化浊行血汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积和细胞死亡的影响

化浊行血汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积和细胞死亡的影响 化浊行血汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠的 脑梗死体积和细胞死亡的影响 世界科学技术一中医药现代化?基础研究 摘要:目的:研究化浊行血汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学,脑梗死体积和细胞坏死,凋亡 的影响.方法:用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,检测脑梗死体积,并比较其神 经功能行为积分;应用流式细胞仪和Annexin—V试剂盒检测缺血中心区和缺血半暗带区的细胞坏死 率和凋亡率.结果:与模型组比较,治疗组脑梗死体积明显缩小(p<0.01),治疗组大鼠神经功能行为 积分明显下降(P<0.01),缺血半暗带区的细胞坏死率和凋亡率明显降低(P<0.05).结论:化浊行血 汤可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,改善脑缺血后神经行为症状,降低缺血半暗带区的细 胞坏死率和凋亡率. 关键词:血浊脑梗死化浊行血汤细胞凋亡 急性脑梗死是临床的常见病和多发病.当前中 医对本病的治疗多集中在补虚,化痰,活血化瘀,通 络等治法,然而多年的研究表明以上诸法虽都有一 定治疗作用,但是其临床疗效均不够理想.作者总结 "概念 临床,结合中医学发展的规律,提出"血浊 和脑血辨证的理论.血浊是指血液受各种因素影响. 失却其清纯状态,或丧失其循行规律,影响其生理功 能,因而产生扰乱脏腑气机的病理现象.换言之,血 液变稠,变脏,变质以及循行障碍皆可称之为血浊【". 血浊作为一种全新的中医病理学概念,与急性脑梗 死的发生,发展以及预后有着极为密切的关系.本研 究以脑血辨证为依据,从血浊这一病理改变入手,组 收稿日期:2oo7—05—08 修回日期:2oo7—08—28 方化浊行血汤,并利用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型研究该方对MCAO大鼠缺血再灌注损伤的治疗 作用 一 ,材料与方法 1.试剂与仪器 (1)试剂. 10%水合氯醛(天津市科密欧化学试剂开发中 心);PBS(磷酸盐缓冲液,pH:7.4);红四氮唑 (2,3,5-triphenyhetrazoliumchloride,国药集团化学试 剂有限公司,批号:NO.20060313). (2)仪器. SDQ一30双极射频电凝器(上海手术器械厂); SPX一80生化培养箱(上海跃进医疗器械厂);Annexin 六联系人:马学盛,讲师,医学博士,主要研究方向:脑血管病的及基础研究,Tel:0531 —89628077,E—mail:maxsh@sina.com;王新陆,本刊编委, 教授,山东中医药大学校长,主要研究方向:神经内科的临床研究. [DrScienceandTechnology~ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateria Medica]76 2008第十卷第一期*Vo1.10No.1 V试剂盒(购于CaitagLaboratories公司);流式细胞 仪(FACSCalibur流式细胞仪,美国BD公司产品);光 学相差显微镜(美国AOSientificInstrument). 2.实验动物与分组 雄性Sprague-dawley大鼠.体重300~20g.购于 山东中医药大学动物中心. 符合国家二级实验动物.大鼠术前12h禁食,自 由饮水. 3.实验方法 (1)模型制备. 采用Longa等【21所报道的线栓法建立大鼠大脑中 动脉缺血(MCAO)模型.用1O%水合氯醛腹腔麻醉 (0.3mL/100g),于颈部正中切开皮肤,暴露左侧颈总, 颈外及颈内动脉.结扎颈外动脉远端后,于其近端插 入直径0.28mm尼龙线.将尼龙线缓慢沿颈内动脉向 颅内推进,进线约18mm左右.略感阻力.即到大脑中 动脉起始部,阻断左侧大脑中动脉2h后.将尼龙线 拔至颈外动脉残端,剪断尼龙线,缝合皮肤切口.假 手术组除不插入尼龙线,余步骤同上. (2)治疗方法. 治疗组大鼠灌服化浊行血汤浓缩液(化浊行血 汤由荷叶15g,焦山楂10g,决明子15g,赤芍10g, 酒大黄l0g,路路通10g,虎杖10g何首乌10g组 成),每天1次,每次根据大鼠体重10mL/Kg(即19.8 g/Kg,灌胃量为成人临床剂量的l0倍),模型组及假 手术组予以等量生理盐水灌服等量生理盐水,模型 组和治疗组均于造模后6h内灌胃,以后每日1次连 续5日. (3)观察方法. 神经功能缺损评分:参照改良的Bederson氏6 级评分标准[3-41.主要通过观察动物的行为变化进 行神经功能缺失的评分.0分:无神经功能缺失症 状;1分:提大鼠尾,见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正 常伸直,伸向地面;2分:向瘫痪侧推时感阻力较对 侧明显降低;3分:大鼠爬行时向瘫痪侧旋转;4 分:大鼠爬行时向瘫痪侧倾倒;5分:不能行走,伴 有意识障碍. 脑梗死体积测定:每组大鼠于造模5d神经功能 缺损评分后迅速断头取脑,去掉嗅球,小脑和低位脑 干.剩下的部分沿视交从前至后立即冠状切成5片. 经2%TFC37?染色30min后.用lO%的福尔马林缓 冲液过夜固定.经染色后,正常组织染成均匀的玫瑰 红色,而梗塞灶呈白色.固定后用数码相机(SONY. V3,JAPAN)拍照,用病理图像分析软件测量各层梗 死灶面积并储存,计算体积.V=?[(Sl+ S2)+2xH](V:总容积;S1,S2:每一切片上下两面病 灶面积;H:层面厚度)[51,以梗死灶体积占全脑体积的 百分率进行分析. 细胞凋亡和坏死率检测:用Annexin—V凋亡试剂 盒检测.每组大鼠于造模5d神经功能缺损评分后迅 速断头取脑,处死后立即取脑.在前囟0.8,0.7mm 处做冠状切片,并取大脑皮层外侧面和大脑皮层背 外侧面,分别代表梗死的中心区和边缘区[61(详见图1 及注释); 图1为MCAO大鼠经过前联合的冠状切面 (取自前囟0.8—.0.7mm).梗死区域为左侧大脑 半球的黑色区域.在缺血半球:A为大脑皮层外侧 面.属于急性脑梗死的缺血中心区:B为外侧纹状 体属于急性脑梗死的缺血中心区:C为位于梗死 区边缘的背外侧大脑皮层.这一区域可作为急性 脑梗死的缺血半暗带区;D为皮层中部属于正常 脑组织.本实验取A和C区进行研究.将所选取 的组织制成单细胞悬液后[71.实验步骤按照试剂 盒操作说明执行. 大鼠缺血侧的细胞凋亡和坏死率分别与假手术 图1脑梗死区定位和实验取样区图 77[WoddScienceandTechnology~ModernizationofTraditionalChineseMedwineandMa teriaMedwa] 世界科学技术一中医药现代化?基础研究 大鼠的相应侧进行比较.计量资料数据以均数?标准 差(又?SD)表示,数据统计以SPSSIO.0版单因素方差 分析进行处理. 二,结果 1.塞坠塑:瞳7兄金监 造模后分组后模型组15只大鼠5d有3只死 亡,治疗组15只大鼠5d有2只死亡,假手术组15 只无死亡,进入结果分析大鼠40只. 2.化浊彳于血汤对大鼠神经功能行为和脑梗死体 积的影响 神经功能行为积分比较表明,缺血再灌注后模 型组和治疗组大鼠均出现神经功能损害症状,两 组动物神经功能行为积分均显着高于假手术组(P <0.01):与模型组比较.术后第1d药物组神经功能 行为积分无显着性差异(P>O.05),而第5d有所下 降(P<0.05).相对脑梗死体积比较表明,模型组和 药物组相对脑梗死体积显着增加(P<0.O1);与模 型组比较,药物组相对梗死体积显着缩小(P< 0.05).详见表1. 3.化浊行血汤对脑缺血再灌注大鼠的神经细胞 死亡和凋亡的影响 Annexin—V和PI标记的流式细胞检测结果显 示,在缺血再灌注后,缺血中心区和边缘区均出现 凋亡和坏死两种形式的死亡细胞.且缺血中心区 死亡细胞中坏死细胞比例较高,而缺血边缘区死 亡细胞中凋亡细胞比例较高.与模型组比较,药物 组在缺血边缘区细胞凋亡率显着降低(P<O.O1), 而两组在缺血中心区细胞坏死率和凋亡率无明显 差异.详见表2. 的延长.缺血半暗带区的神经细胞则会发生凋亡和 死亡,使中心坏死区范围继续扩大[8】.超早期溶栓 治疗能及时使血管再通从而改善缺血状态实现再 灌注.然而,再灌流建立会造成神经元的进一步损 伤.再灌流时伴发的氧自由基产生,兴奋氨基酸释 放,细胞内Ca2+增高和炎性因子的产生都会诱发 神经细胞的凋亡和坏死【9】.尽管再灌流在本质上是 组织循环功能的恢复,由此可减少梗死组织的量, 但是如果能消除再灌流损伤.则可进一步减少缺血 组织的损失,从而减轻急性脑缺血造成的神经功能 缺损. 急性脑梗死及其再灌注损伤的病理机制很复 杂,多因素,多环节参与其中.从中医整体观看本 病的突出特点是血液循行障碍进而各种氧自由基, 兴奋氨基酸,炎性因子使血液变质,变脏,失去其 自身的清纯濡润之性,并进而影响脑神盼功能,瘀 浊阻滞,脑络不通,而致偏身麻木,口眼歪斜反复 发作,语言謇涩,或突然昏仆,半身不遂,语言不利 等症【11. 作者根据多年的临床经验.应用化浊行血汤治 表1三组大鼠神经行为评分,脑梗死体积的变化(x?s) 假手术组15O.00+0.O0O.00_+0.O0O.00+0.O0 模型组123.61+0.46?2.85+0.52~19.54+3.23~ 药物组133.56+0.43~2.19+0.43?13.49+2.96?? 注:?:P<O.001,与假手术组比较;?P<O.05,与模型组比较. 三,讨论表2三组脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡率,坏死率的变化(i?s,%) 急性脑梗死的病理过程主要是血管闭 塞引起局部脑血流障碍,缺血中心区神经元 缺血缺氧发生不可逆性损害而死亡.而其周 边区即缺血半暗带区,由于有侧支血流等因 素而处于灌注减少或处于临界灌注状态,可 能存活数小时.随着缺血程度的加重和时间 缺血边缘区(C区)缺血中心区(A区) 组别数量—— 凋亡率坏死率凋亡率坏死率 注:?:P<O.001,与假手术组比较;?P<O.05,与模型组比较. (WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateri aMedica]78 2008第十卷第一期?v01.10No.1 疗急性脑梗死效果理想.该方由荷叶,焦山楂,决 明子,赤芍,制水蛭,酒军,路路通,虎杖,何首乌组 成.方中荷叶苦,涩,性平,清利血浊;焦山楂酸, 甘,微温,人血分而活血散瘀消肿;决明子甘,苦, 微寒,功能清肝化浊,三药平和,化血浊,活血瘀, 用为君药.制水蛭破血逐瘀;酒大黄人血,活血祛 浊:赤芍清热凉血祛瘀.三药同用,增强化浊活血 之功,用为臣药.路路通苦,平,功能通络化浊,其 性能通行脑络;虎杖苦,寒,人肝胆经,功能活血化 瘀,清热利浊;何首乌甘,苦,涩,功能补血益脑,滋 肝补肾,使化浊行血之中而有补血之能.三药同 用,助君臣而为佐药.诸药相伍,共收化浊行血通 脑络. 本研究表明化浊行血方能明显改善MCAO大 鼠缺血再灌注神经功能损伤,减小缺血再灌注脑 损伤的体积,进一步研究表明化浊行血方能够显 着降低缺血灶边缘区的细胞凋亡率,从而发挥神 经保护作用.该方以上治疗作用的深层机制可能 与其对缺血再灌注后氧自由基,兴奋氨基酸,Ca2+ 超载,炎性因子作用有关,值得我们进一步深入研 究 参考文献 1王新陆.论血浊与脑病.山东中医药大学,2006,(9):579—581. 2LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,eta1.Reversiblemiddlecerebra arteryocclusionwithoutcraniectomyinrats.Stroke,1989,20:84— 91. 3WangCX,YangY,YangT,eta1.Afocalembolicmodelofcerebralis— chemiainrats:Introductionandevaluation.BrainResProtocols, 2001,7(2):116. 4YangY,LiQ,MiyashitaH,eta1.Usefulnessofpost—ischemicthrom— bolysiswithorwithoutneuroprotectioninafocalembolicmodelof cerebralischemia.NeruoSurg,2000,92(5):842. 5常丽英,张苏明,张新江,等.尿激酶溶栓治疗大鼠急性脑梗死的实 验研究.中国临床神经科学,2002,10(3):225. 6NagasawaH,KogureK.Correlationbetweencerebralbloodflowand histologicchangesinanewratmodelofmiddlecerebralarteryoc— clusion.Stroke1989,20:1037-1043. 7BoldyrevA,SongR,LawrenceD,eta1.Carnosineprotectsagainstex— citotoxiccelldeathindependentlyofeffectsonreactiveoxygen species.Neuroscience.1999,94(2):571~577. 8LydenP,JacobyM,SchimJ,eta1.TheclomethiazoleAcuteStroke Studyintissue—typeplasminogenactivator—treatedstroke:finalresult. 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EffectsofHua——zhuo—— xing-xueDecoctiononCerebralInfarctionVolumeandCellularApoptosis WangXinlu,MaXuesheng,WangXingcheng,LiuQ (ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355) ZhouYonghong (Q咖University,Qingdao266071) ThisstudytriestoobservetheeffectsandmolecularmechanismofHua-zhuo—— xing-xuedecoctionontreatingis-? chemiccerebralinjury.Wecreatedthemiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)ratstostudythefocalcerebralis- chemic.InordertoevaluatethetherapeuticeffectsofHua— zhuo-xing-xuedecoction,wemeasuredthechangesof MCAOratsinnervousfunctionimpairment,cerebralinfarctionvolume,apoptosis,andnecrosisrateofbraincells.We foundthatHua—zhuo—xing— xuedecoctioncouldsignificantlyimprovenervefunctionimpairmentinMCAOrats,reduc— ingcerebralinfarctionvolume,andslowingdowntheapoptosisinischemicambitus.WebelievethatHua—zhuo—xing— xuedecoctioniSdesirablefortreatingischemiccerebrallesionbyprotectingtheneversystem. Keywords:Hua—zhuo—xing—xuedecoction;bloodturbid;ischemiccerebralinjury (责任编辑:张述庆,责任译审:邹春申) 79[WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica]