壳聚糖与酪蛋白共混膜的制备及其性能研究初探 毕业论文

壳聚糖与酪蛋白共混膜的制备及其性能研究初探 毕业论文 本科毕业论文 壳聚糖与酪蛋白共混膜的制备及其性能研究 初探 院(系)名称:生命科学与化学学院 专业名称:生物技术试验班 学生姓名:X X 指导教师:XXX 二O一二年五月 BACHELOR'S DEGREE THESIS OF DONGHU COLLEGE UNIVERSITY Research on Preparation and Property of chitosan/casein Mix Membrane College : Life Sciences and Chemistry School Subject : Biotechnology Name : XXX Directed by : XXX May 2012 郑 重 声 明 本人呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，所有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经注明引用的外，本学位论文的研究成果不包含他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产权归属于培养单位。 本人签名: XXXXXX 日 期:2012年5月 I 中文摘要 本论文课题利用生物相容性良好的壳聚糖和酪蛋白交联制备出了较为理想的壳聚糖/酪蛋白复合膜，并对复合膜材料进行初步探究，复合膜中酪蛋白含量对膜的断裂强度、断裂伸长率、溶出率、吸出率等的影响。实验所得数据采用Origin 7.5 数据软件进行。结果明:酪蛋白含量的增加降低了复合膜的拉伸强度，断裂伸张率增大明显;膜的吸水率和溶出率均增大。随酪蛋白含量的增 22加，膜的拉伸强度由9.52N/cm降至7.01N/cm;断裂伸长率由53.47%增至58.35%;融出率由17.73%增加到22.95%;吸出率由48.89%增加到75.12%。研究借用生物材料复合膜的制备方法，创新在利用天然高聚物壳聚糖和天然大分子蛋白酪蛋白的交联上，不仅拓展对生物复合膜材料这个新兴发展领域的诸多认识，也对生命科学、医学、药学等相关领域提供更加广泛的可调控功能性生物材料研究方向。 关键词:生物材料;壳聚糖;酪蛋白;复合膜 II Abstract This thesis topic using biological compatibility good chitosan and casein crosslinking prepared the relatively ideal chitosan/casein composite membrane, and the composite membrane materials preliminary probe into in composite film casein content on membrane rupture strength, elongation at break, dissolving rate, the rate of absorption effect, etc. Experimental data from the Origin 7.5 data analysis software. The results showed that with the increase of the content of casein reduced the tensile strength of the composite film, fracture stretching rate increase significantly. With the increase of the content of casein, film the tensile strength of the reduced by 9.52 N/cm2 fell to 7.01 N/cm2; Elongation at break increase significantly, from 53.47% to 58.35%. And with the increase of the content of casein, composite membrane water absorption and dissolution rate increase somewhat: when casein content increased, membrane bibulous rate and dissolution rate will increase: RongChu rate increased from 17.73% to 22.95%. The absorption rate increased from 48.89% to 75.12%. This research use biological materials meet membrane preparation methods, the use of innovation in natural high precision chitosan and natural macromolecular proteins of casein crosslinking, not on developing biological compound membrane materials in the emerging field of many of the development of understanding, also to life science, medicine, pharmacy, etc to provide more extensive can control functional biological materials research direction. Keywords: Biological materials;chitosan;casein;composite membrane III 目 录 声明 --------------------------------------------------------------------------------------------------- ? 中文摘要-------------------------------------------------------------------------------------------- ? 英文摘要-------------------------------------------------------------------------------------------- ? 1.前言 --------------------------------------------------------------------------------------------------1 1.1生物材料 -------------------------------------------------------------------------------------1 1.2 壳聚糖 ----------------------------------------------------------------------------------------2 1.2.1 壳聚糖的结构性质 ---------------------------------------------------------------- 3 1.2.2 壳聚糖的生物特性 ---------------------------------------------------------------- 4 1.2.3 壳聚糖的应用 ---------------------------------------------------------------------- 5 1.3 酪蛋白 ---------------------------------------------------------------------------------------- 6 1.3.1 酪蛋白的分子性质 ----------------------------------------------------------------6 1.3.2 酪蛋白的应用 ----------------------------------------------------------------------7 1.4 本论文的工作及意义 ---------------------------------------------------------------------8 1.4.1 研究工作 -----------------------------------------------------------------------------8 1.4.2 研究意义 -----------------------------------------------------------------------------8 2.实验路线图 ---------------------------------------------------------------------------------------9 3.实验材料与仪器------------------------------------------------------------------------------ 10 3.1实验材料 ----------------------------------------------------------------------------------- 10 3.2主要实验试剂 ----------------------------------------------------------------------------- 10 3.3主要实验仪器 ----------------------------------------------------------------------------- 10 4.实验方法 ----------------------------------------------------------------------------------------- 11 4.1 酪蛋白的制备 ---------------------------------------------------------------------------- 11 4.1.1 酪蛋白的粗提 -------------------------------------------------------------------- 11 4.1.2 酪蛋白的纯化 -------------------------------------------------------------------- 11 4.2 材料的预处理 ---------------------------------------------------------------------------- 11 4.3 壳聚糖/酪蛋白复合膜的制备-------------------------------------------------------- 11 4.3.1 醋酸壳聚糖溶液 ------------------------------------------------------------------11 4.3.2 酪蛋白溶液------------------------------------------------------------------------ 11 4.3.3 混合膜的制备 -------------------------------------------------------------------- 12 4.4 复合膜结构与性能表征---------------------------------------------------------------- 12 4.4.1 复合膜的厚度测试 -------------------------------------------------------------- 12 4.4.2 复合膜的拉伸强度和断裂伸长率测试 ------------------------------------ 12 4.4.3 复合膜的溶胀性能测试-------------------------------------------------------- 12 4.4.4 复合膜的溶出性能测试-------------------------------------------------------- 12 5.结果与讨论 ------------------------------------------------------------------------------------- 14 5.1 实验结果 ----------------------------------------------------------------------------------- 14 5.1.1 复合膜机械性能 ----------------------------------------------------------------- 14 5.1.2 复合膜吸湿性能 ----------------------------------------- 15 5.2 实验讨论 ----------------------------------------------------------------------------------- 14 5.2.1 膜拉伸强度和断裂伸长率 ---------------------------------------------------- 14 5.2.2 膜溶胀、溶出性能 -------------------------------------------------------------- 15 结论 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 16 展望 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 17 参考文献-------------------------------------------------------------------------------------------- 18 致 谢 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 21 IV 1.前 言 1.1生物材料 生物材料又称生物医用材料是指对生物体进行治疗诊断和置换坏损的组织 [1]器官或增进其功能的材料。生物医学复合材料是由两种或两种以上不同材料复合而成，主要用于替换人体组织、器官，或修复其功能以及人工器官的制造。生物医学复合材料主要分为三类:有机/有机复合，金属/无机复合，有机/无机复合，其中有机/无机复合是应用研究最为广泛和深入的一类，主要用作骨修复或骨固定材料来使用。金属、高分子及陶瓷作为生物材料应用各有利弊，因而研究工作 [1]者将两种或多种材料混合，以期得到综合性能更好的生物材料。如烤瓷熔附金属假牙材料，陶瓷树脂复合材料等，无论是机械性能，还是生物相容性都有很大改进。正因为具有单一组分或结构的材料所无法比拟的性能优势，通过将不同降解特性或力学性能的材料进行复合，改变组分之间的配比就有可能得到降解速率可调，力学性能有所改善的新材料。另外，复合材料可集中多种组分的性能优点，摒弃各自的不足，使材料具备综合性能优势，更好地实现在人体内的各种组织的 [2]要求。其中董树君研究改性生物玻璃/聚乙交丙交酯(BG/PLGA)复合材料是通过对BG粒子表面进行化学接枝改性，使其能很好地把两组分各自所具有的生物可降解性、骨传导性及骨诱导性能有机地结合起来，可以均匀地分散在PLGA基体中，通过加入合适比例的改性纳米生物玻璃，可改善聚酯类材料的表面界面性质，使之更有利于成骨细胞在材料表面的生长和增殖，提高了聚酯类材料的生物 [3]活性，同时又不降低其较高的机械性能。张丽通过在聚氨酯中添加经纯化的红粘土制备出红粘土/PU复合材料，提高了聚氨酯的力学性能、生物相容性和生物稳定性，也取得了良好的效果。 因此，生物医学复合材料将成为未来医学界应用的趋势。实际上，人和动物中绝大多数组织均可视为复合材料，生物复合材料的发展为获得真正仿生的生物材料开辟了广阔的途径。 生物医学材料是指用于诊断、治疗、修复、替换人体组织、器官或增进其功 [4]能的高科技新材料。作为近30年来发展起来的一类高新技术，生物医学材料的成功应用，不仅挽救了千百万人的生命，而且大大提高了生存质量，素有人造 1 零件之称。 生物医用材料具有很高的附加值，每公斤可达1200-150000美元，而建筑材料仅为0.1-1.2美元，宇航材料也仅为100-1200美元。随着人口老龄化和治疗各类创伤的需求，近十年来生物医学材料及制品的市场一直保持20%左右的年增长率，其发展趋势己可以与信息和汽车产业在世界经济中的地位相比，正在成长为下个世界经济的支柱产业，对国民经济的发展有着不可忽视的重要作用。生物医学材料能够挽救人的生命，提高人的生存质量，具有显著的社会效益。 在我国，人口老龄化己成为社会问题，生物医学材料及制品存在着巨大的潜在市场，医疗保健服务人口基数大，医疗费用近十年平均增长率近20%，远远高于同期国民经济增长率，已逐渐成为社会和公民的沉重负担。因此，利用现代高科技，加速生物材料及制品的开发，解除千百万患者的痛苦，提高生活及健康水平，无疑是非常有意义的，也是社会发展的呼唤。生物材料及制品投入产出比高， [5]。经济效益十分显著，易于形成科技经济一体化发展，并可带动相关产业的改造加速生物材料科技经济一体化发展，对于我国参与世界经济发展竞争具有重要意义。据业内人士介绍，仅九五期间的国家复明，每年即需人工晶体5万套;国内目前每年导管需求达一亿多条，人造关节的需求量也达100多万套;775万肢残患者和每年新增的300万骨缺损患者需要大量骨修复材料，2000万心血管病患者每年需要24万套人工心瓣膜，2.3亿肝炎患者每年需要30万个人工肝，肾衰患者每年需要12万个肾透析器，2000万育龄妇女需要安装宫内节育器;我国人工关节替换年增长率高达30%，远高于美国的4%。而值得关注的是，我国自产的生物医学材料和制品所占的市场份额不足2%，技术含量高的产品主要依赖进口。国产生物医用材料与国外同类产品相比存在产品单一，档次低、质量差、缺乏知识产权的缺点。大量价格昂贵的进口产品不仅加重国家和个人的医疗费用负担，而且严重威胁到我国这一行业的生死存亡，因此采取有效措施发展生物医 [6]用材料已是我国经济和社会发展的迫切任务。 1.2 壳聚糖 壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物，又称脱乙酰甲壳素、甲壳胺，它的来源广泛，性质稳定，生物相容性和可降解性好，毒性极小，应用范围广泛。它作为能再生的能源及工业原材料，年产量仅次于纤维素。近年来，有关壳聚糖 2 的研究开发己成为基础研究前沿学科和高新技术产业热点之一，每年发表论文数 [7]。 万篇，在日本每隔三天就申报一项甲壳素/壳聚糖应用的专利 1.2.1 壳聚糖的结构性质 壳聚糖，即3(1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖胺，是一种阳离子聚合物，在135?分解，可溶解于有机酸及弱酸稀溶液中。壳聚糖具有复杂的双螺旋结构，其螺距为0.515nm，一个螺旋平面由6个糖残基组成，如图1.1所示。其大分子链上分布着许多羟基、氨基和乙酰氨基，它们会形成分子内的氢键-O?H-O-型及-O?H-N- [8]型从而导致大分子的二级结构。这将使得壳聚糖大分子之间存在一定的有序结构。根据晶态结构的不同，可以分为α、β和γ三种多晶型物。这其中α-壳聚糖是由两条反向平行的糖链组成;β-壳聚糖是由曲条反向平行的糖链组成;γ-壳聚糖是由三条糖链组成，两条同向，一条反向。其中，β-壳聚糖在6mol/L的 [9]盐酸中回转变成为α-壳聚糖，这说明α-壳聚糖对酸是稳定的。 图1.1 壳聚糖结构 壳聚糖具有较多的侧基官能团，可在伯胺基、伯羟基、仲羟基上进行多种化学反应，可像纤维素一样进行酯化、醚化、氧化、磺化、烷基化、卤化等多种化 [10]学反应。根据这些化学反应可以制备出多种壳聚糖衍生物，赋予壳聚糖更多的特殊功能。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性以及抗菌、止血和促 [11]进伤口愈合等功能，并具有良好的成膜性、吸附性、透气性和渗透性。壳聚糖的这些物理、化学和生物学上的优良性能，使得壳聚糖在水处理、食品保鲜膜、 [12]硬组织修复、药物缓释和生物诊断检测材料等众多方面得到了广泛的应用。 用甲壳素与环氧乙烷在高温、高压下反应制各的羟乙基化甲壳素可溶于水、 3 3%的乙酸和5%的氢氧化钠，具有良好的吸湿保湿性，适用于化妆品，可使头发具有自然光泽;利用Co-射线在水和醇引发羟乙基丙烯酸酯接枝壳聚糖的反应，接枝产物相对壳聚糖柬说与血液的相容性有了很大的提高。特别是磺化产品，其 [13]。聚乙烯醇(PVA)结构与肝素极其相似，可作为肝素的代用品，用作抗凝血剂 与壳聚糖共混，可以提高壳聚糖膜的选择性和延展性，该膜可以用作维生素B12渗透膜。若在共混的同时加入蔗糖、山梨醇与水可蚍起到增塑的作用，膜的伸长率和水蒸气的渗透性都大大提高，共混物的熔点可以降低100?左右。 1.2.2 壳聚糖的生物特性 (1)水溶性 壳聚糖是天然直链多糖，在其大分子链结构中含有大量的-NH和2-NHCOCH。当壳聚糖降解时，相对分子质量降低，壳聚糖分子内的氢键作用随2 之减弱，使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖分子构象 [14]的变化使得壳聚糖在水溶液中的无序程度增加，从而使其水溶性能大为改善。 (2)血液相容性 壳聚糖作为一种新型的天然生物医用材料是因为它具有良好的血液相容性。研制抗凝血性的生物材料一直是生物医学工程的一个重要课题。而壳聚糖在此方面具有独特的优良性能。实验表明N2酰化壳聚糖的抗凝血性能是随着N酰基中碳2原子数的增多而提高的，而N2酰化壳聚糖膜具有很好的血液相容性，并且与用试验的法所得到的结果相吻合。血液在物质表面凝血的机理比较复杂，对N酰化壳2聚糖膜来说，血液相容性的差异主要取决于超微结构的不同，随着N酰基中碳原2子数的增多，小纤维的微小单元的直径逐渐减小，其膜表面更加光滑，血小板粘附的数量就越少，因此抗凝血性能逐渐提高。同时在制膜过程中致孔剂用量的增加，壳聚糖膜的血液相容性降低。据国内报道，在壳聚糖上引入一定数量的磺酸 [15]基和羧基，材料的抗凝血活性也会大大提高。 (3)生物可降解性 壳聚糖在发生降解时，可能一开始就可以水解成溶于水的小分子，甚至是胺基葡萄糖。这些可溶于水的小分子单糖和多糖的碱性能使降解液的pH值升高，从而起到了止酸、消炎等多种药物的功效。当然，同一材料所制得的壳聚糖，其分子量不同时，生物降解的速度也不相同。一般来讲，壳聚糖的分子量越小，其降解的速度就越快。在研究壳聚糖混合膜中也发现膜的降解速度与壳聚糖的相对 4 含量有关，壳聚糖相对含量较少时，混合膜的降解速度就较快。而且溶菌酶对于壳聚糖的降解有明显的促进作用，目前国内在这方面的报道还不是很多，今后它 [16]。 将是一个很好的研究方向 (4)抗菌性和抑菌性 [17]低聚壳聚糖具有明显的抗菌、抑菌作用。Keiretsu对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，结果认为平均相对分子质量低于2200的壳低聚糖很难抑制微生物生长;相对分子质量大约在5500的过低聚糖能否抑制微生物繁殖视其浓度而定;当相对分子质量达到9300时，微生物繁殖能完全被抑制。夏文水等报道了甲壳低聚糖对食品中一些常见的细菌、霉菌、酵母菌的抗菌作用，其抑菌作用明显，相应最小抑菌质量浓度为1.10g/L，随着甲壳低聚糖质量浓度增加，抑菌作用逐渐变强。另外还探讨了甲壳低聚糖抗菌活性与结构之间的关系，结果表明甲壳低聚糖的抗菌活性与氨基含量和氨基质子化以及相对分子质量大小有关。陈春涛等研究壳聚糖(醋酸溶液对细菌和酵母菌的抑菌作用，结果表明壳聚糖对细菌的抑制力很强，对酵母菌的抑制力较强。 1.2.3 壳聚糖的应用 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物功能。壳聚糖及其分解产物无毒性，具有生物相容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用，经硫酸化后，能转变成肝素类似物还能起到抗凝血作用。由于肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此壳聚糖在酸性环境中对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用，可直接抑制肿瘤细胞的生长，通过活化免疫系统显示抗癌活性，与现有的抗癌药物合用可增强药物的抗癌效果。 壳聚糖在组织工程方面也有广泛的应用。组织工程学是80年代由Langer和 [18]Anticancer首先提出的新概念，其基本原理是通过种子细胞附着在生物材料表面，形成一个生物活性的种植体，当植入病变部位，生物材料降解吸收时，新的组织或器官就形成，达到修复或重建缺损的组织或器官。其核心是构建细胞和生物材料的三维复合材料，所用生物材料是一个关键，其基本要求是材料的生物相容性好、无毒、易生物降解等。壳聚糖除具有上述特点外，还含有氨基葡萄糖基元，与调控软骨细胞再生的胶原和糖胺聚糖的结构相似，因此，壳聚糖可用作软 [18]骨组织细胞附着的支架材料。 Creamer等对此做了比较全面的论述，他们将软 5 骨细胞种植在由壳聚糖与硫酸软骨素形成的水凝胶上，并与聚苯乙烯培养板作对照，发现前者附着的软骨细胞呈球形或聚多边形的正常形态，分泌的胶原主要是II型，而对照体附着的软骨细胞呈纤细状，形成的胶原主要是I型。扫描电镜的结果说明种植的软骨细胞的表面与支架材料有特殊的相互作用。壳聚糖还可用作皮肤组织和骨组织的支架材料。如一种骨生长因子BMPs与改性的壳聚糖形成杂化材料时由于机体壳聚糖的降解，释放出的BMPs促进了骨缺损处的骨组织再生。此外由于壳聚糖无毒，生物相容性良好，可被溶菌酶降解，是一种性能较好的体内植入性生物材料。用壳聚糖制成的“人造皮肤”，与宿主亲和性好，柔软度适宜、与创伤面结合密实，可以吸收从伤口渗出的体液，缓解疼痛。此外，壳聚糖还可制成手术缝合线，不仅强度好，易打结，伤口愈合后不用拆线，还能抑制炎 [17]。 症细胞向创伤周围组织的浸润，加速伤口愈合 1.3 酪蛋白 牛奶中所含蛋自质主要是酪蛋白，为全价蛋白质，含有人体必需的8种氮基酸，是优质氨基酸供给源，牛奶中酪蛋白含量约为2.6g/lOOml，占牛奶中蛋白质总量的80%。酪蛋白是一些含磷蛋白的混合物，它由α-、α-、β-和κ-酪蛋s1s2 白组成，这些混合物的平均等电点约为4.7。酪蛋白分子中有较多的脯氨酸残基 [18]其中的κ-酪蛋白和α-酪蛋白有两个半胱氨酸残基。 s2 1.3.1 酪蛋白的分子性质 酪蛋白的4种组分中，醋酸化的Ser分布于α、α和β酪蛋白中，由于4s1s2 种组分富含Pro等影响α-螺旋和β-折叠的残基，肤链总体呈伸展状。Ser的醋酸化和酸性氨基酸的高含量使4种组分在中性条件下呈负电性。 α酪蛋白是由199个氨基酸组成。醋酸化Ser残基区集中分布于40-80位，s1 加之富含酸性氨基酸，这一区域为亲水区。其余部分(1-40和81-199)为疏水区。整体来看，如同甘油磷脂那样，具有1个亲水头部和2个疏水尾部，但疏水部分比例远大于亲水区。 β-酪蛋白是由209个氨基酸组成。醋酸化Ser残基区分布在13(21位。1个亲水头部和1个疏水尾部，疏水部分比例很大。 由于酪蛋白分子的结构特点，其可被视为由亲水性氨基酸和疏水性氮基酸所 6 -酪蛋白可被视为三嵌段共聚物，其中N-端和C-端为构成的嵌段型共聚物。αs1 疏水的嵌段链，而两者之间则为亲水的嵌段链。α-酪蛋白则为四嵌段共聚物，s2 从N-端起以较为疏水段链、较为亲水段链依次交替。β-和κ-酪蛋白皆为两嵌段型共聚物，其中β-酪蛋白的N-端主要为疏水段链，而C-端主要为亲水段链， [19]κ-酪蛋白的结构与β-酪蛋白成镜像关系。 α-和β-酪蛋白结合，主要取决于疏水区相互作用，形成的复合体核心仍s1 然是一个强疏水中心。这不仅取决于二者的疏水部分所占的高比例，而且与二者的亲水部分带同种电荷的排斥作用下的外侧分散排列有关。 κ-酪蛋白和上述2种组分的结构差别较大，醋酸化Ser仅1个，由于酸性氨基酸分布略偏C端，人们一直认为κ-蛋白的N端部分处于胶粒之中，而其余 [19]部分以“纤毛”状伸向胶粒外侧，如图1.2所示。 图1-2 酪蛋白盐桥图解 1.3.2 酪蛋白的应用 酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白醋酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素(Ca、Mg)与微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD 7 参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，所以酪蛋白醋酸肽(Casein Phosphope [20]Ptide，CPPs)是最有效的促钙吸收因子之一。 以牛奶酪蛋白为原料的CPPs经过单一或复合蛋白酶的水解(再对水解产物分离纯化后得到的含有醋酸丝氨酸簇的天然生理活性肽。CPPs能促进机体肠黏膜对钙、铁、锌、硒，尤其是钙的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。CPPs是目前唯一促进钙吸收的活性肽同时在提高机体免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用闭。日本、德国等国家已把CPPs定为功能性食品，我国在这方面的研究越来越受到科学家和食品工作者的广泛关注。 由于CPPs是从天然蛋白中提取的多肽(具有致敏性小、无细胞毒性、安全可靠的优点，因此充分运用这些特点，可用于对佝偻病。牙科病和骨质疏松症等疾病的治疗:制成抗蛀牙牙膏(漱口液或含片等，还制成可促进动物体外受精和 [21]细胞融合的生化制剂等。 1.4 本论文的工作及意义 壳聚糖都是天然聚合物，酪蛋白是天然的大分子。两者都有着良好的生物相容性，在生命科学、医学等领域有着广泛的应用。 1.4.1 研究工作 本研究以合成的聚合物体系和天然的大分子体系为主，从材料的生物相容性、降解性的角度出发，分别通过壳聚糖共聚和天然蛋白质大分子交联的方法，以期获得力学性能良好、生物相容性优异的生物材料。并对复合膜材料中酪蛋白含量对膜的断裂强度、断裂伸长率、溶出率、吸出率等的影响进行初步探究。 1.4.2 研究意义 由于天然高分子材料具有性能稳定、无毒、应用安全、生物相容性好及成膜或成球性好、价格低廉等优点，受到越来越多的关注。从物理化学基础研究来看，分子结构和环境因素的调节对复合膜的结构形成与演变有着极其重要的影响，而复合膜结构的变化自然为其在相关领域的功能性应用提供了更加多样化的选择。这不仅将拓展我们对生物复合膜材料这个新兴发展领域的诸多认识，也必将为生命科学、医学、药学等相关领域提供更加广泛的可调控功能性生物材料。 8 2.实验路线图 提取酪蛋白 壳聚糖溶液 制备复合膜材料 复合膜相关性能研究 性能讨论及研究展望 9 3实验材料与仪器 3.1实验材料 壳聚糖(分析纯);雀巢脱脂奶粉;无菌封口膜;橡皮筋; 3.2主要实验试剂 3.2.1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:先配A液与B液。A液:0.2mol/L醋酸钠溶液。B液:0.2mol/L醋酸溶液。取醋酸钠固体1.66g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100mL，混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液200mL; 3.2.2 乙醇—乙醚混合液的配制:取25ml95%乙醇与25ml无水乙醚混合; 3.2.3 2%醋酸溶液:将l0ml浓度为99.9%的冰乙酸溶液倒入500ml蒸馏水中，用玻璃棒充分搅拌，使其均匀稀释，得到2%的醋酸溶液。将醋酸溶液保存至试剂瓶中备用; 3.2.4 5%氢氧化钠溶液:称取5g的氢氧化钠固体完全融在95mL的蒸馏水中，即得5%氢氧化钠溶液，保存至塑料试剂瓶中备用; 3.2.5 灭菌蒸馏水:蒸馏水分装后121?高压蒸汽灭菌后，4?保存备用。 3.3主要实验仪器 高速离心机(D-37520，Osteroda am Harz) 电子天平(JY2002，上海衡平仪器仪表厂) 分析天平(AUY120,SHIMADZU) 数显鼓风干燥箱(GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 超速离心机(D-78532 Tuttlingen，Hettich) 恒温振荡器(CHA-S，国华企业) 调速多用振荡器(HY-4，国华电器有限公司) 美的电冰箱(美的集团电冰箱制造有限公司) 10 4.实验方法 4.1 酪蛋白的制备 4.1.1 酪蛋白的粗提 将2 g脱脂奶粉在机械搅拌下慢慢加入到预热至40?、pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液100mL，至出现豆腐花状悬浮液即可。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000 r /min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 4.1.2 酪蛋白的纯化 用少量蒸馏水洗涤沉淀3次，离心5分钟(3 000r/min)，弃去上清液。 向得到的沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，离心5分钟(3 000r/min)，弃去上清液。 将沉淀用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，离心5分钟(3 000r/min)，弃去上清液，最后用乙醚洗沉淀2次，离心5分钟(3 000r/min)，弃去上清液，除去杂质得纯的酪蛋白。 4.2 材料的预处理 壳聚糖和酪蛋白均在60?下经真空干燥24 h后使用。其余试剂均为分析纯，未经特殊处理直接使用。 4.3 壳聚糖/酪蛋白复合膜的制备 4.3.1 醋酸壳聚糖溶液 常温下，称取一定量壳聚糖缓慢、充分溶于2%的醋酸溶液中，机械搅拌至完全溶解，制备质量分数为3 wt%的醋酸壳聚糖溶液。 4.3.2 酪蛋白溶液 将制得的酪蛋白溶液经纱布过滤后于4?下以7500 g速率离心脱气10 min。加入5% NaOH溶液中充分混匀分散，在50?加热30 min。冷却后持续搅拌条件下逐滴滴加到醋酸溶液中，所得溶液的浓度为3 wt%的酪蛋白溶液。 11 4.3.3 混合膜的制备 将上述3 wt%的壳聚糖溶液和3 wt%的酪蛋白溶液按照不同比例共混，经搅拌混匀、离心脱气，得到澄清透明的壳聚糖/共混液。将共混液倒入干净的方形平皿，50?烘干后加入5%的氨水浸泡5 min取出复合膜，流水冲洗，自然晾干， 4- 1保存于干燥器中备用。样品编号为CT-m。 4.4 复合膜结构与性能表征 4.4.1 复合膜的厚度测试 干燥后的样品用螺旋测微仪随机测量6个数据，取平均值得膜厚度。 4.4.2 复合膜的拉伸强度和断裂伸长率测试 壳聚糖/酪蛋白质复合膜在装有五氧化二磷(PO)干燥剂的密闭容器内放置5 25 d后，取厚度相近的膜(0.1 mm)，用裁样刀裁成长条形试样，每一种试样的数量为5个，宽为4mm，工作部分长度为50mm，用电子拉力机检测干态下的拉伸 -1强度及断裂伸长率，拉伸速率为5 mm,min。其中每个样品测试三次以上，取平 [22]均值。 拉伸强度的计算:公式(4.1)如下 P L, (4.1) (A，B) 2式中:L为拉伸强度(N/cm);P为断裂强力(N);A为试样的厚度(cm);B为试样的宽度(cm)。 断裂伸长率的计算:公式(4.2)如下 (I-I)0N, ， 100% (4.2) I 式中:I和I0分别代表断裂后及断裂前膜的强度，N为吸水率。 4.4.3 复合膜的溶胀性能测试 4-1 其中C表示壳聚糖(chitosan)，T表示;m表示壳聚糖/复合膜中的固含量百分比(m为0，10，30和50)，如当m = 0时，表示为纯的壳聚糖膜，当m = 10时，表示为酪蛋白含量为10%的壳聚糖/酪蛋白复合膜。 12 膜切成正方形试样(1.2 cm×1.2 cm)置于一定量的醋酸缓冲液(pH=7)中，在室 [23]。溶胀性能温下浸泡一定时间后取出，用滤纸吸干表面的液体，然后立即称重用吸水率S来表示:公式(4.3)如下: (m-m)0S, ， 100% (4.3) m 式中:m0和m分别代表溶胀后及溶胀前膜的质量;S为吸水率。 4.4.4 复合膜的溶出性能测试 在室温下将膜切成正方形试样(1.2cm×1.2 cm)置于盛有一定量的醋酸缓冲 [24]液的表面皿中，一定时间后取出，烘干后称重。溶出特性用其质量的损失x来表征，公式(4.4)如下: (m-m)0 (4.4) X,，100% m 式中:m0是指复合膜在醋酸盐缓冲液中降解后的质量，m是降解前膜的质量;X为溶出率。 13 5.结果与讨论 5.1 实验结果 5.1.1 复合膜机械性能 将复合膜材料用模具成型，采用电子拉力机检测干态下的力学性能，包括拉 -1伸强度和断裂伸长率。速度为5 mm,min,每个样品测试三次以上，取平均值。所得数据见表5.1，用Origin 7.5 数据软件进行分析所得酪蛋白含量对复合膜机械性能的影响，示于图5.1。 从图5-1中可以看出:随酪蛋白含量的增加，膜的拉伸强度有所减小，由 229.52N/cm降至7.01N/cm;断裂伸长率增大明显，由53.47%增至58.35%。 表5.1 壳聚糖/酪蛋白复合材料的力学性能 酪蛋白含量 CT-0 CT-10 CT-20 CT-30 CT-40 力学性能 拉伸强度/Mpa 9.52 9.34 8.93 8.52 7.01 断裂伸长率/% 53.47 54.01 55.12 56.85 58.35 图5.1 酪蛋白含量对复合膜机械性能的影响 14 5.1.2 复合膜吸湿性能 将复合膜材料烘箱后，用醋酸缓冲液检测干态下的其它性能，包括溶胀性和溶出性。所得数据见表5.2，用Origin 7.5 数据软件进行分析所得酪蛋白含量对复合膜机械性能的影响，示于图5.2。 从图5.2中可以看出:当酪蛋白含量增加时，膜的吸水率和溶出率均增大:融出率由17.73%增加到22.95%;吸出率由48.89%增加到75.12% 。 表5.2 壳聚糖/酪蛋白复合膜的吸水率 酪蛋白含量 CT-0 CT-10 CT-20 CT-30 CT-40 其它性能 融出率/% 17.73 18.81 19.24 19.52 22.95 吸出率/% 48.89 63.27 61.57 67..60 75.12 图5.2 酪蛋白含量对复合膜机械性能的影响 15 5.2 实验讨论 5.2.1 膜拉伸强度和断裂伸长率 壳聚糖是一种高结晶性的高分子材料，酪蛋白的加入，降低了膜的脆性，能够在受到外力作用时起到承载和传递应力的作用，同时使壳聚糖分子链不易发生相对滑移，复合膜的断裂伸长率增大，而壳聚糖与酪蛋白分子之间可能通过静电作用和氢键作用，使得壳聚糖分子形成增强网络结构，拉伸强度有所降低，但降低强度不大，从而改善了复合膜材料的机械性能。 5.2.2 膜溶胀、溶出性能 高分子复合材料的吸湿行为以物理吸附为主，水分子通过极性作用依附于材料表面，扩散进入材料内部，占据界面等处的缺陷位置并通过复合材料微观结构的变化移动位置，使得更多的水分子进入材料内部，吸湿量迅速增加。水分子的扩散导致高分子链结构的松弛，最终造成各组分产生不同比例的溶胀。 酪蛋白的加入改变了壳聚糖分子的排列结构，从而降低了复合膜的结晶度，使得水分子较易进入膜的内部。壳聚糖与酪蛋白分子之间的氢键作用和交织作用，使得膜随着酪蛋白含量的增加，膜中的自由体积增大，存水空间增加。 16 结论 本实验以壳聚糖和酪蛋白为材料，天然聚合物壳聚糖交联酪蛋白制得了壳聚糖/酪蛋白复合膜材料。检测复合膜中酪蛋白含量对膜的断裂强度、断裂伸长率、溶出率、吸出率等的影响。实验所得数据采用Origin 7.5 数据软件进行分析。通过测试复合膜材料的各项性能可以得出以下结论: 1(采用天然聚合物壳聚糖可以交联酪蛋白分子，从而制出复合膜; 2(酪蛋白的加入降低了膜的脆性，使得膜的断裂伸长率提高， 3(壳聚糖与酪蛋白分子之间可能存在氢键作用和交织作用，材料的拉伸强度降低不大; 4(随着壳聚糖含量的增加，改变了壳聚糖分子的排列结构，从而降低了复合膜的结晶度，使得水分子较易进入膜的内部。使得膜的吸水率和溶出率均呈现增加。 17 展望 本实验利用生物相容性良好的壳聚糖和酪蛋白交联制备复合膜，并对复合膜材料进行初步探究，完成了从牛奶中对酪蛋白的提取、以天然聚合物壳聚糖交联酪蛋白制得了较为理想的壳聚糖/酪蛋白复合膜、对复合膜进行了初步的探究，但在实验过程及后续研究中有很多方面值得探讨，在此对以下几个方面做进一步展望: 1. 从壳聚糖及酪蛋白的生物结构出发，探索壳聚糖与酪蛋白交联的化学机制，对所得复合膜的性能进行生物化学研究; 2. 对壳聚糖/酪蛋白复合膜采用浸提液实验及直接接触实验来评价体外细胞相容性，探究复合膜材料的生物性能; 3. 将壳聚糖/酪蛋白复合膜内植入动物体内，定期取样观察复合膜材料在动物体内的相容性和降解性，为新型生物材料的开发、应用提供基础。 18 参考文献 [1] 顾汉卿，徐国风(生物医学材料学[M].天津:科技翻译出版社，1993:1-8. 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[27]郑立，陈西广，刘万顺等.羧甲基壳聚糖膜对皮肤成纤维细胞相容性研究[J].生物化学与生物物理进展，2003。30(2):314-320. 20 致 谢 在XXX大学学习、生活的四年就要结束了，此刻，我衷心地感谢生命科学与化学学院的各位领导、老师在这四年中从学习和生活各方面给与的帮助。 本研究是在XXX老师的精心指导严格要求下完成的。感谢我的论文指导XXX老师，几个月以来，XXX的高尚品德，忘我的工作精神，严谨求实的工作态度和一丝不苟的工作作风都让我深感佩服。X老师在我学习上严格要求，在工作上言传身教，生活上关怀备至，令我终生难忘。 在完成学业的过程中，感谢在工作中结下深厚情谊的本实验室同学，他们是XX、XXX、XXX等同学，谢谢他们给了我很多美好的回忆。感谢实验室的各位老师，在实验上给我的帮助。感谢程时劲，XXX老师在试验操作上给与的指导。特别要感谢XXX同学，他的耐心指导和建议给了我很大的帮助和启发。 我还要感谢我的亲朋好友，特别是我的父母，感谢他们给予我的支持和鼓励。使他们的支持和关心使得我能够全身心的投入到紧张的研究学习中。 感谢所有关心和帮助过我的人～ 由衷感谢母校XXX学院提供的生物技术综合实验室，生物无菌操作室以及本次实验所有药品及仪器～ 21 序号 名称 规格型号 单位 数量 备注 一 制冷系统 1 压缩机组 4AV10 台 4 2 冷凝器 LN-70 台 1 3 贮氨器 ZA-1.5 台 1 4 桶泵组合 ZWB-1.5 台 1 5 氨液分离器 AF-65 台 1 6 集油器 JY-219 台 1 7 空气分离器 KF-32 台 1 8 紧急泄氨器 JX-108 台 1 9 冷风机 KLL-250 台 8 10 冷风机 KLD-150 台 4 11 冷风机 KLD-100 台 2 12 阀门 套 86 13 电磁阀 套 6 14 管道及支架 吨 18.6 3 15 管道及设备保温 m22 16 管道保温包扎 镀锌板 吨 1.6 17 附件 套 1 二 气调系统 1 中空纤维制氮机 CA-30B 台 1 2 二氧化碳洗涤器 GA-15 台 1 3 气动电磁阀 D100 台 14 4 电脑控制系统 CNJK-406 台 1 5 信号转换器 8线 台 1 6 果心温度探头 台 7 37 库气平衡袋 5 m 个 7 8 库气安全阀 液封式 个 7 9 小活塞空压机 0.05/7 台 1 10 PVC管 套 1 11 附件 套 1 三 水冷系统 1 冷却塔 DBNL-100 台 2 3 2 水泵 SBL80-160I 台 2 3 水泵 SBL50-160I 台 2 4 阀门 套 30 5 管道及支架 吨 2.8 6 附件 套 1 四 电仪控系统 1 电器控制柜 套 1 2 照明系统 套 1 3 电线电缆 套 1 4 桥架管线 套 1 22 5 附件 套 1 23