垂体生长激素腺瘤和胚胎垂体细胞的体外分泌效应

垂体生长激素腺瘤和胚胎垂体细胞的体外分泌效应 垂体生长激素腺瘤和胚胎垂体细胞的体外 分泌效应 第3O卷第6期第566页 2ff01年l2月 同济医科大学 ActaUnivMealTongji Vol30No6P566 Dee2001 垂体生长激素腺瘤和胚胎垂体细胞的体外分泌效应 白祥军雷霆刘暌薛德麟 华中科技大学同济医学院附属同济医院脑外科,武汉430030 摘要为观察垂俸生长檄素(GH)腺瘸细胞的体外分泌效应,选择8倒垂俸GH瞧瘤和4倒胚胎垂俸,栗甩单层 细胞培养技术,在给予生长激素释放激素(GHRH),生长激素释放肽一2(GHRP一2)后,发现胚胎垂俸细胞具有明显的 分泌效应,肿瘤细胞(gsp癌基因阳性和阴性)的分泌则现各异;而生长抑素(SMS)对二类细胞均具有明显的抑制 效应.结果表明肿瘤细胞与正常垂体细胞的激素分泌途径存在差异.下丘脑对肿瘤细胞激素分泌不再有调控作用. 关薯词垂俸肿瘤;生长激素;gsp癌基因 中囝法分类号R736,4,Q343.1,Q575.II TheSecretingResponseofGrowth__hormone-?secretingPituitary AdenomasandEmbryoPituitaryCellsinvitro BaiXiangiuntLdTingtLiuKuiet DepartmentofSurgery,TongfiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversity ofScienceandTechnology,Wuh~n430030 AbstractToinveaitigatethesecretingresponseofgrowthhormone(GH)一 secretingpituitaryadenomasm v/tro,8ca*ofGH—secretingpituitaryadenomasand4ca*ofembryopituitarywereselectedtodeterminethe responsetoGHreleasinghormone(GHRH),GHreleasingpeptide一 2(GHRP一2)andsomatostain(SMS).The resultsshowedthattheembryopituitaryeelshadsignificantsecretingresponse,butamixedrespon艘to GHRHandGHRP-2wasfoundinbothgsp—positiveandgsp—negativepitut arytumors.Bothpituitarytumor andembryopituitaryshowedobviouslyinhibitiveresponsetoSIMS.Itwasdemonstratedthattherewasadiffer- enceinthehormonesecretingbetweentumorce? sandnormalpkuitarycelts.Thehormonesecretk~goftumor celtswereDotregulatedbyhyperthalamus. Keywordspituitarytumor;growthhormone;gsponcogene gsp癌基因是垂体生长激素(GH)腺瘤发生的 重要原因并在中国人垂体GH腺瘤中证实_]],而垂 体GH腺瘤在发生gap癌基因突变后GH的分泌是 否仍受下丘脑调控?我们采用单层细胞培养技术, 观察了生长激素释放激素(GHRH),生长激素释放 肽一2(GHRP.2)和生长抑素(SMS)对垂体GH腺 瘤细胞和胚胎垂体细胞的体外GH分泌效应. 1材料与方法 1.1临床 选择1997年,1999年我院神经外科收治的垂 ‘国家自然科学基金资助项且(No39670736) 白祥军.男,1963年生,医学博士.副教授 体GH腺瘤患者8例,所有患者依据临床表现,血清 基础GH水平,影像学检查和术后病检诊断为垂体 GH腺瘤.8例患者肿瘤组织经PCR.DNA直接序列 分析口有4例gsp癌基因为阳性,4例为阴性.胚胎 垂体4例,眙龄为5,6.5月,均为水囊引产,无胚 胎发育异常. 1.2垂体肿窟细胞的培养 手术切除的新鲜肿瘤组织立即置入PBS缓冲 液中冼涤2次,在PBS中用手术刀切碎,1500r/min 离心1rain,转入含0.2g/L链霉素,10U/L青霉 素,L0FCS(胎牛血清)和1g/L胶原酶的MEM 培养基中+于37C恒温摇床上消化0.5,2h,至肿 瘤细胞离散为止.离散细胞再用含lOFCS的 自祥军等.垂体生长激素腺瘤和胚胎垂俸细胞的体外分泌戢应.567’ MEM培养基洗涤1次,再混入培养基中.每例肿瘤 宴验时均将肿瘤细胞等分至l2支玻璃培养管内, 然后在37”C培养18~24h,使细胞平衡并得以贴 壁.贴壁后的细胞用培养基洗涤1次,继续培养4h, 收集培养基,浏执药前的GH浓度.然后在培养管中 加八含不同浓度GHRH(2×10,tool/L),GHRP一2 (10一mol/L),SMS(生长抑素八肽10mol/L).于 4h后收集培养基,测加药后的GH浓度.(上述药 物浓度均为最大药物效应浓度). 胚胎垂体细胞的培养同肿瘤细胞培养方法,消 化时间较垂体肿瘤组织要短,最长不超过30rnin 1.3GH浓度的检测 采用放射免疫法检测,药盒由卫生部上海生物 制品研究所生产.取待测样品100,加抗hGH血 清100,再加入”IhGH100l后充分摇匀,置室 温(20”C)17,24h,加第二抗体IO0l,充分摇匀, 37?温育lh,加聚二乙醇200l,充分摇匀,放于 4?15,2Omin,3500r/min离心20rain,去上清 液,闪烁计数仪检测. 2结果 4例胚胎垂体细胞对GHRH和GHRP一2表现 出明显的分秘效应,GHRP一2作用较GHRH作用 强,二者联台应用,分秘作用更强;SMS有明显的 抑制作用,GHRH和GHRP一2的兴奋作用可被 SMS所阻断(图1). 胚胎垂伴gsp一精 圈1旺胎垂体和gsp阳性瘤细胞分泌效应(~eg/L) 8例垂体肿瘤细胞中,gsp癌基因阴性瘤细胞有 3例对GHRH和GHRP一2表现出明显的分泌效应. 1侧无反应,对SMS均有明显的抑制效应;gsp癌基 因阳性瘤细胞对GHRH和GHRP一2及二者合并应 用,2铡表现出无反应,2铡表现出明显分泌效应, 对SMS仍表现出明显的抑制效应(圉2). 圈2胚胎垂体和gsp朗性癌细胞分泌效应(/L) 3讨论 正常垂体GH的分泌主要是受下丘脑分泌的 GHRH和SMS的调控,GHRH主要通过腺昔酸环 化酶-蛋白墩酶A系统刺激GH的分泌4例胚胎垂 体对GHRH和GHRP一2都表现出兴奋效应, GnRP一2作用较GHRH强,二者合并虚用作用更 强.推测GHRP一2不仅对蛋白激酶A系统起作用, 而且影响到蛋白激酶C系统脚,SMS对正常胚胎垂 体细胞产生明显的抑制效应,GHRH和GHRP一2的 作用可以被SMS阻断.这些结果更进一步正 常垂体细嫩对下丘醅分泌的GHRH和铈船均有较 强的敏感性和依赖性. 正常情况下,GHRH主要是通过刺激性鸟嗓呤 梭管酸结台蛋白(Gs)偶联激活腺苷酸环化酶 (AC)而发挥生物学效应,GHRH与细胞膜受体相 结台,使Gs的亚单位从Gs蛋白复合体上解离,n 亚单位上结合的GDP(Gsn.GDP为无活性状态)被 GTP取代,成为活性状态(Gsa-GTP),从而激活 AC,导致细咆内cAMP浓度的升高,激恬蛋白激酶 A(PKA),致GH分泌}由于Gs口一GTP具有内在 的GTP酶活性,很快使GTP水解为GDP而返回非 活性状态,相应的AC也返回至正常.分泌GH的垂 体腺瘤细胞,编码Gs的基因存在突变,称作为gSp 癌基因],由于gsp癌基因干扰了正常GHRH.受 体一Gs蛋白一AC通路,消除了Gs口一GTP内在的 GTP酶活性,使得AC处于持续激活状态,因此,理 论上具有御癌基因突变的垂俸腺瘤细胞GH的分 泌不受外界因素的影响,对GHRH和GHRP一2只能 产生极小的效应,表现为GH分泌减弱或无反应;相 反,在没有gsp癌基因突变的垂体GH腺瘤细胞,其 瑚咖蜘啪. ?568?同济医科土学2001年12月第3O卷第6期 AC处于正常活性状态,因而对GHRH和GHRP一2 应表现出与正常垂体GH细胞一样的强烈GH分泌 效应. 在本研究中,细胞培养却发现令人惊讶的结果, gsp癌基因阴性组对GHRH和GHRP一2表现出明 显的分泌效应,但也有1例无反应;gsp癌基因阳性 组2例对GHRH,GHRP一2无反应,对二者合并应 用也只有很弱的反应,另2例却有较强的分泌反应; 无论gsp癌基因阳性或阴性患者,对GHRH或 GHRP一2或二者合并应用所产生的分泌作用,远不 如正常垂体细胞那样敏感,出现此现象的机理尚不 清楚,但此结果表明,垂体GH腺瘤细胞与正常垂体 细胞的分泌效应存在差异性,瘤细胞不再与正常垂 体细胞一样对下丘脑激素具有依赖性,瘤细胞可能 为自主分泌性瘤,但单纯以gsp癌基因突变所造成 的腺苷酸环化酶信号传导系统的异常来解释上述现 象是不够的,产生这一结果的可能为;?瘤细胞除 了gsp癌基因所至的cAMP—PKA信号传导系统的 异常外,还存在其它信号传导系统的异常].?瘤 细胞表面GHRH受体的敏感性降低,对刺激反应减 弱Is].?瘤细胞还存在其它癌基因突变所致的促进 GH分泌的异常.近年来,越来越多的研究表明:另 外一种新发现的细胞内信号传导系统],生长激素 释放剂/受体一PIP2一IP3一蛋白激酶C系统在正常垂 体和垂体GH腺瘤GH分泌调节中起着十分重要作 用,对这一问题的深入研究将有助于进一步揭示垂 体腺瘤的发病机理. 参考文献 1白祥军,雷莲,刘瞬等.gsp癌基因在目人肢螬肥大 症垂体肿瘤中的表选.中华实验外辩杂志,2000,17 (1):18 2LeiT,AdamsEF,BuddelderMet吐Relationshipbe— tweenproteinkinasecandade~ylvlcyclaseactivityin theregulationofgrowthhormonesecretion.byhumanpi— tu[tarysomatot~.phinomas.Neurc~ttrgery,1996,39: 569 3LandisCA,MastersSB,SlmdaAeta/.GTPasein— hibitingmutationsactivatethea-chainofGsandstimu- lateadenylylcyelaseinhumanpituitarytu~ors.Natua~, 1980,340:692 4AdamsEF.LeiT,BuchfelderMa/.Bic~heraic~ characteristicsofhumanoituitary.EndocrintflMetab, 1995,80}2077 5Bresson—Bel~ldinL.Ode~aMF+l~fy-B?beL. GHRP一6stimulatescalciumincreaseandgrowthhot- l~onereleaseinhumansomatotrophs抽.End.cdI地 J,1994t2:793 6HowardAD.FedghnerSD-CullyDFa/.Areceptor inpituitaryandhypothalamusthatfunctionsingrowth hormonerelease.Scie~ce,1996,273:974 (2000—04—2O收捣) (上接第563再) 3讨论 18名健康志愿者随机交叉,多次服用武汉春天 药业有限公司生产的吲哚美辛缓释胶囊,并与法国 Ethypharm公司生产的同类产品比较,采用HPLC 检测,外标法定量测定其血药浓度.结果表明:多 次给药达稳态条件下,武汉春天药业有限公司的吲 哚美辛缓释胶囊对参比制剂的相对生物利用度为 (10,3.2O士21.90),其生物利用度符合要求.证明 了国产的吲哚美辛缓释胶囊剂型中药物被吸收进入 血液的速度和程度与进口制剂无显着差异,可以替 代进口制剂多次服用两种缓释胶囊达稳态时的 AUC,Cmax值,经统计学处理,表明两种制剂具 有内在质量的一致性. 参考文献 1顾世芬,陈汇,代宗腰等.E[标签:快照]