈 梗阻模型逼尿肌组织形态学的影响.本实验通过研究广王不留 行醇提物对大鼠慢性膀胱颈梗阻模型逼尿肌中的平滑肌肌球蛋 白表达的影响,探讨了其在影响平滑肌细胞分子病理学改变方面 的作用及意义,并推测其治疗BPH的机理,为进一步应用和开发 祖国传统中医药提供现代科学理论依据. I仪器与材料 1.1仪器湘仪离心机,德国Eppendof冷冻离心机,北京六一电 泳仪,捷达801凝胶成像分析系统,ABI9700扩增仪,达晖DHB一 30恒温金属浴电热套10L(海宁市新华医疗器械厂),圆底烧瓶 10L(四川蜀玻有限责任公司),旋转蒸发仪(EYELA1000),万能 粉碎机(温岭市牧屿百乐机床厂). 1.2试剂3月龄的SD雄性大鼠(南方医科大学实验动物中 心),石油醚(60,90oC)(天津大茂试剂厂),食用级95%乙醇 (广州东征化玻有限公司),达晖RT—PCR反应体系,西班牙琼 脂糖,达安基因实验伴侣,异丙醇(广州化学试剂厂),三氯甲烷, 广王不留行药材(广州中医药大学大药房有限公司). 2方法 2.1广王不留行提取物制备取药材3kg,粉碎,过24目筛,加 石油醚(6O,90?)15L浸泡过夜,滤过,药渣挥干石油醚,平均 分成3份.每份各加70%乙醇加热回流提取3次,1lv/次,每次加 收稿日期:2011_o39;修订日期:2011—104)2 基金项目:广州中医药大学科研创新基金(No.06C010) 作者简介:徐发彬(1974一),男(汉族),甘肃武威人,现任广州中医药大学 第一附属医院外科副主任医师,博士学位,主要从事中西医结合外科医教 研工作. 8倍量溶剂,提取液滤过,滤液合并,减压回收乙醇,浓缩至含生 药量为1.5ml的稠膏,备用. 2.2大鼠慢性膀胱颈梗阻模型的制作根据文献介绍的方法, 术前禁食6h(不禁水),1.0%戊巴比妥钠(30mg/kg)作腹腔注 射麻醉,麻醉成功后将大鼠仰卧固定于专用木板上,阴囊皮肤备 皮,2%碘酒,75%酒精消毒皮肤后,铺特制手术巾后,行下腹部正 中切口,暴露膀胱和尿道,并与周围组织分离,在尿道和膀胱交界 处外置一一直径为1mm的硬外麻聚乙烯导管,用2根4号医用灭 菌缝合线环绕尿道和聚乙烯管并结扎之,随后抽出聚乙烯管,使 尿道口径减至1mill,逐层缝合伤口. 2.3药物处理随机将实验动物分为3组,以广王不留行醇提物 液灌胃,灌胃容积为1ml/100g.自术后第2天起给药共5周. 空白组:n=15,未进行造模,以广王不留行醇提取物灌胃; 造模组:n=15,造模后未给予广王不留行醇提取物; 实验组:n=15,造模后予以广王不留行醇提取物. 2.4组织总RNA提取及cDNA逆转录合成将组织样品逼尿肌 加DEPC水冲洗后加液氮,研碎.将研磨好样本加入Trizol混匀, 室温静置15min,再加入200txl氯仿,颠倒混匀,室温静置10min, 13000r/min离心10min.吸取上清液,加入等体积异丙醇,颠倒 混匀,静置10分装,13000r/min离心10rain.弃上清液,加1ml 75%乙醇(用DEPC水配置)洗涤沉淀,8500r/min离心5min,吸 去上清.空气干燥沉淀,加40pJDEPC水溶解RNA在一20?冰箱 保存备用(长期保存放一70~C冰箱).RNA逆转录合成cDNA使 用达晖RT—PCR反应体系进行,以鼠逼尿肌总RNA为模版,oligo (dT)20为反转录引物,操作方法按试剂盒推荐方法进行. 2.5半定量RT—PCR法检测平滑肌肌球蛋白的表达平滑肌肌 球蛋白引物序列为F1:5一CGcTGGAGGcCAAGATTGCAC一3, R1:5一GTGTCCGIrrCCTCCTCAGAAC一3.内参照物为 微球蛋白,引物序列为F2:5一CGGTGGTGGTGAAGCTGTAGC一 3,R2:5._GGGCATCCTGACCCTGAAGTA一3.待测模板肌球 蛋白在膀胱平滑肌组织内的相对含量可用待测模板的荧光强度 值/微球蛋白的荧光强度值表示. 按表1比例配置PCR反应体系: 4rain预变性,然后94?30s,54?30 PCR反应条件:93? S,72?45S运行35个循环,最后72cc延伸8rain,4?保存. 3结果 应用半定量RT—PCR法检测平滑肌肌球蛋白的表达.由于 ? 681? 时珍国医国药2012年第23卷第3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2012VOL.23NO.3 实验条件及研究经费所限,本实验仅在每组随机选取标本进行检 测.测得平均光密度(OD)值显示空白组平均值为0.11,造模组 平均值为0.04,而实验组平均值为0.07(见表2).由于标本较 少,未进行统计学检测.所得电泳鉴定结果见图1. 表1PCR反应体系配置比例 项目体积l ?a一组为实验组b一组为空白组e一组为造模组数字代表动物标号 图1电泳鉴定结果 从图1中我们发现,空白组条带最清晰,造模组最弱,而实验 组介于两者之间,表明肌球蛋白在膀胱平滑肌组织内的相对含量 以空白组为最高,实验组高于造模组.提示广王不留行醇提取液 能够提高肌球蛋白在大鼠慢性膀胱颈梗阻模型平滑肌细胞中的 含量,由于平滑肌肌球蛋白是平滑肌细胞的特异性标记蛋白,推 测应用广王不留行提取液后抑制了平滑肌细胞的退化状态,从而 改善逼尿肌功能. 4讨论 肌球蛋白是各类肌细胞中含量最多的结构蛋白和收缩蛋白, 是构成肌肉肌原纤维粗丝的基本组成蛋白,是横纹肌细胞表达最 丰富的蛋白,约占其总蛋白库的25%.是一个六聚体的蛋白质 大分子,具有ATP酶活性,故通常也称之为肌球蛋白ATP酶.肌 肉收缩的直接能量来源是肌球蛋白对ATP的水解.在骨骼肌和 心肌中,不同的肌球蛋白异构体表达变化和ATP酶活性相关,进 而影响肌肉的收缩功能,有学者认为逼尿肌中肌球蛋白重链亚型 的表达的改变亦可引起ATP酶活性的改变从而影响逼尿肌的收 缩功能J.另有报道出现BOO后膀胱逼尿肌中肌动/球蛋白比 例也明显上调.膀胱逼尿肌早期对梗阻的反应是平滑肌肥大,这 只是膀胱内压增加的一种适应性反应,但必然伴有平滑肌细胞内 ? 682? 外功能的改变,如平滑肌肌动蛋白表达和收缩时所需能量的改变 以及细胞间传导能力的减弱.研究显示梗阻后膀胱平滑肌的改 变包括一系列收缩蛋白含量及比例的变化….梗阻后肌动蛋白 的增加和去神经化现象可能共同影响膀胱的顺应性,使膀胱的贮 尿功能表现异常.有研究显示BOO组肌动蛋白mRNA和肌球蛋 白mRNA的表达量与膀胱重量变化之间均有显着相关性.推测 BOO后逼尿肌中肌动蛋白,肌球蛋白表达的增加以及肌动/球蛋 白比例的上调可能是其收缩功能改变的分子基础,通过及时解除 BOO,有望阻断膀胱逼尿肌的病变进程".由于平滑肌肌球 蛋白是平滑肌细胞的特异性标记蛋白,本实验通过半定量逆转录 聚合酶链式反应(RT—PCR)法检测平滑肌肌球蛋白的表达,提 示广王不留行醇提取液能够增加肌球蛋白在大鼠慢性膀胱颈梗 阻模型平滑肌细胞中的含量,推测应用广王不留行提取液后抑制 了平滑肌细胞的退化状态,从而改善逼尿肌功能.但由于膀胱逼 尿肌的收缩功能同时还受到其他相关因素的影响,如间质成分, 生长因子,神经递质等,具体的作用机制有待深入研究. 广王不留行是益肾通方中主要药物之一,其具有活血通瘀, 补肾利尿等作用.从"瘕瘕"学说得到提示,我们从动物实验方 面注重了益肾通方中活血化瘀药物广王不留行的研究.提示广 王不留行醇提物可以抑制大鼠慢性膀胱颈梗阻模型膀胱逼尿肌 平滑肌细胞凋亡和平滑肌细胞的退化状态,从而改善逼尿肌功 能.根据中医整体观念,对于改善膀胱逼尿肌功能方面,无论补 肾,益气,活血三方面都有可能具有一定的作用,由于研究时间, 经费等限制,本文只探讨了益.肾通方中广王不留行这一种药物, 尽管在动物实验中显示其部分作用,尚不能代表益肾通方全部作 用机理,在今后的研究中有待于进一步探讨. 参考文献: [1]崔学教.以瘀阻气虚论治前列腺增生症的思路与方法[J].中国中 医基础医学杂志,2001,7(7):48 邓柏杨,崔学教."异病同治"刍议前列腺增生症的研究思路[J]. 陕西中医,2008,4:470. 崔学教.补气益肾祛瘀法治疗前列腺增生58例[J].中医杂志, 1994,35(4):22. 邱云桥,邓春华,谢建兴,等.益肾通对BPH膀胱逼尿肌收缩力影 响的临床研究[J].新中医,2004,36(9):2O. 徐发彬,李洪杰,崔学教,等.益肾通方对大鼠前列腺增生模型的影 响[J].新中医,2004,36(10):75. 徐发彬,李洪杰,谢建兴,等.益肾通方对大鼠慢性膀胱颈梗阻模型 逼尿肌组织形态学的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2004,10 (5):27. MattiassonA,UveliusB.Changesincontractileproperitiesinhyper- trophicraturinarybladder[J].J.Urology,1982,128:1340. HypoliteJA,ChangS,ZhengY,eta1.膀胱出口部分梗阻(PBOO)引 起逼尿肌肥大,收缩力降低及逼尿肌收缩和调控蛋白的改变[J].J Urol,2006,175(2):777. 王杭.膀胱出口梗阻引起逼尿肌肌球蛋白重链亚型表达改变的 实验研究[J].JUrol,2005,26(7):458. 李文刚.急性尿潴留大鼠膀胱功能损害与组织结构改变的关系 [J].第三军医大学,2006,28(8):823. 白志明.膀胱出口梗阻后逼尿肌收缩蛋白表达和膀胱重量的改变 [J].ChineseJournalofAndrology,2007,21(8)14. MannikarottuAS,膀胱出口部分梗阻(PBOO)引起平滑肌肌球蛋白 亚型表达的区域差异[J].JUrology,2005,173(1):302. ]j]J]J]J1j]j? 引州… r;rLrL『.-r;rL