应用Polscope偏振光显微对人类MⅡ卵母细胞、三原核受精卵的纺锤

应用Polscope偏振光显微对人类MⅡ卵母细胞、三原核受精卵的纺锤 中南大学 硕士学位论文应用Polscope偏振光显微镜对人类M?卵母细胞、三 的纺锤体及卵裂阶段胚胎透明带结构的观察分 姓名:顾亦凡 申请学位级别:硕士 专业:医学遗传学 指导教师:卢光琇 20050501 摘要 在普通光学显微镜下，人类卵母细胞是半透明的，无法对其纺锤体以及透明带的结构进行观察和分析。而其他的成像法都需要破坏卵母细胞的结构。双折射性(,,,,,,,,,,,;,)是高度有序排列分子的一种光学特性。,,,,;,,,偏振光显微镜(,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,;,,,)可以检测到偏振光经过双折射性的样品时产生的光程差(,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,;,)，因此能够特异性的观察和分析具有双折射性结构的样品，它能观察活细胞的动态结构而不破坏细胞。 人类卵母细胞内具有双折光性的结构包括透明带和纺锤体。应用,,,,,,,,偏振光显微镜，能够对卵母细胞内纺锤体以及透明带结构进行非侵入性观察和分析，同时并不影响卵母细胞以及未来胚胎的发育潜能。纺锤体是进行减数分裂以及有丝分裂时重要的细胞器;透明带在人类植入前胚胎发育的不同阶段发挥着重要的作用。人类纺锤体以及透明带结构的活体观测及分析，对于理解早期人类胚胎发育生物学中的一些基本事件具有重要的意义，在未来辅助生殖领域内将有广泛的应用。 本研究分为三个部分，其主要实验方法及实验结果如下: 一第一部分应用偏振光显微镜对人类, ,，卵母细胞进行去核 在前期的工作中，本研究所的陆长富等通过注核一去核法以及精子提取物同时激活的，获得了人类体细胞核移植囊胚。 在此部分研究中，我们首先在前期工作的基础上，比较了不同激活时间对于人类体细胞核移植胚胎发育的影响。使用注核一去核法 (方法,)对,,枚人类,，，卵母细胞进行体细胞核移植，其中,,枚采用注核后,小时进行精子提取物激活的方案，,,被采用同时激活方案。结果显示，在方法,后激活组中，,,枚重构胚发生卵裂，其中,枚为优质胚胎，,枚发育到囊胚阶段;卵裂率、优质胚胎率以及囊胚形成率分别为,,(,,，,,(,,以及,,(,,。在方法,同时激活组中，,,枚重构胚发生卵裂，卵裂率为,,(,,，无优质胚胎以及囊胚形成。方法,后激活组的优质胚胎率高于同时激活组。结果提示，注核,小时后进行精子提取物激活的方案，有利于人类细胞核移植胚胎发育。 我们也探索了在,,,,;,,,偏振光显微镜观察下对人类,，，卵母细胞进行去核的方案(方法,)对于体细胞核移植的可行性。使用去核一注核法(方法,)对,,枚人类,，，卵母细胞进行体细胞核移植，并同时使用精子提取物激活。结果显示，使用,,,,;,,,能够在去除人类,，，卵母细胞中的纺锤体,染色体复合物。在方法,同时激活组中，,枚重构胚发生卵裂，其中,枚为优质胚胎，,枚发育到囊胚阶段，卵裂率、优质胚胎率以及囊胚形成率分别为,,(,,、,,(,,以及,,(,,。方法,同时激活组的优质胚胎率高于方法,同时激活组。以上结果提示，在,,,,;,,,偏振光显微镜观察下对人类,，，卵母细胞去核，是一种可行的人类体细胞核移植方案。 同时，我们在,,,,;,,,偏振光显微镜下对人类,，，卵母细胞去核的同时进行了拍摄，分析了第一极体与,，，纺锤体的位置关系。结果显示，第一极体是帮助寻找,，，卵母细胞纺锤体的良好标志物。 ，，第二部分应用偏振光显微镜观察分析去原核前后人类体外受精三原核受精卵第一次有丝分裂的纺锤体结构 在此部分研究中，我们在去除多余雄原核前后，对人类，,,来源的三原核受精卵(,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,，,,,)第一次卵裂 的方式以及体外发育的情况进行了观察，并使用,,,,;,,,偏振光显微镜以及免疫荧光法对其第一次有丝分裂时纺锤体的形态结构进行了分析，同时评估了这两种方法的吻合度。结果显示，人类，,,来源的三原核受精卵在去原核前后，均存在,:,以及,:,两种卵裂方式，两组间比例无显著性差异。去原核前后，第,天胚胎的优质胚胎率无显著性差异，而第,天去原核后,,,受精卵的囊胚形成率(,,(,,)高于未去原核组(,(,,)。,,,,;,,,偏振光显微镜观察结果显示，人类，,,来源的三原核受精卵在去原核前后，均存在纺锤体结构的异常，去原核前后纺锤体结构异常率分别为,,(,,和,,(,,，两组间比例无差异。使用免疫荧光法也获得了类似的结果。对于,,个样本先后使用,,,,;,,,偏振光显微镜以及免疫荧光法分析结果显示，两种方法的检测结果无差异，具有中度吻合性。以上结果提示，人类，?来源的,,,受精卵在第一次有丝分裂时，存在各种类型的纺锤体结构以及数目异常。去除多余的原核后，并未逆转其有丝分裂纺锤体的异常程度。使用,,,,;,,,偏振光显微镜能够对人类受精卵第一次有丝分裂的纺锤体结构进行较为准确的观察和分析。 ，，，第三部分应用偏振光显微镜定量检测人类新鲜及冷冻一解冻胚胎透明带多层结构对偏振光的阻 在本部分的研究中，根据体外培养第,天的形态学指标将人类卵裂阶段新鲜胚滞性 胎分为优质新鲜胚胎以及质差新鲜胚胎;并根据解冻后胚胎完整卵裂球的比例，将冷冻一解冻胚胎分为解冻后复苏胚胎以及未复苏胚胎。使用,,,,;,,,偏振光显微镜对各组胚胎的三层透明带结构进行了非侵入性的定量分析。通过均匀分布的,个点对透明带各层的阻滞性(,,,,,,,,;,)进行测量(,,,,,,, ,,,,,;,,,(,)，并计算每个胚胎透明带各层的平均阻滞性。我们也评估,,,,;,,,偏振光显微镜成像及分析系统的可重复性以及可靠性。结果显示，大约只有,,,的人类卵裂阶段胚胎具有典型的三层结构透明带;各组间比例无差异。在优质新鲜胚胎(,,,,)、解冻后复苏胚胎(,,,,)、质差新鲜胚胎(,,,,)以及解冻后未复苏胚胎(,,,,)中，透明带三层结构的阻滞性无显著性差异。,,,,;,,,重复拍摄和测量的结果无显著性差异。结果提示，人类卵裂阶段胚胎的透明带结构存在显著的变异性;研究结果并不支持冷冻一解冻的过程会导致透明带结构改变的假设;另外，恕銎险壁墅堕盥形态掌厘量与透明蒜舶结构无显羞鞋差歪一使用,,,,;,,,偏振光显微镜能够对人类透明带结构进行精确的定量分析。关键词偏振光显微镜，核移植，卵母细胞，受精卵，胚胎，纺锤体，透明带 ,,,,,,,, ,,,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,;,,,，,,,,, ,,;,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,, ,, ,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,;,,,(,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,;, ,, ,, ,,,,;,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,(,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,;,,, ,,,,,,,;, ,,, ,,,,;,, ,,,, ,,,,,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,, ,,,,;,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,;,,,;,,,,，,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,; 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;,,, ,,;,,,, ,,,,,,,,,，,,,,)绵羊“,,,,,”…。,,,,,的诞生第一次证明了，高度分化的体细胞核能够在去核的卵母细胞中重编程 (,,,,,,,,,,,,)，并获得发育的全能性。体细胞核移植技术已经在绵羊“,(,,,,)、小鼠。,(,,,,)、牛”,(,,,,)、山羊“,(,,,,)、猪吲(,,,,)、猫”,(,,,,)、大鼠”,(,,,,)、骡…(,,,,)以及马,,(,,,,)等,个物种中获得了成功。,,,,年，,,,,,,,等“”建立了人胚胎干细胞(,,,,,,,,;,,,, ;,,,,，,,,,)系，证明了人胚胎干细胞能够在体外保持未分化状态、长期增殖，并具有发育的多能性，能够分化为全部三个胚层的组织及细胞。,,,,年，,,,,,…,等提出了“治疗性克隆”(,,,,,,,,; ;,,,,,,,)的设想——将病人的体细胞核移植入去核的卵母细胞中获得重构胚，从发育至囊胚阶段的重构胚中分离胚胎干细胞，经过诱导分化后形成病人所需的功能细胞，再重新输回病人体内以进行细胞替代治疗;由此所获得的细胞与病人自身具有相同的遗传背景，因此能够避免由于个体差异而导致的免疫排斥反应。,,,,年，,,,,,,等“”使用小鼠颗粒细胞建立了核移植胚胎干细胞系(,,;,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,; ,,,, ;,,,,，,,,,,,)，此后相继建立了多个小鼠的,,,,细胞系“””,，并证明了小鼠的,,,,细胞同样具有多能性。,,,,年，,,,,等“”以人成纤维细胞为供核以及兔,，，卵母细胞为受体构建了异种核移植囊胚，并从中分离了具有,,,,,细胞。,,等””也报道了一种构建人类体细胞克隆胚的新方法。,,,,年，,,,,,等“”以自体颗粒细胞为供核建立了人类核移植胚胎干细胞系，并证明了人,,,,细胞同样也具有多能性。,,,,年，，,,,,,等…使用来自于患者的自体皮肤细胞为供核，建立了,,个与患者主要组织相容性复合物相(,,,)吻合的人类核移植胚胎干细胞系。 体细胞核移植技术是治疗性克隆的关键。影响核移植效率的因素很多，包括:动物物种，供核类型，卵母细胞质量，核移植技术，体外培养技术等等。其中，对卵母细胞去核是影响核移植效率的重要因素,“。传统去核技术是使用,,,荧光染料对细胞核染色后，在荧光显微镜下进行去核。但紫外激发光对于,,,存在潜在的损伤作用，可能影响重构胚的发育潜能。,,等“”报道了采用注核一去核法，在原核阶段对卵母细胞进行去核，获得了人类体细胞核移植囊胚。,,,,年，,,,”“硕,:学位沦义 第一部分应用偏振光』，,～微镜对人类,，，卵母细胞进行去核等使用,,,,;,,,偏振光显微镜对小鼠卵母细胞的纺锤体进行非侵入性的去核，结果显示去核效率为,,,,，并且重构胚的发育未受影响。 在本研究中，在,,等“”建立的注核一去核法的基础上，我们比较了不同激活时间对人类体细胞核移植胚胎发育的影响;并初步分析了使用,,〕,;,,,偏振光显微镜进行去核一注核法的效率以及对人类体细胞核移植胚胎发育的影响，探索提高人类体细胞移植效率的方法。，为进一步建立治疗性克隆技术奠定基础。,(材料与方法,(,材料,(,(,研究材料 卯母细胞:本研究中使用的卵母细胞来自于中信湘雅生殖与遗传专科医院接受人工授精(,，)卵泡穿刺的患者，以及常规体外受精,胚胎移植(，,,—,,)患者的自愿捐献。 供核细胞:卵母细胞周围的卵丘细胞。 精子提取物:来自于接受常规，,,授精后的剩余精子。 研究获得了中信湘雅生殖与遗传专科医院医学伦理委员会的批准，向患者进行了知情同意，并签署了知情同意书。,(,(,培养基及相关试剂 ,,,,,,: ,,,,,,,,,公司(瑞典) ,,(,“ : ,,,,,,, ,,公司(瑞典) ,,(,“ : ,,,,, ,,,,公司(瑞典) ,,,,,,: ,,,,,〕,,,公司(瑞典) ,,, : ,,,,,〕,,,公司(瑞典) ,,,，,“一,,,: ,,,,,,,,,公 司(瑞典) ,,,粉剂: .