.TCA／丙酮沉淀对尿液标本中微量蛋白效果分析

.TCA／丙酮沉淀对尿液标本中微量蛋白效果分析 匈牙利移民www.ouyijuvisa.com 摘 要:目的:探讨研究TCA/丙酮沉淀法在尿液蛋白提取中的效果。方法:采用丙酮沉淀法、ACN/0.1%TFA沉淀法、TCA/丙酮沉淀法三种不同方法沉淀尿液蛋白，并经对双向电泳(2-DE) -DE结果的影响。结果:尿液样本经20,TCA/丙酮沉淀法图谱，对比三种方法对尿液蛋白2 沉淀后所得的蛋白点数及蛋白回收率分别为(392?14)%与(69.4?7.8)%，较ACN/0.1%TFA沉淀法与丙酮沉淀法的蛋白点数及蛋白回收率均有显著优势。TCA方法得到的双向电泳图谱背景清晰，蛋白点分辨率高。结论:TCA/丙酮沉淀法作为较为理想的蛋白沉淀提取方法，具有高效、简便的显著优势。 关键词:尿蛋白;蛋白沉淀法;TCA/丙酮沉淀法 尿液蛋白质组学主要是为疾病的诊断、治疗及预后的评估寻找一些新的生物标记分子，但由于尿液中往往存在大量的阴离子和碱性阳离子，它们会影响干扰蛋白质组学技术结果，因此必须对尿液样本进行特殊预处理方可清楚地显示其蛋白表达情况[1]。为探讨蛋白回收率较高且易于应用的蛋白沉淀方法，2009年1月,11月，采用丙酮沉淀法、ACN/0.1%TFA沉淀法、TCA/丙酮沉淀法三种不同方法沉淀尿液蛋白，并经对双向电泳(2-DE) -DE结果的影响。现报告如下 图谱，研究探讨几种方法对尿液蛋白2 1 资料与方法 1.1 一般资料:主要仪器与试剂:丙酮、三氯乙酸(Trichloroaceticacid，TCA)、丙烯酰胺(Acrylamide，AM)、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺、3-[3-胆酰胺丙基]-乙二胺-1-丙磺酸、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、二烷基硫酸钠(SDS)等试剂均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司，碘乙酰胺(iodacetamide)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)则购自瑞士Fluka;Sypro Ruby蛋白胶染色液购自美国Invitrogen公司;固相pH梯度IPG干胶条、IPGphor电泳仪、Protein II垂直电泳单元、高速低温离心机等试剂仪器。尿液标本均来自于本院外科住院患者，尿液样本均收集第1次晨尿中段尿约30 ml，经4?、1 500 g离心15 min去除细胞碎片，置于零下80?冰箱中存放备检[2]。 1.2 方法 1.2.1 丙酮沉淀法:取5 ml尿液样本，加入5 ml 4?丙酮溶液，二者混匀后于零下20?静置24 h，经4?低温离心15 min(10 000r/min)后弃除上清液，并将沉淀物液氮吹干备用。 1.2.2 ACN/0.1%TFA沉淀法:使用该沉淀法沉淀尿液蛋白质，经4?低温离心15 min(10 000 r/min)后弃除上清液，并将沉淀物液氮吹干备用。 1.2.3 TCA/丙酮沉淀法:取5 ml尿液标本，加入90,TCA溶液17.5 ml，零下20?沉淀24 h，后经4?低温离心15 min(10 000 r/min)，再将沉淀物置于5 ml的丙酮溶液中超声破碎重悬，再4?低温离心15 min(10 000 r/min)后弃除上清液，并将沉淀物液氮吹干备用。 1.3 评价方式:蛋白回收率=沉淀后的收集的尿总蛋白含量/沉淀前的尿总蛋白含量×100,[3]。 1.4 统计学方法:所得数据均采用SPSS 13.00软件包进行统计处理，数据以均值?标准差()表示，组间比较进行t检验，计数资料进行χ2检验，以P,0.05为差异有统计学意义。 2 结果 匈牙利移民www.ouyijuvisa.com 2.1 三种方式所得到的蛋白点数对比:见表1，其中TCA/丙酮沉淀法所得蛋白点数高于ACN/0.1%TFA沉淀法及丙酮沉淀法，ACN/0.1%TFA沉淀法比丙酮沉淀法所得的蛋白点数均值比较差异有统计学意义(P,0.05);TCA/丙酮沉淀法的蛋白回收率高于ACN/0.1%TFA沉淀法及丙酮沉淀法，ACN/0.1%TFA沉淀法高于丙酮沉淀法(P,0.01)。 表1 三种沉淀方法的效果比较() 组别 蛋白回收率(%) 所得蛋白点数均值 丙酮沉淀法 12.7?3.1 217?13 ACN/0.1%TFA沉淀法 48.2?6.9 257?16 TCA/丙酮沉淀法 69.4?7.8 392?14 P值? ,0.01 ,0.01 注:?均为TCA法与其他方法的比较，P,0.01 2.2 TCA丙酮沉淀法得到的2-DE图谱背景清晰，蛋白点分辨率高;而其余两种方法得到的蛋白点清晰度欠佳，在2-DE胶上发现有较多水平条纹存在。 3 讨论 在对尿液蛋白质组学进行研究的过程中，为消除尿液低蛋白浓度、高盐浓度的影响，屏蔽一些高丰度蛋白的作用，临床研究时往往通过透析、冻干等方法进行联合沉淀、固态提纯、离心过滤、超速离心这一系列的方式来获取蛋白。但经过一系列复杂的处理步骤，会导致结果所得的蛋白回收量较低。因此临床需要考虑通过选取回收蛋白率高、且过程最为优化的方法进行尿液浓缩以便实现尿液分析的最终目的[4]。 TCA可以消除干扰IEF的盐类物质及其他分子，降低尿液的导电能力。通过本文的比较 匈牙利移民www.ouyijuvisa.com 发现，尿液样本经20,TCA/丙酮沉淀法沉淀后所得的蛋白点数及蛋白回收率分别为(392?14)%与(69.4?7.8)%，较ACN/0.1%TFA沉淀法与丙酮沉淀法的蛋白点数及蛋白回收率均有显著优势。同时本文发现经TCA沉淀24 h所得到的蛋白回收率高于TCA沉淀仅4 h者，这说明延长沉淀时间对蛋白沉淀有着积极影响。综上所述，20,TCA/丙酮沉淀法能同时脱盐和浓缩尿液;尿液样本不需经额外分离、脱盐、冷冻干燥和其他前加工过程，步骤较为简单，故能获得较高的蛋白回收率以及高分辨率的2-DE图谱。其作为较为理想的蛋白沉淀提取方法，具有高效、简便的显著优势，值得在临床研究中广泛推广。 4 参考文献 [1] 赵旭宏,田 野,靳 胜.前列腺增生的尿液蛋白质组学分析[J].首都医科大学学报,2009,30(3):277. [2] 徐杰伟,曾桄伦.蛋白电泳检测脑脊液免疫球蛋白IgG的临床意义探讨[J].实用医技杂志,2006,13(22):4006. [3] 孙太欣,彭国光.双向凝胶电泳脑脊液蛋白质提取方法的比较[J].中国医药生物技术,2007,2(3):172. [4] 靳 胜,张 曼,张秀敏,等.双向电泳技术在筛选膀胱癌特异标志蛋白中的应用[J].中华检验医学杂志,2006,29(5):445.