Ⅰ型先天性厚甲症中K6a、K16基因突变点的检测

Ⅰ型先天性厚甲症中K6a、K16基因突变点的检测 石河子大学 硕士学位论文?型先天性厚甲症中K6a、K16基因突变点的检测 姓名:刘建勇 申请学位级别:硕士 专业:病理学与病理生理学 指导教师:普雄明康晓静 20090501 中文摘要目的:对两个,,,,家系进行家系调查，致病基因突变检测，验证基因突变是否同国外研究报道一致，是否有新的基因或新的突变产生;探讨该病基因型与型之间的关系，为基因诊断和治疗提供理论依据。左法:提取,,,,患者及其家系正常人和,,名正常对照的外周血白细胞基因组,,,，采取聚合酶链反应(,,,)扩增基因的全部编码序列，然后将产物纯化后，直接进行,,,澳，,序确定基因突变位点和类型。结果:,,,扩增结合,,,测序发现散发维吾尔族患者,,,,,基因第,外显子存在异常，第,,,位由胞嘧啶 ,,)突变为鸟嘌呤(,)，导致,,,,,基因,,起始区第,,,位编码氨基酸由天冬酰胺(,)变为丝氨酸 (,)，即发生,,,,,错义突变:患儿父母，汉族家系及与家系无血缘关系的,,名正常对照均未发现此突变，同时汉族家系患者在,,,、,,,基因突变热点区未发现基因突变。结论:,,,,,基因,,,,,突变是导致新疆维吾尔族，型先天性厚甲症的新生突变。关键词:,,,、,,,、先天性厚甲症、突变迨塞娄型,?(基熊班塞,资助基金项目:新疆自治区科技攻关和重点科技项目:新疆少数民族遗传性皮肤病资源与致病基因研究 (,,,,,,,,,(,)) ,,,,,,;,,,,,;,,,,:,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,;,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,, ，(,,,,),,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,:,,,,,,; ,,, ,,, ,,,,,;,,, ,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,(,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,, ;,,,,,,,(,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,?,,,, ,,？,,,;,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,,(,,,),,,,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,; 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,,, ,,,,,,(,)) ? 英文缩略语表英文缩写 英文全名 中文译名,, 先天性厚甲症,, ,,,,;,, ,,,,,,;, 医学遗传学,,,, ,,,,,,,, ;,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,,,, ，,,,,,,,,,,美国国立生物技术信息中心,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,, 蛋白基因,,?, 角蛋白基因,,,, ,,;,,,, 聚合酶链反应,,, 角 ,,,，,,,,，,,,,，,几,,,, 脱氧核糖核酸,,,(, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?,;,,,; ,;,, 乙二胺四乙酸,, ,,,, ,,,, 碱基对她 ,,,,, ,;,, 氨基酸,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, 人类基因突变数据库,,，, ,,,,,, ,,,,,,,,, ，,,,,,,,,;, ,, ,,, 人类孟德尔遗传在线, ,,,,,,,,,, 天冬酰胺, ,,,,,, 丝氨酸 ,， 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的并表示谢意。 研究生签名:,茹?蕴勇 时问:,。。,年,月,。日 学位论文版权 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名:,多坳 时间:,。。,年,月,。日 导师 签名: 时间:,,,,年,月,,日 ，型先天性厚甲症中,,,、,,,基因突变点的检测 —„上,,,„ 刖舌 ，(，,,,,,,;,,,,) 先天性厚甲症(,,;,,,,,;,,, ,,,,,,,,,，,,)，又称先天性厚甲综合征，是一种常染色体显性遗传性皮肤病。,,,,,,,,,和,,,,,,,,,,,?于,,,,年首先报道这一疾病，他们发现,,,,岁的女孩指趾甲变硬增厚，远端狭长弯曲，伴有下颌和肘部红色丘疹，鼻部、双手和足底多汗，足底水疱，掌跖角化性损害，以及舌粘膜白斑，患者,岁的 弟弟也出现相似的症状，他们将此病命名为,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,综合症，即先天性厚甲症。典型表现为初生后不久指(趾)甲肥厚、掌跖过度角化、掌跖痛性水疱、声音嘶哑并伴发口腔粘膜白斑、角膜角化不良、白内障等症状。甲的异常表现主要有三方面心,:甲床过度角化，甲板增厚和甲板弯曲变形。根据遗传学和临床研究被分为两个主要临床亚型，，型(,,，, ,,,,,,)，，，型(,,，, ,,,,,,)。其中，型或称,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,综合征(,,,,型)，出生时或婴儿期所有指趾甲对称性变硬增厚，变为黄白色，肘膝伸侧、臀部和腰部毛囊角化，毛发异常，掌跖角化伴多汗，也可出现口腔或喉粘膜白斑伴声音嘶哑口,。，，型或称,,;,,,,—,,,,,,综合征(,,一,型)，除，型症状外，尚有胎生齿和多发性脂囊瘤及表皮囊肿，而无口腔粘膜白斑表现,,。另外还有学者将，型的表现并伴角膜白斑的称为?型。另有一些少见患者在成人期发病，称为迟发型厚甲症聆,。总之，先天性厚甲症是一种外胚叶缺陷性遗传病，临床表现多种多样，并非所有症状在每一个患者身上都有体现，不同的家系或散发病例会出现不同症状，且各型之间症状还可有重叠。 ,,,,年先天性厚甲症的分子基础被阐明，逐步认识到该病是由于角蛋白基因发生突变引起。目前关于先天性厚甲症的研究报道越来越多，基因位点与临床表现的关系越来越明晰。通过研究基因突变可以得到如下结论:,,,,,、,,,,,的基因突变与，型厚甲症有关，,,,,,、,,,,,的基因突变与，，型厚甲症有关。,,,,,发生的突变导致轻微的局灶性表皮松解型掌跖角化病，而,,,,,的突变则导致多发性脂囊瘤。一些角蛋白基因突变可以产生或轻或重的表现型。在不同的人种或家系，可能存在不被人知的遗传或环境修饰因子，这需要我们谨慎的来考虑表型与突变的关系。一些轻微限局的的基因位点突变可以导致迟发型厚甲症。 到目前为止，,,在这四个角蛋白基因上共发现,,,个突变位点砸】。这些突变大多位于突变热点区域，包括错义突变、缺失突变和插入突变等形式。本研究国内外相关报道，利用直接测序的方法对我们获得的,,家系进行基因突变的检测，以便进一步发现新的致病突变位点和突变方式，探讨该病基因型和表型之间的关系，有助于今后开展对,,的遗传咨询和产前诊断，并为今后的基因治疗提供有力的理论支持。 ，型先天性厚甲症中,,,、,,,基因突变点的检测 材料与方法 (,,,,,,,,,,,,,,,,,),研究对象 在新疆克拉玛依市和喀什莎车县共收集先天性厚甲症患者及其家系血样,份，及其与家系成员无任何血缘关系的正常对照血样,,份。患者由新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科主任医师根据其典型的临床表现结合其发病史确诊，符合,,(,的诊断标准。病例留取了详细的临床资料和临床图片，收集的临床资料包括患者性别、年龄、发病年龄、皮损表现、诱发或加重因素、家族史以及真菌检查等。抽取家系中所有患者及家系正常成员外周抗凝血,,,，置于，,,,,,,,公司的,,, ,,,,抗凝管中，,,?低温冰箱保存。采血前均获得家系所有成员的知情同意。以备基因突变检测时使用。 具体临床资料如下: 家系,:先证者(,,,)男，,,岁，汉族，指(趾)甲增厚,,年。满月时双手指甲开始发黄，足趾甲也有部分发黄。,岁后发黄的指(趾)甲板开始增厚，起初呈污黑色，后逐渐转变为黑褐色，甲板厚度逐渐增加，极硬。,(,一,岁后双手掌、手指屈侧和足跖、足底出现角化性斑块，似胼胝，随年龄增长逐渐增厚。双足多汗，夏天行走多时有粟粒至绿豆 大水疱发生，并有皲裂，行走疼痛。曾四处求医，厚甲无改善。体检:发育、智力正常，营养中等，全身浅表淋巴结未触及。头无畸形，毛发分布正常。口腔粘膜及牙齿正常。咽喉声带正常。心、肺、肝、脾无异常。皮肤科情况:双手指、足趾均明显增厚，近甲缘尤厚，呈楔形，黑褐色，质硬。有明显的甲下角化，见黄色角化性物质。双足跟、足跖、足缘见角化性斑块损害，角化过度明显，(见图,)。甲板真菌镜检及培养阴性。 家系调查:对家族中,代人进行调查(图,)，患者父母均在新疆出生，长期在新疆居住，非近亲结婚。患者,例，其中男性,例，女性,例。发病时间均在,岁内，均表现为指甲、趾甲增厚及掌跖角化性斑块，其中先证者表现最重。先证者姐姐(，， ,)在,岁时患脑膜炎去世。未发病者其子代均正常，无隔代遗传现象，符合常染色体显性遗传。 家系,:患儿，男，,岁，维吾尔族，指(趾)甲增厚,年。患儿出生后十多天有指(趾)甲颜色发黄，甲逐渐增厚，并有舌苔薄白，哭时声音嘶哑。满月后双足跟开始出现少许粟粒大水疱，破溃后可结痂。满,周岁时双上肢肘关节、臀部、和下肢出现粟粒大灰褐色、毛囊角化性丘疹，数量不断增多。患儿有多汗史。体格检查:智力、发育正常，营养中等，全身浅表淋巴结未触及。毛发分布正常。头无畸形、牙齿、口腔粘膜无异常。皮肤科情况:双手指、足趾甲均增厚，边缘稍翘起，远端上翘呈楔状。两侧向内弯曲，游离缘突出，污褐色，甲表面暗黄，质硬。双上肢伸侧、臀部散在粟粒至绿豆大近皮色、褐色的毛囊性角化性丘疹。双手掌、足底无角化过度性斑块(见图,)。甲板真菌 型先夭性犀甲症中,,,、,,,基目突变点的检测培养阴性。 家系调镜检及 , 查:患儿父母均系维吾尔族，体健，长期在本地居住，非近亲结婚。患儿为头胎，足月顺产，出生时体重,,,,,。其母无人流史，孕期未服用药物。该家系中仅,人发病，属于散发病例。 目,?, ,?女,,,镕, ,止)?月口(,口音匹自“性,, ，型先天性厚甲症中,,,、,,,基因突变点的检测 ,(实验试剂 ,(, ,,,提取试剂 ,)血液基因组,,,,,量抽提试剂盒(上海生工公司,,,,,,试剂盒)。包括,,, ,,,,,,、 ,,, ,,,,,,、,,,, ,,,,,,,,(,)、,,,,,,, ,,,,,,(,)、,,,,,,,,,, ，？;)、,, ,,,,(,)、,,,,,;,, 等。 ,(, ,,,反应试剂 (,)长片段基因(大于,,,,,,)扩增试剂采用大连宝生物试剂，(,,,,,, ,, ,,,憎,,, ,,,(,(,，,,,,,,,，见表,)。 ,,,,,, ,, ,,？(, ,,,,，) ,,, ,,,,, ,,,,,,,(各,(, ,,) ,,,,,， ,, , ,, ,,,”,,,,,, ，，(,,“,,,,;,,“浓度,, ,,) ,,,,,,,, , ,, ,,,”,,,,,, ，，(,,“,,,,) ,,,,,，,,,,,(,, ,,) ,,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,,(, ,, ,,,,,，)。, ,,,,，,,,,,,, ,,,,,, ,,,(, ,,,,) ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,(, , ,,) ,,川人,,,,, ，，， ,,,,,,,, ,, ,,,,,,(, ,, ,,,,,),, ,,?，, ,,,,,,,,,，(,,“,,,,;,,“浓度,,,,),, ,(,,,，, , ,, ,,,,,,，，(,,“,,,,;,,“浓度,,,,),, ,(,,,，,,,,,,, ,,,,,, ,,,(, , ,,) ,,,,，,,,,,,, ,,,,,, ,,,(, ,,,,) ,,,,，(,,,,,,,,,的使 用当扩增,, ,;,或复杂的立体结构,,,片段时，请先使用,, ,,,,,, ，，当使用,, ,,,,,, ，不能扩增时，再试用,, ,,,,,, ，，。 (,)短片段基因(小于,,,,,,)扩增试剂采用上海生工公司试剂。包括,,？聚合酶(, ,,,，)，,,,,,？缓冲液，,,,，:(,,,,)，,,,,(,,，，,,)等。 (,)一套特异扩增,,,和,,,基因外显子的引物，(上海生工生物工程公司)。具体引物如下(见表,): , ，型先天性厚甲症中,,,、,,,基因突变点的检测 引物名称 引物 ， 碱基数 ,,,,,,,, ,,;;,,;;,,,,;,;;,,,; ,,,,,,,,, ( ,,,,,,,;;,,,,,;,,,;, ,,,,,,,,, ,,,,,,;;;,,,,,,,;;;,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,, ,,,,,,,, ,,,,;,;;,,;,,;,,;,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,;;,,,,,;,,,;, ,,,,,,,,, ;;,,;;,;,;,;,;,;,;;,; ,,,,,,,,, ;,;,;;,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,一, ;,,,,,,;;,,,,,;;,,,; ,,,,,,,,, ;,,;,;;,,;,,,,;,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,舭, ,,,,,;;,,,,,,,,,,;;; ,,,,,,,,, ,,;,,,,;,,,,;,;;,,,; ,,,,,,,一, ,,,,,,,,,,,,;;,;,,,,,,;, ,,,,,,,一, ,,;,,,,;,,,,;,;;,,,; ,,,,,,,?, ,,;;,,,,,;,,;,,,;,; ,,,(,凝胶成像及电泳试剂,),,,,溶液、琼脂糖粉、溴酚兰、,,, ,,,,,,,,(,,, ,,,,; ，,;()等。,)实验溶液配制 (,),,,,溶液(,,,,,,,,，,, ,(,) ,,,,,,, ,(,,, , 加蒸馏水溶解， 用,, ,,,几,,,,液调节,,至,(,，并定容到,,,,,,。 (,),,×,,,电泳缓冲液(,,,(,) ,,,,碱 ,,,, 冰醋酸 ,,(,，，,, ,,,,,,,?,,,, ,,(,, 加蒸馏水溶解，并定容到,,,,,,。 (,)溴化乙锭(,,)储存液(,, ,,,,,) 溴化乙锭 ,(, , 双蒸水 ,,,(, ,, (,)溴化乙锭工作液(, ,,,,,) 溴化乙锭储存液 ,,,(,,, 双蒸水 ,,,(,,, (,),(,,琼脂糖凝胶 琼脂糖 。 ,(, , ,,,工作液 ,,,(, ,, , ，型先天性厚甲症中,,,、,, ,基因突变点的检测 溴化乙锭工作液 ,,(, ,, (,),(,,琼脂糖凝胶 琼脂糖 ,(, , ,,,工作液 ,,,(, ,, 溴化乙锭工作液 ,,(,蛆,(, ,,,产物纯化和测序试剂 ,,,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳显像后，将扩增明显的片段送至大连宝生物和上海生工工程有限公司，先进行纯化后再测序。,实验仪器 (,)(,,?冰箱(中国青岛海尔公司)。 (,),,,?低温冰箱(日本三洋公司) (,),;,扩增仪(美国,,,一,,,) (,)电泳仪(北京市六一仪器厂) (,),,,,;,, ,,,,,凝胶成像系统(上海山富科学仪器有限公司) (,)电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司) (,)电子恒温三用水箱(北京市永光明医疗仪器厂) (,)台式高速离心机(上海生工生物工程技术服务有限公司) (,)微型漩涡混合器(上海泸西分析仪器厂) (,,),(,(,,,,、,,(,,,,,、,,,(, ,,,, ,,,(,,,,,,, ,;,,,,,,,, ,,,,,,;，,,,) (,,),(,(,(,,,、,(,(,,,,、,,(,,,，,,、,,,(,,,,,移液器 (,,),,, ,,,,抗凝管(，,,,,,,,公司) (,,)一次性塑料手套，一次性乳胶手套。 (,,)超净工作台,实验方法,(,基因组,,,的提取,(,(,(标本采集 抽取家系中所有患者及家系正常成员以及正常对照,,人外周抗凝血,,,，置于，,,,,,,,公司的,,, ,,,,抗凝管中，一,,?低温冰箱保存。采血前均获得家系所有成员的知情同意。,(,(,(基因组,,,提取,)将血液标本从,,,”,超低温冰箱取出，放置在一,,”,低温冰箱,,小时，从一,,”,低温 , ，型先天性厚甲症中,,,、,,,基因突变点的检测 冰箱取出放置,?冰箱解冻,,小时。,) 在,,,,,血液中加入,,,,,的,,, ,,,,,,用,,,,,,头轻轻吹打使其彻底混匀， 然后,，,,,转,分离心,分钟，弃上清。,)重复上述步骤一次，若血样仍显红色再次重复上述步骤，当沉淀为无色或淡红色后 用,,,,, ,,,,,悬浮即可。,)在准备好的,,,,,样品中加入,,,,, ,,,,,,，混匀;再加入,,, ,,,,,,,,,, ,， 混匀，,,?保温,,,,,分钟。,)加入,,,,,无水乙醇，混匀，然后用,,, ,,,头将样品全部转移到套放于,,, ,,,,,;,,,, ,,,,的,,，,,,,柱中。,)台式离心机，,，,,,转,分，室温离心,分钟。,)取下,,,,,,柱，弃去,,,,,;,,,, ,,,,的废液。将柱子放回同一根,,,,,;,,,, ,,,,中，加入,,,,, ,,,, ,,,,,,,,，,,，,,,转,分，室温离心,分钟。,)重复步骤,一次。,)取下,,，,,,,柱，弃去,,,,,;,,,, ,,,,的全部废液。将柱子放回同一根,,,,,;,,,, ,,,,中，,,，,,,转,分，室温离心,,秒，以除去残留的,,,, ,,,,,,,,。,,)将,,，,,,,,柱放入新的无菌的,(,,,离心管中，在柱膜中央加入,,,, .