阻断HCV病毒进入宿主细胞抑制剂研究

阻断HCV病毒进入宿主细胞抑制剂研究 ? 分类号 编号 密级 论文题目 陈挝蝰 副塾拯 专 业: 丝 堂 系: 院 丝堂丝工堂院 年月日原创性声明 本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。 除本文已经注明引用的内容外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研 究成果,也不包 含为获得内苤直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 指导教师签名:妞 曰 期: 在学期间研究成果使用 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘,允 许编入有关数据库进行检索,也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。 为保护学院和导师的知识产权,作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使 用涉及在学期间主要研究内容或研究成果,须征得内蒙古大学就读期问导师的同意;若用于 发表论文,版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 指导教师签名: 学位论文作者签名: 日 期:内蒙古大学硕士学位论文 阻断病毒进入宿主细胞抑制剂研究 摘要 丙型肝炎是一种全球流行性感染病,主要通过性传染、血液传染、母婴传染等。病 毒是引起丙型肝炎的主要病原体。全球约有.亿人感染病毒,并有逐年增加的 趋势。 病毒感染有可能引起肝硬化,最终导致肝癌。目前,治疗丙型肝炎的主要依靠干扰素治 疗以及干扰素与利巴韦林联用治疗策略。但这些治疗策略往往会引起一系列发热、贫血、脱 发等副作用,因此迫切需要研发新类型的抗病毒药物。我们调研文献发现当前还没有成 药的入膜抑制剂。本论文以研究入膜抑制剂为方向。 包膜糖蛋白与宿主细胞受体的结合是进入细胞的关键步骤。已有研究发现 是?的主要受体,其中.的 是与相互作用的关键区域。 在本项研究中,我们采用稳定多肽构象的策略来合成一系列模拟 二级结构的构 象锁定多肽,它们可以竞争性的与结合从而抑制与的相互作用,进而 阻断进入宿主细胞的过程。通过抗感染细胞活性实验,我们发现经构象锁定策略 修饰的多肽抗活性有很大的提高,而且找到了抗不同基因型活性最高的构象锁定 多肽.。糜蛋白酶稳定实验进一步发现.具有很强的抗酶解能力。本研究 为抗药物的研发提供了新思路,并成功找到了有潜力成为首个入膜抑制剂的构想锁 定多肽。 关键词:丙型肝炎,入膜抑制剂,构象锁定多肽,受体,糖蛋白内蒙占大学硕士 学位论文 . .,?? .. . . . .,.,.. . . ... , ? .. , . . . ? ?. . 一. .一 ? ,、’. ,. 一. . . ...内蒙古大学硕士学位论文 目录 第一章 绪论 . 丙型肝炎的概述? . 丙型肝炎病毒及治疗靶标 .. 丙型肝炎病毒?. ..丙型肝炎病毒的生命周期??. ..潜在的治疗丙型肝炎的靶标?. .. 进入宿主细胞的受体及与的相互作用??一 .. 小分子抑制剂抑制与的相互作用? ..多肽抑制剂抑制与的相互作用?. . 稳定多肽构象的策略?. ..通过反应稳定多肽构象策略?. ..通过反应稳定多肽构象策略?. .. 通过形成肟稳定多肽构象策略 . 研究课题的提出. 第二章 实验部分一 . 实验仪器和试剂. .. 实验仪器 ..实验试剂 . 一一多肽的合成及纯化? ..线性一多肽合成?一 ...线性多肽的合成 .. ,构象锁定多肽一的合成..线性多肽的合成??. ..,构象锁定多肽一、一的合成.. 一~一多肽的纯化一 . 一多肽的圆二色谱实验? . 一多肽的酶稳定性实验内蒙古大学硕士学位论文 . 一~多肽的抗活性实验?一 . 实验结果和讨论. .. 一~ 一多肽的合成条件优化??一 .. 一~ 一多肽螺旋程度研究一 .. ~一多肽的酶解稳定性一 .. ~ 一多肽抑制病毒活性? 第三章 结论??一 相关实验操作和谱图数据? 参考文献实验谱图致调. 内蒙古大学硕士学位论文 第一章绪论 .丙型肝炎的概述 丙型肝炎俗称丙肝是一种全球流行性传染病。它的主要传染途径为性传染、血液传染、 母婴传染等?。目前全球大约有.亿丙肝患者,其中大部分为慢性肝炎携带者【。丙型肝炎 不仅会严重影响肝脏功能,而且还会引起许多组织以及器官的病变。流行病学研究表明:丙 型肝炎会发展为肝纤维化和肝硬化,最终会导致肝癌的产生【。当前,丙型肝炎已成为困扰 人类健康及经济发展的大敌。目前,市场上还没有一个疫苗来预防感染。这很大 程度上是由于缺乏有效的体内,外扩增系统,缺乏可信的保护性抗体以及基 因高突变性增加了疫苗研发的难度。治疗丙型肝炎的首选方法是使用干扰素策略【 。干 扰素是一类广谱抗病毒剂,它主要通过与细胞表面的受体相互作用产生抗病毒蛋白从而抑制 病毒的复制过程进而影响细胞生长,以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素治疗 方法治愈率仅为%,且得根据病人自身的年龄、病期用药。干扰素结合利巴韦林使用药效 会提高,但其会带来许多副作用如:脱发、皮疹、一过性肝损伤等。 .丙型肝炎病毒及治疗靶标 ..丙型肝炎病毒 丙肝病毒是引起丙型肝炎的主要病原体。它属于黄病毒家族,是具有荚膜单股 .。从年的确认到目前,经过几十年相关研究,的 正链冰病毒 结构正在逐步明了。目前,已知基因可以编码一个含有氨基酸的聚合蛋白。这种 聚合蛋白可以被宿主和病毒体内的酶切为三个结构蛋白,.,一个离子通道蛋白 ,六个非结构蛋白. . 。 一 ? 内蒙古大学硕士学位论文 竺塑兰皇 结构蛋白 广 。。‘‘‘‘一 ...。..。 :包膜糖蛋白 ? ??, ?? 平眵 眶成核蛋白 ?..丙型肝炎病毒的生命周期 .:丙肝病毒与肝细胞表面受体结 的生命周期主要分为以下几个过程 合然后肝细胞通过细胞膜将病毒包裹起来,继而通过细胞的内吞作用进入宿主细胞;病毒 在进入肝细胞后脱掉包裹外壳,把正链的释放到肝细胞的细胞质中;丙肝病毒的 开始在肝细胞质中进行转录、多蛋白的加工、病毒的复制;丙肝病毒进行组装并在 分子膜上发育成熟,最后通过细胞分泌装置到达胞外环境。原则上,破坏或抑制上面提到的 任一过程都可以有效的控制病毒对宿主细胞的侵害。对于一些治疗的具体靶标将会在下 一小节具体论述。 ?内蒙古大学硕士学位论文 ..潜在的治疗丙型肝炎的靶标 ??????。。、 ?蛋白是聚蛋白中连接结构蛋白和非结构蛋白的重要纽带。目前,在中 扮演的角色还不确定,但通过体外表达发现它位于内质网中并拥有由细胞质外区连接的 .【。因此它可以在 两个跨膜区。此外,的端和端都处于内质网的内腔中 内质网上形成离子通道,该通道对于的复制非常关键一。研究发现长链烷基糖 苷酶衍生物可以用过抑制的离子通道从而抑制的感染?,找到了 .细胞毒性低、副作用弱的抑制剂。 一一一.. ,一 。 /一 妊吣 如蔼 是一种具有多种功能的蛋白酶,它的丝氨酸蛋白酶活性区主要位于的末端, 蜗生酶活性区域主要位于的末端。没有独立的跨膜区,但它可以通过非共 ?。此外,在存在下蛋白酶的活 价与结合使得它固定到内质网中 性会增加。目前,的抑制剂主要有两种策略:捕捉丝氨酸抑制剂:主要通过在抑制剂 。 中加入亲电基团捕获对酶活性有重大影响丝氨酸的羟基,从而抑制.蛋白酶的活性【.蛋白酶端的六聚物切割物组成的碳末端羧酸盐‘。。组提出没有报道过的 第三种类型的的抑制剂。这种抑制剂是组成的碳末端羧酸盐的生物电子等排 体 .【】。 队。/\八 。、..一八 ’?\ ~? . 洲 ? 扣。卅。 。釜 是一种膜内蛋白 .。目前,它的功能还不清楚。通过研究只能确定它是 。 一种切断/蛋白聚合物的酶 。 是一种非结构蛋白,它的疏水端主要的功能是连接内质网与 此外,它还可以稳定。与的复合物蛋白在编码基因方面起到重要作用【。 还有可以使抗病毒药物失活的能力【。内蒙古大学硕士学位论文 是一种高疏水性非结构蛋白。它含有四个跨膜区,端以及端都处于细胞质中 ?。蛋白的主要功能是负责细胞膜的重排,如含有复制的细胞膜的形 成. 。 是一种膜连接蛋白,在它的端含有一个独特的两亲性仅.螺旋结构。和许多 .。此外,蛋白还可以 蛋白一样主要集中在内质网或内质网衍生膜上 封锁干扰素的活性,调节细胞信号通路。这些功能不仅会促进感染的持续性,而且也会导致 细胞的变化。在蛋白中有一个区域,它决定对干扰素的敏感性。突变实验已证明这个 区域也是与相互作用所必须 。是种蛋白激酶可以抑制病毒的转录,同时 也可以调节干扰素的抗病毒活性。蛋白的磷酸化蛋白在的复制过程中起到非常关 键的作用,但磷酸化的蛋白的功能及结构目前还处于空白区。最近报道有说明几个取 。 .可以通过干扰的磷酸化作用达到抑制复制的目的【 代的蝶啶 愈 : . ?,在细胞培养实验中发现它的端跨膜区域对于 也是一种膜连接蛋白 病毒的复制非常重要】。和其它蛋白一样位于内质网或内质网衍生膜上。此外, 还是一种依靠的聚合酶。这种聚合酶会在复制过程中起到催化作用。 经试验研究发现,在实验条件下也可以启动的合成,且这个过程与体内病毒合内蒙古大学硕士学位论文 来抑制聚合酶 成过程一致。目前己找到几种潜在核苷酶或非核苷酶抑制剂 的活性。 会 ..? 内部的核糖体进入位点 内部的核糖体进入位点对于在复制过程中病毒的转录非常重要。这样内部的 核糖体进入位点被认为是最具吸引力的抗的靶标。这些潜在的抑制剂是寡聚的核苷酸例 如.,由个硫代磷酸脱氧核苷酸组成【。但这种潜在的药物由于强烈的副作用而 停止【。 、糖蛋白 包膜糖蛋白、在是生命周期中非常重要的蛋白阻 。它们的跨膜区位于末 端一。、这两种糖蛋白可以异聚成非共价复合物。糖蛋白、的成熟和折 叠是一个复杂的过程。该过程往往会涉及内质网伴侣机理和二硫键的形成以及糖基化作用 。糖蛋白的主要功能是参与膜的融合过程。糖蛋白的主要功能是参与细胞与受体 结合的过程。关于以糖蛋白为靶点的抑制剂将在下一节综述。 .. 进入宿主细胞的受体及与的相互作用 病毒性肝炎的防治策略,主要由病毒和宿主两方面组成。由于为单链病毒, 缺少矫正体系基因容易发生突变,因此选取宿主的蛋白为靶标无疑将从根本上防治感 染。进入宿主细作胞为丙型肝炎病毒的生命周期中的首要步骤,已经成为抗病毒药 物的重要靶标。如果要在细胞受体这一水平上抑制病毒进入细胞还需深入的了解宿主与病毒堕茎堕奎堂堡主堂篁笙茎 之间的相互作用。多年来,病毒的研究受到严重的限制,这是由于缺少病毒培养 系统。最近培养系统的建立使得研究有了很大的突破,但当前还没有成药的抑制 剂可以抑制进入宿主细胞。 近些年的研究发现细胞表面的几种受体在进入宿主细胞过程中起到举足轻重的作 用,它们分别是 、?、 ? 、一. 、.. 一.? .。.受体是由树突细胞表达的受体,而非肝细胞自身表达。 这种受体会促进感染进而将将细胞运输到肝脏。.是一种多配体受体,它可以与几种脂 蛋白结合,包括、、。?这种受体主要表达在肝脏细胞表面。是宿 主细胞表面蛋白,它属于四次跨膜家族蛋白由四个跨膜区组成,在细胞表面形成小的细胞外 ??。是被公认的进入宿主 松散区和大的细胞外松散区 。 细胞的重要受体【 ? . 大的细胞外区含有四次跨膜蛋白显著的结构特征。在中含有四个半胱 氨酸,它们可以形成两对二硫键从而形成一个亚区。在其亚区外存在三个结构保守 的仅.螺旋结构。由于缺乏体外感染系统,最早是使用可溶.缺乏跨膜区来识别 的受体,并通过实验进一步发现 和结合常数。为 . ,。为. .的出现进一步验证了 。??、 是进入肝细胞的重要受体。内蒙古大学硕士学位论文 .拳 /\。 澄乌 :越毒 叱》小 ..? ... 研究表明非洲绿猴的不会与结合,而黑猩猩以及人类的 会与相结合,经对比人类与非洲绿猴序列发现,他们仅有四个氨基酸残 基不同,这说明这四个残基使得与相互作用具有选择性。这四个不同的残基 主要为 与大的细胞外松散区。通过大的细胞外松散区的晶体结构发现与相互 作用的这几个氨基酸主要位于一个短的结构区,这个结构区叫做 .。 测序工作指出 区参与相互作用中重要的残基是第位的异亮氨酸第位的 天冬酰胺以及第 .。 位的苯丙氨酸一 ,. .?? . 执 ;、, 厂??【?????????????????丁???????????????????厂???????一’ ? 一. 内蒙古大学硕士学位论文 ..小分子抑制剂抑制与的相互作用 .抑制剂来干扰与的 首次使用模拟侧链的小分子 相互作用。其采取的主要策略是通过使用小分子化合物干扰受体与病毒问的蛋白一蛋白相互 作用.最终发现具有抑制活性为. 抑制%时的活性以及选择性的双.咪唑化合物。 由于与相互作用是通过其疏水残基实现的,这就使得设计化合物的溶解性成为了巨 大的挑战。因此在设计化合物时,采用在不影响小分子抑制剂与相互作用的区域连 接上烷基链从而满足侧链疏水的特征要求。 杵 .尺 墩 ,少 .点’ 尚 . ,丫。厂, ? ? 等从现有的个化合物的化学库中进行筛选能与一区选择性结合 从而抑制与的相互作用的小分子【 .,它可以 。最终筛选到水杨酸苄酯 在浓度为 时对与相互作用抑制达到%。后来,该小组以水杨酸苄酯 为中心对其进行修饰,在其芳环上引入羧基。但测试结果发现这中含有修饰 结构的抑制剂活 性要低于水杨酸苄酯。 扩。飞。囝 。??叱 谚? 鬯雠内蒙古大学硕士学位论文 以上使用小分子来抑制.的相互作用有一定缺陷。在生物过程中的蛋白.蛋 白相互作用往往是依靠面与面的作用实现的。而小分子对于抑制点与点的相 互作用效果较好。 因此,使用小分子来抑制蛋白一蛋白相互作用不是最佳的策略。 ..多肽抑制剂抑制与的相互作用 年,小组提出使用位于人类.?区的肽 ?干扰..的相互作用【】。他们发现将这种肽 在水中是无结构的,当在水中加入三氟乙醇时会有利于多肽形成二级.一结 构。 此外,通过实验他们测定了这种肽与的作用最低浓度为. 抑制%时的 活性。这些结果说明多肽的螺旋程度与它的活性之间有重要的联系。 卧刚酽,?; ‖。,? 芝:一、扣 .以上研究使用多肽来直接抑制一的相互作用有在想法上有很大的突破,而 且多肽一直被认为是干扰蛋白一蛋白相互作用的理想分子。但多肽自身存在着三大缺点:多 肽一旦与母体蛋白分离它就会失去原有的结构;作为生物大分子的多肽穿透细胞膜的能力 很差;没有结构的多肽很容易被体内的酶水解,从而失去功能。以上的每一条都制约着多 肽药物的使用,因此急需找到一种可以同时克服多肽成药三大缺点的策略。内蒙古大学硕士学位论文 .稳定多肽构象的策略 生命体系中的绝大部生物过程如细胞内的信号转导,细胞的死亡以及病毒性感染都是通 过蛋白一蛋白相互作用来实现的,而作为蛋白质最主要的一种二级结构一仅.,在蛋白一蛋白 相互作用中扮演着极其重要的角色。因此,人们积极寻找各种化学的手段来完成对多肽. 结构的稳定,并且将这种构象锁定的多肽作为抑制剂,用于干扰蛋白一蛋白相互作用。科学家 们认为这种构象锁定的多肽作为潜在的药物将会治疗包括癌症、免疫、新陈代谢以及传染病 在内的许多人类疾病。随着生物正交化学反应的发展,近年来国际上涌现出几类用于稳 定多肽二级结构的方法,如环关闭烯烃复分解反应,点击化学及酮酸与羟 胺的反应。在本研究中我们需要找到一种可以满足使构象锁定多肽具有抗酶解及穿透细胞膜 需求的策略来稳定多肽仅一二级结构。 ..通过反应稳定多肽构象策略 目前在生物体系中应用比较成功的稳定多肽构象的方法是由发展的通过烯烃复 分解反应稳定多肽构象的策略。通过这种方法得到的构象锁定多肽由于是依靠侧链形成. 键从而稳定多肽的..二级结构,这样会使极性酰胺键骨架减少暴露面,从而降低穿透 细胞膜的障碍。同样形成这样稳定的结构也会增加多肽对酶的稳定性。这就使得构想锁定多 肽有可能成为治疗重大疾病的潜在药物。 通过烯烃复分解反应稳定多肽构象的策略最早是由等【年提出的。该策略 主要的基本原理是:在多肽序列.位置引入侧链带有末端烯烃的非天然氨基酸,然后利用 烯烃复分解的方法将两个靠近的末端含有烯烃的侧链连接起来,从而有效提高了多肽螺旋 .。 的稳定性?/、 暑 .‖/ 内蒙古大学硕士学位论文 . 年,等人】又对这一方法进行改进,将侧链含有烯烃的丝氨酸变为侧链完 .。在文章中作者还讨论了在不同位置引入末端烯烃 全是烷基链的非天然氨基酸 氨基酸对形成螺旋程度的影响,以及桥连原子个数对烯烃复分解效率和螺旋 程度的影响。 最终找到在.位置使用两个..非天然氨基酸来稳定多肽的结构,此时反 应的转化率可达%以上,螺旋程度为原有天然氨基酸多肽的.倍。在.位置使用 ?.与?.非天然氨基酸来稳定多肽的结构,此时反应的转化率也可 .。此外,酶在选择相互作 达%以上,螺旋程度为原有天然氨基酸多肽的倍 用的底物时优先选择没有结构的底物。因此使用.桥接来稳定多肽的?二级结 构可 以有效的抵抗酶解。 ‰ 旨 渗 百粉洲 百龄 ’ 。 .? ? ?. 【一 謇 尹 芦 勺, 白? 两亲性具有【.结构的多肽是前细胞凋亡蛋白的重要组成部分,它可以调塑茎查奎堂堡主兰垡笙茎 节和抗细胞凋蛋白.的相互作用进而可以控制细胞凋亡过程。因此,如何模拟这段 具有.结构的多肽成为发展抗癌药物的重要挑战。年,成功的使 用发展的通过.键稳定多肽构象的方法合成一系列在,和.位置引入末端 为烯烃的非天然氨基酸,进而通过反应在氨基酸侧链形成极性共价键具有结构 的多肽。这种构象稳定的多肽可以有效地在体内激活细胞的程序性死亡过程。并通 过一系列实验证明了这种构象锁定的多肽具有抵抗酶解、穿透细胞膜的能力。在与一 蛋白结合时构象锁定的多肽也表现出很大的优越性,它可以将结合常数由 降低 到. ?。这是首次将.构象锁定多肽应用于蛋白一蛋白相互作用的研究, 并对构象锁定多肽的应用产生重大影响。 。/吖。一? 转录因子可以诱导细胞循环的抑制以及受损后细胞编程性死亡,此外它在保 护细胞免于恶性迁移方面也起到重要作用。泛素化酶通过与结合可以使其转录 活性丧失,进而通过泛素化作用将降解。这一过程可以直接调节细胞内的含量。药 理学上主要通过稳定肿瘤细胞中的活性,从而杀死肿瘤细胞。年,小组【 提出使用.构象锁定多肽模拟具有转录活性的【.区域,从而干扰与 间的蛋白一蛋白相互作用,使得癌细胞中的保存下来。在一系列合成的构想锁定多肽中, 该小组发现带有负电荷的构象锁定多肽不能进入细胞。因此,他们将带有负电荷的天冬氨酸 和谷氨酸突变为电中性的天冬酰胺和谷氨酰胺,使得构象锁定多肽 带有一个正电荷。这样的构想锁定多肽就可以通过主动吸收进入细胞。通过一系列优化实验 .。 最终找到抑制癌细胞效果最好的构象锁定多肽... \厂 .... 堕鍪直奎兰堡主兰篁堡茎 .信号在调节细胞的增殖、分化以及死亡等过程中起到跟重要的作用。不恰当的激 活信号可以直接导致疾病如细胞急性淋巴细胞白血病的发生。直接从转录 水平上抑制信号会使细胞产生特异性的抗增殖作用。年,和 小组【刘合成了具有细胞穿透性,稳定的仅.结构的.构象锁定多肽。这种多 肽可以靶向性的干扰转录复合物之间的蛋白.蛋白相互作用。他们还证明了 这种具有 高亲和结合能力的.构象锁定多肽可以有效的阻止活化的转录复合物的形成 .。通过使用治疗白血病细胞可以从基因范围上抑制信号活化基因。 ? ? ? . ..是一种可以治疗人类免疫缺陷病毒感染的多 ?。由于在体内 肽。它可以特异性的干扰与宿主细胞的融合过程 的稳定性及口服生物活性差,使得其在治疗方面受到很大的限制。年, 小组【提出使用.构象锁定多肽策略来增加的体内稳定性以及生物活性。在 该 项工作中他们采用在多肽序列中引入四个末端为烯烃的非天然氨基酸,进而 通过反应 形成两对.键稳定多肽的仪.构象。通过实验对比引入两对.构象锁定多肽的 .。经过一系列酶解 螺旋程度要比引入一对.构象锁定多肽的螺旋程度高二倍 实验及活性测定实验,他们证明了经构象锁定的要比线性体内稳定性 及与的结合能力都有很的提高。内蒙古大学硕士学位论文 。”“”‘ 眦 ?、,蔓『‘ 龇奏. 陀一净 冬矗, .,? ??.“二 一 矗梦褊 、?“?”‘, ?‖州滗 一 .‘:. 。 ,‘“: 一,‘‘ 慌。 , ? ? ? 邢?旺。。眯畦睚哿止州忻 ?.. ..通过反应稳定多肽构象策略 反应 是依靠生命系统中惰性的两类化学基团即炔基与叠氮基在 铜催化的条件下高效率的生成周环环化产物,从而在生理条件下实现两个分 子片断之间 的高选择性连接。这一反应由等人发展起来,在化学生物学等诸多领域中获 得了 极其广泛的应用。 ?一型.式、、 年,小组鉴于铜催化剂的生物毒性,又发展出了使用环张力诱导的无铜 点击化学方法 ?。这种高效生物正交反应很可能在稳定多肽构象中可以起到重要 作用。内蒙古大学硕士学位论文 , 、 一’??????????????’ ,, . 是感染宿主细胞所必须的区域。此外, 三种广谱中性抗体、、的作用靶标。这些中性抗体对研究相 对构想以及的中和化方面是很有用的工具。前人研究发现端抗原表是一段具 有高螺旋的构象的多肽州。在这段序列中端结合区域残基 表现出明显的弯曲构象,这一构象对于抗原表位的构象与抗体识别都非常重 要。年, 小组【使用催化的反应在树脂上实现了多肽侧链的环化,从而得到了 具有仅.构象的抗原表位端多肽 .。该小组采用在多肽序列临近 的.的位置引入侧链分别含有叠氮,炔烃的两种非天然氨基酸,进而通过侧链 的反 应得到环化的多肽。该小组发现使用以及 可以有效地减少线性 多肽的聚集提高环化的效率。实验证明侧链依靠,.三氮唑稳定的环肽具有显著的 。 ?结构。通过反应得到的活性最高构象锁定多肽与抗体结合为 ??少鬣吐?勺 , ,一. ?九 姒 :,。。,: 忙 曰 分吐撕? :, ..通过形成肟稳定多肽构象策略 酮醛与羟胺的反应是依靠生命系统中惰性的铜醛与羟胺两类化学基团在的条件下内蒙古大学硕士学位论文 高效率的生成肟偶联产物,从而在生理条件下实现两个分子片断之间的高选择性连接。 年,等人成功的应用酮醛与羟胺偶联反应成功实现未保护肽片段连接,连接 位点选择 .。该偶联反应通过脱除二氧化碳与水形成酰胺键,酮醛与羟胺不与多肽 性成肟 侧链官能团反应。 。一.。时。。。:。:.时。八。。?趾。也。.:如;如。。诅哼.,。诅叼怕卜归.?一。 ?.【】. .:如诅.。.? . 。 审?.【】.//、、::,,久?如.睁佃...? . . 年,使用酮醛与羟胺的偶联反应合成了一系列构象锁定多肽 .。 .,然后在 该策略主要采用在多肽序列中引入、或两种非天然氨基酸 的磷酸缓冲溶液中加入高碘酸钠对多肽进行氧化,使残基的侧链变为酮醛,经氧化后的 的侧链会与或羟胺侧链发生偶联形成肟结构进而稳定多肽的仅.结构。通过该方法 合成的构象锁定多肽在加入甲氧基胺时,起桥接作用的肟会被分解,这一过程会使得过象锁 定多肽变为无结构多肽。该小组在进行试验时发现合成的构象锁定多肽的螺旋程度较天 然线性肽低。这说明该种方法合成构想锁定多肽还存在着许多挑战。 .????一 ???? . ?.内蒙古大学硕士学位论文 丫~ 、八。 丫。 \ 二\ 、 占、: 小.、、、\。 . . . .研究课题的提出 针对发展入膜抑制剂的重要性,以及已有小分子和多肽抑制感染宿主细胞的不 足。我们选择以构象锁定多肽干扰一与相互作用 .为研究方 向,反应稳定多肽构象为合成策略,筛选出活性最高的第一个入膜抑制剂为最 终目标。该项研究不论对基础研究还是应用研究都有重要意义。首先,目前还没有关于抗 病毒入膜抑制剂的报道,我们的研究可以填补这方面的空缺;其次,入膜抑制剂作为一种重 要的潜在抗病毒药物,在治疗各种病毒感染疾病中有着重要的应用价值。基 于此,我们设计 . 的类似物将竞争性的与相结合,从而阻断宿主细胞受体与 相互作用,进而阻止病毒进入宿主细胞。结合前面稳定多肽二级结构的策略 综述,通过使用反应稳定多肽构象的策略合成一系列避开关键作用位点在不 同的, 位置引入两个?.以及在不同的,位置引入?.和.一的 构象锁定多肽一~一。通过对这些构象锁定多肽进行不同基因型抗感染 活性实验,最终确定最佳引入?.和?.非天然氨基酸的位置,并在此基 础上将得到抑制与?相互作用的活性最高的构象锁定多肽序列。此外,通过 抗活性实验,我们还可以找到不同基因型糖蛋白结合构象锁定多肽的能力 的差别。最后通过一系列酶解实验将测定构象锁定多肽的抗糜蛋白酶解能力, 进而得到其是 否具有了成药的基本条件.药代稳定性。内蒙古大学硕士学位论文 内蒙古大学硕士学位论文 第二章实验部分 .实验仪器和试剂 ..实验仪器 .. 品名 级别 来源 中国医药集团北京试剂公司 哌啶 中国医药集团北京试剂公司 苯酚 二氯亚砜 中国医药集团北京试剂公司 北京博迈杰科技公司 ,一二甲基甲酰胺内蒙古大学硕士学位论文 中国医药集团北京试剂公司 乙醇 中国医药集团北京试剂公司 二氯甲烷 吡啶 中国医药集团北京试剂公司 北京博迈杰科技公司 一羟基苯并三唑 醋酸酐 中国医药集团北京试剂公司 乙腈 色谱纯 北京博迈杰科技公司 苯并三氮唑...’.’.四甲基脲六氟磷 北京博迈杰科技公司 酸酯 .四甲基 .一偶氮苯并三氮哗.,,’, 中国医药集团北京试剂公司 脲六氟磷酸酯 .’.二异丙基碳二亚胺 中国医药集团北京试剂公司 二异丙基乙基胺 中国医药集团北京试剂公司 三氟乙酸 北京博迈杰科技公司 三异丙基硅烷 中国医药集团北京试剂公司 ? 北京欧凯纳斯试剂公司 北京欧凯纳斯试剂公司? .. 北京博迈杰试剂公司 树脂 天津南开合成公司内蒙古大学硕士学位论文 . 一.多肽的合成及纯化 为了得到对病毒进入宿主细胞抑制活性最高的的多肽,我们使用稳定 多肽构象策略合成一系列在不同位点进行构象锁定的。.?, . . 一 . 一. 一 一 &坠?&坠 斜体代表...相互作用的关键点 ..线性.多肽合成 ?。?。?’‘。?’’。。?。?’。。‘‘‘’。。‘‘ ‘。 利用手工法固相合成技术合成。树酯为硒树酯,树酯装载量为. /。具体操作步骤为:首先分别用次,次,次洗涤鼬 树酯,并用浸泡鼬树酯 进行溶胀。树酯完全溶胀后,将 抽去。使用%哌啶溶液 脱去树脂上保护基。 脱保护反应结束后,树酯分别用次,次,次洗涤。用将 倍当量当量以树酯上可反应的基团量为标准,具体算法为:树酯的装载量乘 以所做树酯的 重量的..,.倍当量的,倍当量的或者不加完全溶解 的量以没过树酯的量为准,然后将倍当量的加入到上述溶液中,活化氨基酸 约 ,加入到树酯中,室温反应 ,反应过程中利用摇床不断震荡反应容器。反应结束 后,树酯分另用次,次,次洗涤。一【一基团利用%哌 啶溶液浸泡,每次 的方法进行脱除,脱除后再用次, 次进行树酯的洗涤。剩余的多肽采用优化的原位中和,活化的/固相合成技 术进行合成。多肽的切除阶段,我们在干树酯中加入 切割试剂:: :.:.,室温反应 。将溶液过滤,树酯用洗涤,将滤液汇合,用高纯将内蒙古大 学硕士学位论文 吹干,用冰乙醚进行沉淀,离心,得到白色沉淀。 . 利用高效液相色谱, 的高效液相色谱柱进行 对粗肽的分析,流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗 脱, 从 %的到%的,流速为 . 。 /。目标多肽的出峰时间大约在 .。 .,实测 目标多肽利用?.进行分子量检测,/:】计算, ..【,线性多肽的合成 ????..一?.?一????: ?????一???一??: ???????????’。’? 所有【,线性多肽合成使用与.相同的手工法固相合成技术合成。 .。在合成中所使用的..氨基酸由于价格昂贵,所以 方法合成具体流程如 投料量只能使用倍量,同时、、的使用量分别减少为.倍当量、倍 当量、倍当量。为了保证正确连接次序在..氨基酸缩合完成后要,树酯分别 用 次,次,次洗涤,再加入试剂:::: 从而将上一个氨基酸的自由氨基封闭。在后再用次,次进行树酯 的洗涤,然后再脱除..氨基酸的氨基保护基,进行下一步缩合。 兰』 。“、/、、矽 三矗 .。. 月引 / / : 刚?内蒙古大学硕士学位论文 ..【,构象锁定多肽..的合成 ??????一??一??? 一 ..................................一 一 ???????一???一?? ........................................一 一 ?????一????? 【.............................一 在拿型,线性多肽后,使用.一二氯乙烷对其进行冲洗、抽干后在通氩气的条 件下 加入’一代催化剂的..二氯乙烷溶液 / 。’一代催化剂的使用量 /木 . 按如下方法计算:. /木 .在反应小时后,再次在氩气保护 条件下加入‘一代催化剂的.一二氯乙烷溶液 / 室温反应小时。 反应结束后使用.一二氯乙烷冲洗树脂直到冲洗液变为无色。使用%的哌啶溶 液脱 去线性多肽末端的氨基保护基,树酯分别用次,次,次洗涤,再 加入试剂::::从而使氨基末端得到乙酰化修饰。多肽的切除 阶段,我们在干树酯中加入 切割试剂’:::.:.,室温反应 。将 溶液过滤,树酯用洗涤,将滤液汇合,用高纯心将吹干,用冰乙醚进行沉淀,离 。 心,得到浅棕色沉淀。到所有,构象锁定多肽合成使用合成具体流程如 旦四 一’’、 躺 月引 诮 ? ?? ? 【: 。』』 晟 贝引 利用高效液相色谱, . 的高效液相色谱柱进行 对粗肽的分析,流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗 脱, 从 %的到%的,流速为 /。目标多肽.、一、 、. 、. 一的出峰时间分别在 。目标多肽利用....【,】线性多肽的合成 ....?.?.????一? ?..一?????一??? 所有【,.】线性多肽合成使用与一相同的手工法固相合成技术合成。方 法合成具体流程如 .。在合成中所使用的..、?氨基酸由于价格 昂贵,所以投料量只能使用倍量,同时、、的使用量分别减少为.倍 当量、倍当量、倍当量。为了保证正确连接次序在..或..氨基酸缩 合完成后要,树酯分别用次、次、次洗涤,再加入试剂 ::::从而将上一个氨基酸的自由氨基封闭。在后再用 次,次进行树酯的洗涤,然后再脱除..或?一氨基酸的氨基保 护基,进行下一步缩合。 』竺 三 』』兰 叫??? .。’ 矗 一 尉引 。 』 口兰。』』 ? 础 矗 矗 鼎 罔引 硝 , :..。固内蒙古大学硕士学位论文 .. ,.】构象锁定多肽.、的合成???早一???一?一?? 一 ????????一一??? 在拿,.线性多肽后,使用.一二氯乙烷对其进行冲洗、抽干后在通氩气的条件 下 加入’一代催化剂的..二氯乙烷溶液 / 。‘一代催化剂的使用量 / . 按如下方法计算:. / .在反应小时后,再次在氩气保护 室温反应小时。 条件下加入‘一代催化剂的..二氯乙烷溶液 / 反应结束后使用..二氯乙烷冲洗树脂直到冲洗液变为无色。使用%的哌啶溶 液脱 去线性多肽末端的氨基保护基,树酯分别用次,次,次洗涤,再 加入试剂::::从而使氨基末端得到乙酰化修饰。多肽的切除 阶段,我们在干树酯中加入 切割试剂:::.:.,室温反应 。将 溶液过滤,树酯用洗涤,将滤液汇合,用高纯将吹干,用冰乙醚进行沉淀,离 。 心,得到浅棕色沉淀。到所有【,】构象锁定多肽合成使用合成具体流程如 。 ?扣』 ?』』 矗刚科 最嘏 司引 诮 ??????????????十, : 。』 贝引 一 . 利用高效液相色谱, 的高效液相色谱柱进行 对粗肽的分析,流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗 脱, 从%的到%的,流速为 /。目标多肽、 的出峰时间分别在 、 。目标多肽利用??进行分子量检测,/: 计算,分别为、,实测、。内蒙古大学硕士学位论文 ‘ .. .多肽的纯化. 半制备的高效液相色 所有合成多肽使利用高效液相色谱, 谱柱进行纯化,流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗 脱, 从%的到%的,流速为 /。纯化后的多肽溶液经冷冻干燥机 冷冻后得到白色絮状固体。 . .一多肽的圆二色谱实验 多肽是生物活性物质,其结构的变化将会导致其活性的变化。圆二色谱法是研究稀溶液 中多肽二级结构的一种快速、简单、较准确的方法。为了考证所合成构象锁定多肽是否有 .二级结构以及它们螺旋的程度。我们将分离纯化后的构象锁定多肽,分别配制成浓度 为 的多肽溶液。然后用圆二色谱仪测试各条多肽,从而得根据实验数据得到螺旋程度 较高的构象锁定多肽。 。 构象锁定多肽一一溶解在.的磷酸缓冲液中溶度为 在 时使用.分光偏振计对不同样品进行测试。使用. 的石英比色皿采集光 /,累计次。 谱数据。分光偏振计测量参数:波长. ,步长. ,速度 每个肽的螺旋程度计算公式如下: 摩尔椭圆度/.水/./ 螺旋度摩尔椭圆度/..木 :椭圆度,:分子量,:溶度内蒙古大学硕士学位论文 . 一~多肽的酶稳定性实验 为了得到一系列构象锁定多肽抑制剂对酶解的稳定性。我们将合成.多 /, 肽及一系列构象锁定.一.多肽,溶解在.缓冲液中. 含有 上述多肽溶液 ,.得到浓度为 的一系列多肽溶液。取 并加入 ?缓冲液以及 体外糜蛋白酶 /,在恒温箱 中进 行酶解反应。在不同时间段分别取 酶反应液加入 .草酸淬灭剂使得酶解反 应停留到特定时问段。通过使用 监测不同时间段多肽的酶反应液, 从而得到其降解动力学过程。我们可以从数据中得不同时间段多肽的酶解速 率进而得到 不同位点构象锁定多肽对酶的稳定性结果,找到抗酶解能力最强的构象锁定 多肽序列并对其 序列进行进一步的优化。最终得到具有抑制病毒活性高,抗酶解能力强的构 象锁定 .多肽入膜抑制剂。 . ~一多肽的抗活性实验 为了测定构象锁定多肽对病毒的抑制活性。我们将使用真病毒检测系 .分别对其检测。此外,我们还将一种荧光素 统和假病毒病毒检测系统 基因引入到的一 。携带有这种报告基因的病毒可以通过简单的检测荧光强 度便得到感染细胞的的活性。简易的监测病毒的侵染活 .性。检测荧光的范围是王 。假病毒检测系 统的构建及检测: 或者是的 含有一的膜蛋白与核心蛋白的质粒... 膜蛋白的质粒..?与含有的骨架结构以及报告基因的质粒 ?‘.共转染细胞,小时后收集上清,用. 的滤膜过滤后,感染.. 细胞系,检测细胞的读值。将病毒稀释到的的读值为. ,的的读值为 .,用于 .~ . 多肽的检测试验。 把细胞置于空孔板,每孔加入木 个细胞,过夜培养后,将不同浓度的一~ 多肽分别与病毒一起在。孵育时后加入细胞,培养一个小时后换取新鲜 的培养基,小时后细胞裂解检测的读值。内蒙古大学硕士学位论文 真病毒检测系统的构建及检测 构建带有的.活病毒质粒,体外转录为后电转细胞,小时后收集 上清,用. 的滤膜过滤后,感染..细胞系,检测细胞的读值。将病毒 稀释到的读值为. ,用于.一.多肽的检测试验。 把细胞置于空孔板,每孔加入术个细胞,过夜培养后,将不同浓度的 孵育一小时后加入细胞,培养一个小 .一.多肽分别与病毒一起在 时后换取新鲜的培养基,小时后细胞裂解检测的读值。 通过检测细胞裂解液的读值,我们可以到不同浓度构象锁定多肽抑制感 染细胞的趋势,从而得到每条构象锁定多肽对病毒抑制浓度。最终找到对病 毒抑 制活性最好的多肽序列。 :肌 。意予口??工????????一 。 , ???????? 一??乇;工二工工一 ?。 羔粤瞧 , .实验结果和讨论 .. 一多肽的合成条件优化 在合成多肽前我们使用 软件对多肽序列进行预测,预测结果如 。在图中可以发现多肽序列中....这一段缩合难度程度很大。因此我们在合成过程 中采用了二次缩合的策略以提高困难氨基酸的缩合效率。其中第一次缩合时我们将使用 ?.策略,第二次缩合使用..策 略。在合成构象锁定多肽时需要在多肽中引入氨基酸末端带烯烃侧链的..和 ?一 .。由于这两个氨基酸价格较贵,所以在缩合完后需采用策略 将未反应的氨基封闭。另外,由于这两个氨基酸碳侧链位阻大使得缩合难度加大,所以这 两个氨基酸在缩合时使用.?策略。当氨基酸是?。.和内蒙古大学硕士学位论文 .一后一个时,也要使用二次缩合的策略从而提高困难氨基酸的缩合效率使得纯化简 单。 秘 。;囊为:赴“ : ,矗 瞳删 .尸~旷?一\。八。 / / ~掣一?叫.些习. . 。?磐。 \/鼍 ? ?? ??.. 多肽螺旋程度研究 为了得到在避开关键作用位点在不同的,位置引入两个..以及在不同的, 位置引入??和..对构象锁定多肽【.程度的影响,我们对比了 .。根据各条构象锁定多肽谱 ?构象锁定多肽的谱图 /、 图在 处的特征吸收倒峰,可以推断所有合成的构象锁定多肽都形成了稳定的 【一二级结构。在图中我们还可以发,随着 . 处特征的吸收倒峰强度增大, 的吸收值,得到各条 各条多肽的螺旋程度相应增高。根据一~一在 。 多肽的螺旋程度制成内蒙古大学硕士学位论文 . ... ..多肽的酶解稳定性 糜蛋白酶是一种用于水解肽链的蛋白酶。它可以特异性的水解肽键,属于肽链内切酶类, 且水解肽键产率很高。在水解多肽时,糜蛋白酶可以专一性的识别/?/序列, 并将其水解。通过分析.~一多肽序列我们发现只有一个糜蛋白酶可以识别 的位点.。如果多肽被糜蛋白酶水解,那么从色谱图中我们就可以明显的找到多肽保留 时间的差别。进一步分析所合成各条肽序列的特点,我们将一~可以分为 两类:第一类为一、一,它们序列中酶识别位点与引入非天然末端烯烃氨 基酸间隔较远。第二类为.、.、一、一,它们序列中酶 识别位点与引入非天然末端烯烃氨基酸间隔较近。根据调研其它酶解文献,我们推测第一类 多肽水解速度要快于第二类多肽,第一类多肽中.由于是没有结构的多肽,它的水内蒙古大学硕士学位论文 一。经过我们对糜蛋白酶解实验结果的分析,发现实验结果与我们 解速度会更快 的推测一致,并且通过各条肽的图数据可以得到各条肽的酶解速率图 .。 根据实验结果进一步证明构象锁定多肽对酶的稳定性要强于天然多肽。 /一 / /\ / 广????????????~ /殳 /.殳 十???~~?~ 爿~~?~一~~~?一~~~?~一?一饥 。鼬二二二二二二二?~~一缎、?~一 ~~~~?、\一二 ”二?一~~一?一?~~~。。。。一~一~一一一胗謦茄替 吲 ~\???~ 。。广??~?~??????????~一/飞二 条件流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗脱, 从 %的到%的,流速为 / ?. . 越 墨 。、 条件流动相为:含有.%的乙腈,:含有.%的水,进行梯度洗脱, 从% 的到%的,流速为 / 内蒙古大学硕士学位论文 . 惨 ?? . ?觏 % . ?酶, . 卜下下?.. 一多肽病毒活性 在构象锁定多肽抑隹病毒活性研究中,我们构建了一种含有 一荧光素报告 基因的病毒,该报告基因具有短的特点。携带有这种报告基因的病毒可以通 过简单的检测荧 光强度便得至感染细胞的的活性。 我们使用了具有侵染性的细胞培养物体系,以具有基因型品系的 一去评价多肽的抑制活性。在 .构象锁定多肽 一抑制活性实验中 的值 一 一抑制了侵染.. 分别为. 和. ,它们的浓度比.使用的浓度约低倍,一 。 的浓度为. 另外,我也是用了假病毒粒子浸染的细胞培养体系,以具有基因型 一抑 品系的一和具有基因型品系的去评价多肽的抑制活性。在 制活性实验中 ?,一 抑制了侵染.. 的值分别为.、. ,他们的浓度比.使 用的浓度约低 。 倍,.的浓度为. ? 在 抑制活性实验中 ,.抑制了侵染 .. 的值为. ,他们的浓度比.使用的浓 的抑制效率是不高 度约低倍,一的浓度为 。.对 的,它的值为 。我们推测这可能是结合构象锁定多肽的能力与的 ?。 基因型有关 对比, 以上这些构象锁定多肽抑制感染细胞的结果显示,与线性多肽 构象锁定多肽 在侵染 表现出增强了抗病毒的活性。这些相关.