基因工程试题

基因工程试题 二、名词解释(每题2分，共20分) 1、Southern blotting:Southern印迹:Southern发明的一种影印转移物质的方法。 2、Cosmid vector:黏粒载体:含有cos位点的质粒载体。 3、cDNA library:cDNA文库:是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。 4、RACE:是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为反转录成 ，，cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。 5、Probe:探针:指被标记物质标记了的核酸。 6、RT-PCR:逆转录PCR:先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR。 7、Insert inactivation:插入失活，基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点，在该位点用相应的限制性内切酶处理，并将外源DNA片段插入该位点，则插入的外源DNA片段将破坏原有基因的读码框，往往导致原有的选择标记基因无法翻译达，或即使翻译表达，形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质，这一现象称为插入失活。。 8、S-D Sequence:S-D序列:在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密 ，码子及同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno发现，故后来命名为Shine—Dalgarno 序列，简称S-D序列。 9、Shuttle plasmid vector:穿梭质粒载体:指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。 10、MCS:指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 三、简答题(每题5分，共25分) 1、理想质粒载体的必备条件, 答: ?具有较小的分子质量和较高的拷贝数。 ?具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。 ?具有两种以上的选择标记基因。 ?缺失mob基因。 ?插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。 2、核酸操作的基本技术有哪些, 答:?核酸提取与纯化 ?核酸的检测与保存 ?核酸的凝胶电泳 ?核酸分子杂交 3、影响核酸保存的关键因素是什么,怎样保存核酸制品, 答:关键因素: ?保存液的酸碱度 ?保存温度 保存方法: ?一般保存可用浓盐液，NaCL-柠檬酸缓冲液或0.1mol/L醋酸缓冲液。?对DNA来说，在pH4,11的范围分子的碱基较稳定，超出此范围DNA 易变性或降解，低温、稀碱下保存DNA及低温下保存RNA均较稳定。?固态核酸通常在0?以上低温干燥保存即可。 4、合成cDNA第二链的主要策略有哪些, 答:?自身引导合成法 ?置换合成法 ?PCR合成法 ?快速扩增cDNA末端法 ?双链cDNA末端的处理 ?cDNA与载体的连接 5、基因工程诞生的理论基础是什么, 答:是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。 理论上的三大发现: ?证实了DNA是遗传物质 ?揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 ?遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 技术上的三大发明: ?限制核酸内切酶的发现与DNA切割 ?DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 ?基因工程载体的研究与应用 四、问答题(每题10分，共40分) 1 PCR技术主要应用在哪些领域, 答:?核酸基础研究 ?序列 ?检测基因表达 ?从cDNA文库中放大特定序列 ?研究已知片段邻近基因或未知DNA片段 ?进化分析 ?医学应用 ?分析生物学证据 ?性别控制 ?转基因检测。 2 细菌的限制与修饰系统有什么意义,大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示的4种表型是什么,, 答: 宿主控制的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的作用，一是保护自身DNA不受限制;二是破坏入侵外源DNA使之降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内，但是它必须被修饰成受体细胞的限制内切酶无法辩认的结构形式，才能在寄主细胞内得以生存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。 大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示，它有以下4种表型: ++ rm 野生型 kk-+ rm限制缺陷型 kk-- rm限制和修饰缺陷型 kk+- rm 修饰缺陷型 kk 3 试述5′RACE技术原理和方法。 答:PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术(RACE)。如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly(A)尾(3′末端)或附加的同聚尾(5′末端)互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得5′末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A) 尾。通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。 4大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点,真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍, 答:特点:大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。 存在的障碍: 第一，在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及16S核糖体RNA 3′末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。 第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。 第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。 8、S-D序列:在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同 ，16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno发现，故后来命名为Shine—Dalgarno 序列，简称S-D序列。 1、什么是包涵体, 重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。 2、什么是α-互补筛选, 质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)，当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。 3、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响, ?酶的纯度。 ?DNA样品的纯度。 ?DNA的甲基化程度。 ?酶切反应的温度与时间。 ?DNA分子的构型。 ?限制性核酸内切酶的反应缓冲液。 5、基因工程诞生的理论基础是什么, 是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。 理论上的三大发现: ?证实了DNA是遗传物质 ?揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 ?遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 技术上的三大发明: ?限制核酸内切酶的发现与DNA切割 ?DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 ?基因工程载体的研究与应用 四、问答题(每题10分，共40分) 1如何有效地提高外源基因的表达效率, ?提高启动子强度 ?缩短启动子同克隆基因间距离 ?高效的翻译起始序列 ?高效的转录终止区 ?提高质粒拷贝数及稳定性 ?用以下方法提高翻译水平:?调整SD序列与AUG间的距离?用点突变的方法改变某些碱基?增加mRNA的稳定性的 ?减轻细胞的代谢负荷:?诱导表达?表达载体的诱导复制 ?提高表达蛋白的稳定性，防止其降解:?克隆一段原核序列，表达融合蛋白?采用某种突变菌株?表达分泌蛋白质 2试述载体构建一般方法 A 目的基因分析(1)ORF 分析(2)酶切位点分析 B 载体选择与分析(1)多克隆位点分析(2)抗性标记分析(3)启动子与其他筛选标记分析 C 连接体系与连接时间确定 4 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么, 优点:大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。 缺点:在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白;外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。 一、名次解释(解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分) 1(魔斑: 2(转导与转染: 3(RNA干扰: 4. 融合蛋白: 5(考斯质粒: 二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能(每题2分，共10分) 1. 核酶: 2. DNA探针: 3. Klenow酶: 4.分子克隆: 5.载体: 三、分别说出5种以上RNA的功能,(10分) 四、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面,(10分) 五、说明双脱氧链终止法(Sanger法)测定DNA一级结构的原理与方法,(10分) 六、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤,(10分) 七、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。(10分) 八、在PCR扩增时，(1)PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么,有何对策,(2)PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么,应该如何改进,(20分) 载体:vector，能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 2(不相容性:incompatibility，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。 3(cDNA基因文库:cDNA library，是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。 4(环腺苷酸受体蛋白.:cAMP receptor protein，CRP，cAMP与CRP结合后 所形成的复合物称激活蛋白CAP(cAMP activated protein ) 5(核酶:ribozyme，具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能(每题2分，共10分) 1 SD序列:是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。. 2. Klenow酶:DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’外切酶活性 3. 蓝-白斑筛选:含LacZ基因(编码β半乳糖苷酶)该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。 4. 互补干扰RNA:micRNA，或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 5. 限制性内切核酸酶:常简称为限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的水解酶。 三、典型的DNA重组实验通常包含几步,(10分) ?提取供体生物的目的基因(或称外源基因)，酶接连接到另一DNA分子上(克隆载体)，形成一个新的重组DNA分子。 ?将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 ?对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 ?对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。 四、PCR的基本反应过程包括哪些,反应体系需要什么条件,(10分) PCR的基本反应过程包括:变性、退火、延伸三个阶段。(5分) 需要具备的反应条件包括:a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物(约20个碱基左右)。b、具有热稳定性的酶如:TagDNA聚合酶。c、dNTP。d、作为模板的目的DNA序列。(5分) 五、植物遗传转化技术分为几类,分别举例说明。(10分) 按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类(2分): 以载体为媒介的基因转移:就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将个源基因转入植物细胞的技术，如农杆菌介导的转化。(4分) 基因或DNA的直接转移:DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术，如电激和电注射法、基因枪法、微注射法等。(4分) 六、分子克隆常用载体有哪些,它们都具备什么样的基本条件,根据DNA分子克隆的目的，载体可分为哪几类,(10分) 目前所用的载体有细菌的质粒(如大肠杆菌质粒)、噬菌体或病毒，更多的是经过人工改造的一些载体。(3分) 用于分子克隆的载体都应具备下述条件:? 在细胞内能自主复制，即具有复制原点，可以使所携带的外源DNA在受体细胞内忠实地复制; ? 有适宜的限制酶切位点。最好是对多种限制酶有单一切点，且酶切位点不在复制原点内。 ?具备对重组体易于检测的选择性遗传标记。 (4分) 根据DNA分子克隆目的，载体可分为克隆载体、穿梭载体和表达载体三类。(3分) 七、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面,(10分) 天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建: a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。(2分) b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 (2分) c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。(2分) d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。(2分) e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。(2分) 八、PCR反应条件最关键的是温度、时间和循环数的选择，应该注意什么,(20分) 首先是温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在反应中采用三温度点法，双链DNA在90,95?变性，再迅速冷却至40 ,60?退火，然后快速升温至70,75?使引物链沿模板延伸。 ?变性温度与时间:变性温度低则解链不完全。一般情况下，93?,94?lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。(5分) ?退火(复性)温度与时间:变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。 退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30,60sec，足以使引物与模板之间完全结合。(5分) ?延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为72?，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3,4kb的靶序列需3,4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。(5分) 其次是循环次数的设置。循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30,40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。(5分) 一、名次解释(解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分) 1(魔斑:magic spot，当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 2(转导与转染:转导，transduction，指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。转染，transfection，指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 3(RNA干扰:RNA interference, RNAi，是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA 导入细 胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基5.载 体:因沉默机制范畴。 能在4. 融合蛋白:fusion protein，真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的连接原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 酶的 作用5(考斯质粒:cosmid，是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS下和区，与质粒连接构成。 外源 DNA二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能(每题2分，共10分) 片段 连接1. 核酶:具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 并运 送2. DNA探针:是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等DNA方面广泛应用。 分子 进入3. Klenow酶:DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’外切受体酶活性。 细胞 的4.分子克隆:在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入 DNA合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 分子。 三、分别说出5种以上RNA的功能,(10分) 1)转运RNA tRNA 转运氨基酸 (2分) 2)核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成 (2分) 3)信使RNA mRNA 蛋白质合成模板 (2分) 4)不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体 (2分) 5)小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接(2分) 6)小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 7)反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用 8)核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA 四、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面,(10分) 天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建: a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。(2分) b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 (2分) c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。(2分) d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。(2分) e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。(2分) 五、利用双脱氧末端终止法(Sanger法)测定DNA一级结构的原理与方法,(10分) 原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH，一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止;二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长，直至参入下一个ddNTP。根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。 (6分) 方法是分成四组分别为ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA序列。 (4分) 六、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤,(10分) a、提取供体生物的目的基因(或称外源基因)，酶接连接到另一DNA分子上(克隆载体)，形成一个新的重组DNA分子。 (3分) b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 (2分) c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 (3分) d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。(2分) 七、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。(10分) 1)抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针 (2分) 2)多数克隆载体均带有抗生素抗性基因(抗氨苄青霉素、四环素)。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。(3分) 3)在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。 如pUC质粒含LacZ基因(编码β半乳糖苷酶)该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。(5分) 八、在PCR扩增时，(1)PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么,有何对策,(2)PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么,应该如何改进,(20分) (1)PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。(5分) 其对策有:?必要时重新设计引物。?减低酶量或调换另一来源的酶。?降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。?适当提高退火温度或采用二温度点法(93?变性，65?左右退火与延伸)。(5分) (2) PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。(5分) 其对策有:?减少酶量，或调换另一来源的酶。?减少dNTP的浓度。?适当降低Mg2+浓 度。?增加模板量，减少循环次数。(5分) 苏州大学基因工程(02级生物技术专业)试题(A卷) (2005.12) 姓名 学号 得分 一 名词解释(4分/题,共20分) 重叠基因 不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用,将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因 2..锌指结构 由两个半胱氨酸(Cys)残基和两个组氨酸(His)残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构, 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位, 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关 3..ScFv 它是由抗体重,轻链的可变区基因(VH,VL)之间通过一段编码连接肽基因,拼接后表达形成的重组蛋白.是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段,可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用.其优点是分子量小,易于穿透组织到达靶器官发挥功效,易于构建和生产,但易于被清除. 4..基因置换 是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换,使致病基因永久地得到更正. 5.基因敲除 基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术. 二 填空题 (3分/题,共15分) 1. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 插入序列 , 转位子 ,噬菌体Mu和D108 . 2. Klenow酶在 有 dNTP 情况下,呈现DNA聚合酶活性,在 没有dNTP 情况下呈现外切酶活 性. 3. 外源基因在原核细胞中表达,常用的启动子有 乳糖启动子 ,Trp启动子 , Tac启动子 ,噬菌体的PL和PR启动子 , 脂蛋白启动子 . 4. 在LacI标记基因插入外源基因,经IPTG诱导,在X-gal培养基中显白 色,为 阳性 克隆,未插入基因的克隆显 蓝 色,为 阴 性克隆. 5. 基因序列经碱基替代,缺失或插入后,可使遗传信息产生三种不同的后果,分别为 同义突变 , 错义突变 ,无义突变 . 三 是非判断题 (2分/题,共10分) 1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶,因此该酶既可修复基因序列中的缺口,也可修复裂口. ( × ) 2.质粒提取后,在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高,当为三条带时为纯度不高.( × ) 3.COS位点,COS质粒,COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端.(× ) 4.入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点,替换型载体有2个成对的限制性酶切点.(? ) 5.原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列,以利于进行有效的转录.(× ) 四.不定项选择题(3分/题,共15分) 1. 下列生物体的细胞基因组哪些会有断裂基因 ( AB ) A.动物 B.人 C.细菌 D.噬菌体 2. 真核细胞基因表达的特点为 ( AD ) A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译分开分步进行 3. 识别基因序列不同,但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为 ( B ) A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶 4. pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件 ( ABD ) A.AmPr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点 5. λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为 ( D ) A.小于λ噬菌体DNA的50% B. 小于噬菌体DNA的75% C.大于λ噬菌体DNA的105% D.为λ噬菌体DNA的75%,105% 五 问答题 (8分/题,共40分) 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在,能否在原核细胞中表达 能,为什么不能,为什么 不能,因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统.原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子, 以催化RNA的合成. 基因表达是以操纵子为单位,操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的.因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列. 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率 目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶(如EcoRI)消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ? 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景.为了防止载体的自我环化,通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5'-P以抑制DNA的自我环化.在连接反应中, 具有5'-P,的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于 线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复.如第二章图2-6 ? 双向插入 经单一限制核酸内切酶(如EcoRI)切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA.若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体,可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆. 真核表达调控的顺式作用元件有哪些 其作用特点是什么 顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列的DNA片段, 决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应,按功能可分为启动子,增强子,沉默子,衰减子和终止子等DNA序列片段. ? 启动子 真核基因启动子是基因表达时与基因转录起始有关的5'端DNA序列,包括在-30bp区富含有AT的典型TATA盒(框)(TATA box)和在-70,-80bp区域(在TATA box上游)启动元件.前者是引导RNA聚合酶?在正确起始位点转录mRNA所必需的DNA序列, 即保证转录的精确起始.后者UPE是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列,后者的序列常为GGTCAAT和GGGCCC序列, 称为GC box, 它们经协同作用,以调控基因的转录效率. 启动子的转录效率因细胞而异,因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子,以便真核基因的高效表达.常用的启动子有Rous肉瘤病毒启动子RSV和巨细胞病毒的启动子CMV.还有SV40早期启动子, 腺病毒的晚期启动子. ? 增强子 增强子是使启动子的基因转录效率显著提高(增强转录活性)的一类顺式作用元件,其本身不具有启动子活性,是由多个独立的,具有特征性的核苷酸序列所组成.其基本的核心组件常由812bp组成, 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在.增强子一般有以下特性:?增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率;?增强子对同源或异源基因都有效; ?增强子的位置可在基因5'上游,3'下游或内部; ?无方向性,增强子从5'?3'或是从3'?5'均可对启动子发挥作用; ?增强子可远离转录起始点; ?增强子一般无基因特异性, 对各种基因启动子均有作用, 但具有组织或细胞特异性. 典型的增强子首先发现于SV40的病毒中, 为SV40的早期基因增强子, 约200bp, 含2个72bp的重复序列, 位于早期启动子上游, 增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍,因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用.近些年来,来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒(CMV)增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达. 增强子能增强启动子的转录能力,有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上, 在某些情况下, 表达产物可能具有细胞毒效应.因此,最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子, 诱导型启动子有热休克启动子,金属硫蛋白启动子,糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子,热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高,重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性. ? RNA剪接信号 多数高等的真核基因都含有内含子序列, 在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子.虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后, 其表达不受有或无内含子的影响, 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在.一般来说,在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号, 以提供外源基因cDNA表达的需要.常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等. ? 负调控元件 沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列, 称为负调控元件, 它们与反式作用因子相互结合而起作用.这些负调控元件不受距离和方向的限制,并可对异源基因表达起作用. ? 终止子和polyA信号 真核基因转录的确切终止信号和终止机制, 目前尚不清楚, 终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的, 在不明机制下发生转录终止.现在已发现模板DNA分子的3'端有转录终止信号序列, 称终止子.通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件.一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列.现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3'端的一段序列, 其中也包括3'端不翻译区.如SV40小t抗原和β-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体. 一般认为polyA的存在增加了mRNA分子的稳定性,使之能成功地进行翻译.准确而有效地进行多聚腺苷酸化需要两种序列:?位于polyA位点下游的GU丰富区或U丰富区; ?位于polyA位点上游的11,30个核苷酸处的一个由6个核苷酸组成的高度保守序列(5'-AAUAAA), 这些序列与转录后的RNA切割和加尾有关.最常用的polyA信号是用SV40的一段237kb的BamHI-BcLI酶切片段, 它包含早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号, 两套信号分别位于不同的DNA链上, 作用方向相反, 它们对mRNA的加工都同样有效. 在双启动子的表达载体中,启动子的转录方向为同向时,上游启动的转录由于会穿过下游启动子,这样就使得下游的转录受到极大的影响,造成下游转录水平的下降,但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后,上游启动子对下游启动子的影响就被消除了,这样下游启动子的表达量会有明显提高.当两个启动转录方向相反时,基因表达可能会被转录形成的反义RNA所抑制, 这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么 (1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV),丙型肝炎病毒(HCV),戊型肝炎病毒(HEV),EB病毒(Epstein-Barr病毒,EBV),巨细胞病毒(CMV),人乳头瘤病毒(HPV),麻风杆菌,疾原虫,血吸虫等. (2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体,前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I),人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV),还有EBV,CMV,HPV等.后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV),肾综合征出血热病毒(HFRSV); (3)常规疫苗免疫效果差,如霍乱和痢疾菌苗;或者反应大,如百日咳和伤寒菌苗. (4)能大大节约成本,简化免疫程序的多价疫苗,如以痘苗病毒,腺病毒,卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌; 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法 简述其原理. 将特异的反义基因重组到表达载体上(病态载体或质粒),导入靶细胞中转录出反义RNA,形成双链RNA(RNA/RNA双链体),阻碍基因的翻译. 人工合成寡聚脱氧核糖核酸(ODN)经过化学修饰导入细胞,与mRNA和DNA结合,形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体,影响基因的翻译或转录. 特异性的核酶,根据癌基因设计出特异的"锤头"或"发夹"结构,它能够催化切割,降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译.