斑马鱼体细胞核移植_头肾细胞和尾鳍细胞核移入成熟具核卵子发育能力的初步研究_cropped

斑马鱼体细胞核移植_头肾细胞和尾鳍细胞核移入成熟具核卵子发育能力的初步研究_cropped 斑马鱼体细胞核移植—头肾细胞和尾鳍细胞核 Ξ 移入成熟具核卵子发育能力的初步研究 ΞΞ 11 11, 2荔李张士璀 李红岩郭华荣 ( )1 青岛海洋大学海洋生命学院, 青岛, 266003 ( )2 深圳大学科技研究院生物工程系, 深圳, 518060 摘 要 将经直接消化的斑马鱼头肾细胞或经短暂培养的尾鳍细胞核移植到同种成熟具核卵子 中, 移核卵可发育到原肠晚期; 将移核卵发育成的囊胚细胞核作供体进行第 2 次核移植, 受体卵可 发育到尾芽期或肌肉感应期。 流式细胞仪测定 含量表明, 受体卵发育形成的囊胚细胞 DN A DN A 含量与正常囊胚细胞 含量相同, 由此可知, 移核卵中的雌原核没有参与移核胚胎的发育。 关DN A () 键词 斑马鱼 ; 头肾细胞; 尾鳍细胞; 细胞核移植B rachy d an io re r io () 中图法分类号 Q 813; Q 959. 4 文章编号 100121862 2002012073206 1 自从著名生物学家童第周教授及其合作者于 1963 年率先在鱼类中进行细胞核移植并 获成功后, 我国学者在淡水硬骨鱼类上进行了种间、属间、亚科间、目间甚至纲间的细胞核移植 2 工作, 获得了移核成鱼、幼鱼和不同发育时期的胚胎。 在过去近 40 年里, 鱼类的细胞核移植 3 4 研究工作主要集中在我国, 国外只见过 等和 等2 篇报道。 因此可以说, 我 Ga sa ryan N iw a 国在鱼类细胞核移植领域处于国际领先水平。 但是上述核移植工作主要是通过移植胚胎期未 分化的细胞作为核供体完成的。 5吴尚等 首次将鲤鱼红细胞核移植到去核的金鱼卵中获得了 1 尾成体细胞核移植成 6 鱼; 陈宏溪等将鲫鱼囊胚继代培养细胞、鲫鱼肾脏或金鱼肾脏的短期培养细胞核移植到鲫鱼 7 的去核卵中, 通过连续的细胞核移植获得了不同发育时期的胚胎和 2 尾成鱼; 林礼堂等将鲫 鱼、鲮鱼和尼罗罗非鱼的头肾细胞核经直接分散后移植到鲤鱼的去核卵中, 通过连续的细胞核 移植获得了不同发育时期的胚胎。 然而, 上述的胞质受体均为去核卵, 用去核卵作为胞质受体 3 的弊端在于挑核时容易损伤胞质从而影响移核卵子的进一步正常发育。 等、余来 Ga sa ryan 8 9 宁等和李荔等通过分别对泥鳅、鲤科鱼类间不同组合和斑马鱼未去核卵的细胞核移植实 验发现受体卵中的雌原核不参与胚胎的进一步发育, 从而证明用鱼类卵子进行核移植时, 可省 略挑核操作。 本文将分离的斑马鱼头肾细胞和培养的尾鳍细胞核直接移植到斑马鱼未去核成 熟卵中, 获得了发育至尾芽期或肌肉感应期的胚胎。 Ξ ( ) 国家“863”项目 819204206资助 收稿日期: 2001205220; 修订日期: 2001211221 李 荔, 女, 1968 年 10 月出生, 博士生, 讲师。 ΞΞ 联系人 1 材料和 1. 1 材料 1. 1. 1 供体细胞的准备 以斑马鱼头肾细胞作核供体: 成体斑马鱼用 70% 酒精消毒后, 活体 取出头肾, 臵于含 0. 25% 胰酶和 0. 02% 的 培养液中分散成单细胞后, 于ED TA H o lte rf re te r 800 ƒ离心 5 , 洗细胞 2 次, 收集细胞。 rm in m in 斑马鱼尾鳍组织原代培养: 将成体斑马 鱼 放 入 含 1000ƒ青 霉 素 和 1000 ƒ IU mL Λg 链霉素的凉开水中消毒 24 ; 用前将鱼mL h 体 在 70% 酒 精 中 迅 速 过 一 遍 后 取 尾 鳍 组 织, 漂洗 2 次, 移入含 10% 小牛血清的PB S 3 ( ) M EM 培养液中剪碎 1 mm 大小; 将组织 块 均 匀 接 种 于 小 培 养 皿 中, 4 后 加 入 含h 20% 小牛血清的培养液, 臵 22?培养 M EM 箱培养。 培养的尾鳍组织, 在第 3 天就有细 胞 从 组 织 块 周 围 迁 出, 刚 迁 出 的 细 胞 为 梭 ()图 1 培养 8 天的斑马鱼尾鳍细胞 B a r= 50 Λm 形, 能很好地贴壁生长, 第 4 天开始 有 大 量 . 1 F igT h e p r im a ry cu ltu red cauda l f in 的细胞迁出并贴壁生长, 细胞为上 皮 样, 从 ()= 50 .ce lls o f zeb raf ish o n th e e igh th day B a rΛm () 第 5 天起就可用来作供体 图 1。取 5, 14 d 的原代培养尾鳍细胞用作供体。 1. 1. 2 受 体 卵 的 准 备在 实 验 的 前 一 天 傍 晚, 将 分 缸 饲 养 的 雌 雄 斑 马 鱼 放 入 同 一 缸 中 () ???= 2?1, 次日晨, 看到有雌雄追逐后, 将雌鱼捞出, 挤卵子于凉开水中, 待 12 左右 m in 卵膜举起后, 用镊子剥去卵膜, 不去核作为受体。 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞核移植用毛细吸管吸取单个供体细胞注入受体卵子胚盘中央, 这一次的核移 植称为第 1 次核移植, 将完成移核的卵子放于 28. 5 ?的恒温箱中培养。 当第 1 次移核卵发育 9 到囊胚时, 选取发育良好的中期囊胚用作第 2 次移核的供体, 此次移核按照李荔等的方法进 行。 含量的测定取正常发育的囊胚细胞和第 2 次移核卵发育成的囊胚细胞进行1. 2. 2 DN A DN A 含量的测定。将剥膜后的囊胚用玻璃针切下胚盘, 臵于 H o ltf re te r 分离液中使细胞分散。 将细胞在 1000 离心 8 , 回收细胞, 用 洗细胞 2 次。加入含 50 碘化丙锭ƒƒrm in m in PB S ΛgmL 的 缓冲液, 4?避光染色 30 。染色后的样品在 流式细胞仪上测量,PB S m inFA C Scan V an tage 测试结果以 直方图表示。DN A 2 结果 2. 1 头肾细胞核移植卵子的发育将酶解分离的斑马鱼头肾细胞核移植到同种成熟具核卵 子后, 第 1 次移核卵子开始首次卵裂的时间明显滞后, 约比正常受精卵慢 10, 20 左右, 进m in 入早期囊胚和中期原肠胚的时间约分别慢 25, 45 和 1, 1. 5 左右。从表 1 可见, 酶解分m in h 离的头肾细胞的第 1 次核移植卵, 可进行卵裂发育成不完整囊胚和完整囊胚。在总共 570 个移 核卵中, 有 8. 60% 和 11. 93% 的移核卵子发育到不完整囊胚和完整囊胚。完整囊胚可进一步发 育为早期原肠胚、中期原肠胚直至晚期原肠胚, 晚期原肠胚无法完成下包形成尾芽胚。 第 2 次 移核卵子的发育速度虽然比正常受精卵子的发育稍慢, 但两者的发育速度却没有非常明显的 差别。 从表 1 可见, 第 2 次移核卵子发育到囊胚和原肠胚的比率比第 1 次移核卵有明显提高,在总共 91 个移核卵中, 分别有 79. 12% 和 13. 19% 的移核卵发育到囊胚期和原肠晚期, 晚期原 ()肠胚可进一步发育到尾芽期, 但均由于存在不同程度的畸形而不能进一步发育 图 2。A 表 1 头肾细胞核移植卵子的发育 1 T ab le T h e su rv iva l o f th e nuc lea r t ran sp lan t egg s t ran sp lan ted w ith rene l ce lls 时期 移核卵不完整囊胚 完整囊胚 原肠早期 原肠中期 原肠晚期 尾芽期 S tage s P a r t ia l B la stu la E a r ly M idd le L a te E gg s T a ilbud 移核 b la stu la ga st ru la ga st ru la ga st ru la N uc lea r t ran sp lan ta io n ()总数 个 第 1 次移植 570 49 68 17 8 1 0 T o ta l num be r T h e f ir st () 百分比 % nuc lea r 100 8. 60 11. 93 2. 98 1. 40 0. 18 0 t ran sp lan ta t io n P e rcen tage ()总数 个 第 2 次移植 91 6 66 22 16 12 7 T o ta l num be r T h e seco nd () 百分比 % nuc lea r P e rcen tage 100 6. 60 72. 52 24. 18 17. 58 13. 19 7. 69 t ran sp lan ta t io n 2. 2 原代培养尾鳍细胞核移植卵子的发育将原代培养的斑马鱼尾鳍细胞核移植到同种成 熟具核卵子后, 第 1 次移核卵子开始首次卵裂的时间滞后, 约比正常受精卵慢 10, 15 左m in 右, 进入早期囊胚和中期原肠胚的时间约分别慢 20, 30 和 1 左右。从表 2 可见, 经原代 m in h 培养的尾鳍细胞的第 1 次核移植卵可进行卵裂发育成不完整囊胚和完整囊胚。 在总共 157 个 移核卵中, 有 7. 64% 和 12. 10% 的移核卵子发育到不完整囊胚和完整囊胚。完整囊胚可进一步 发育为早期原肠胚、中期原肠胚直至晚期原肠胚, 晚期原肠胚无法完成下包形成尾芽胚。 第 2 次移核卵子的发育速度虽然比正常受精卵子的发育稍慢, 但两者的发育速度却没有非常明显 的差别。 从表 2 可见, 第 2 次移核卵子发育到囊胚和原肠胚的比率比第 1 次移核卵有明显提 高, 在总共 103 个移核卵中, 分别有 75. 73% 和 25. 24% 的移核卵发育到囊胚期和原肠晚期。晚 ( ) 期原肠胚可进一步发育到尾芽期直至肌肉感应期 肌动期胚胎, 但由于存在不同程度的畸形 () 而不能进一步发育 图 2。B 2. 3 尾鳍组织原代培养 经过培养的尾鳍组织, 在第 3 天就有细胞从组织块周围迁出, 刚迁 出的细胞为梭形, 能很好地贴壁生长, 第 4 天开始有大量的细胞迁出并贴壁生长, 细胞为上皮 () 样, 从第 5 天起就可用来作供体 图 2。 含 量 的 测 定2. 图 3和 图 3分 别 表 示 正 常 囊 胚 和 移 核 卵 发 育 成 的 囊 胚 细 胞4 DN A A B 相对含量。从图中可以看出, 各直方图均有两个峰, 峰 1 和峰 3 代表 期细胞, 峰 2 和峰1 DN A G 4 代表 ƒ期细胞, 两个峰之间是 期细胞。 两个直方图中的荧光强度基本一致, 说明两图2G M S 中细胞 含量相同。 因此, 可以推测, 移核胚胎中的雌原核没有参与胚胎发育。DN A 图 2 头肾和尾鳍细胞第 2 次移植卵发育成的胚胎 () 头肾细胞核移植卵发育成的尾芽胚 = 400 原代培养尾鳍细胞核移植卵 . ; . AB a rΛm B ()发育成的肌肉感应期胚胎 = 400 B a rΛm . 2 F igT h e em b ryo s deve lop ed f rom th e nuc lea r t ran sp lan t egg s p ro v ide w ith nuc le i o f rene l ce ll and p r im a ry cu ltu red cauda l f in ce ll in th e seco nd t ran sp lan t A. T h e ta il bud em b ryo deve lop ed f rom th e t ran sp lan t egg p ro v ided w ith a rena l ce ll nuc leu s ()= 400 . . in th e seco nd t ran sp lan t B a rΛm BT h e m u scu la r co n t rac t io n em b ryo deve lop ed f rom t ran sp lan t ()= 400 egg p ro v ided w ith a p r im a ry cu ltu red cauda l f in ce ll nuc leu s in th e seco nd t ran sp lan t B a rΛm 表 2 培养尾鳍细胞核移植卵子的发育 2 T ab le T h e su rv iva l o f th e nuc lea r t ran sp lan t egg s t ran sp lan ted w ith p r im a ry cu ltu red ce lls 不完整 时期 移核卵尾芽期 肌动期完整囊胚 原肠早期 原肠中期 原肠晚期 囊胚 S tage s E gg s T a ilbud M u scu la r B la stu la E a r ly M idd le L a te P a r t ia l 移核 co n t rac t io n ga st ru la ga st ru la ga st ru la b la stu la N uc lea r t ran sp lan ta io n ()总数 个 第 1 次移植 157 12 19 5 4 2 0 0 T o ta l num be r T h e f ir st () 百分比 % nuc lea r 100 7. 64 12. 10 3. 18 2. 55 1. 27 0 0 t ran sp lan t io n P e rcen tage ()总数 个 第 2 次移植 103 8 70 26 23 17 9 2 T o ta l num be r T h e seco nd () 百分比 % nuc lea r 100 7. 77 67. 96 25. 24 22. 33 16. 50 8. 74 1. 94 t ran sp lan t io n P e rcen tage 3 讨论 5 6吴尚和陈宏溪等 最早将成体细胞核移植到去核鱼卵中并发育到成体。 本实验将斑 马鱼经直接消化的头肾细胞和经短暂培养的尾鳍细胞核直接移植到本种成熟具核卵子中, 第 1 次移核卵可发育到原肠晚期, 第 2 次移核卵可分别发育到尾芽期和肌肉感应期。这是斑马鱼 体细胞核移植的首次报道。 图 3 囊胚细胞 DN A 相对含量 . 3 F igT h e DN A co n ten t s o f b la stu la ce lls . ; . AT h e DN A co n ten t s o f th e no rm a l b la stu la ce llsBT h e DN A co n ten t s o f th e nuc lea r t ran sp lan t .b la stu la ce lls 通过移核囊胚细胞与正常囊胚细胞的 含量的测定发现, 两者的 含量相同, 说DN A DN A 3 89 明移核卵中雌原核没有与供体核融合。 这再次证明 等、余来宁等 的 和李荔等Ga sa ryan 实验结果: 在移核卵子的发育过程中, 原有的卵原核发生退化。 与以往的鱼类成体细胞核移植方法相比, 本实验省去了挑核及分散细胞这些容易损伤受 体及供体的操作过程, 使核移植技术变得既简单、省时同时又保证了受体卵子更好地发育。参考文献 1 童第周, 吴尚 , 叶毓芬, 等. 鱼类细胞核的移植. 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