嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考) (1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜; (2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度); (3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞; (4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基; (5)每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 (6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 (1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,孵育过夜; (2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基; (3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。) (4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。)到细胞内,然后孵育过夜; (5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 (6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基; (7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性: 嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放; 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期,最好存放于-20°C,保质期为2年。 Start to select on puromycin (2 ug/ml final concentration) 3-4 days posttransfection. Massive cell death will be evident after 36-48 hours selection on puromycin. Dependent on the transfection efficiency, most transfection won't establish some puromycin-resistant colonies except that the retrovirus-producing cell lines are used for generating viral vector. If the first generation lentiviral vector is used in the transfection, try to use Mo-MLV envelop expressing vector, rather than VSV/G expressing vector for packaging viral vectors. The stable colonies (try to pool the different puromycin-resistant cell colonies togehter, don't make single colony clone) will be amplified after 10-14 days selection on puromycin.