环孢素A防治同种异体带瓣大血管移植后钙化的研究

环孢素A防治同种异体带瓣大血管移植后钙化的研究 环孢素A防治同种异体带瓣大血管移植后 钙化的研究 第43卷第8期 2005年8月 LLI东大学(医学版) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) 文章编号:1671—7554(2005)08—0701—05 Vo1.43No.8 Aug.2005 环孢素A防治同种异体带瓣大血管移植后 钙化的研究 常青,李守先,巩性军,张希全 (山东大学齐鲁医院心血管外科.山东济南250012) 【摘要】目的:探讨同种瓣移植后早期环孢素A(CsA)~钙化防治作用.方法:成年SD大鼠为供体, Wistar大鼠为受体,行同种异体带瓣主动脉腹主动脉的异位移植,分为CsA组,对照组和同基因组3组. CsA组移植后给予CsA15mg/fkg?d),共2周;对照组不做任何处理;同基因组行同一种系的近交系大鼠 同种异体瓣膜移植.各组随机分为5组,每组8只,分别于术后2,4,8,12,16周采用流式细胞仪测定大 鼠CD25,CD71的表达,取出移植物,原子火焰吸收法测定钙含量,对移植物行电镜观察.结果:?对照组 移植后CD25和CD71表达的高峰时段主要在移植后早期,此后逐渐回落,12周后维持在低水平CsA组 在移植后2,4周CD25和CD71的表达明显低于对照组(P<O.O1).但8周后的表达水平与对照组无差异 (P>O.05);(对照组的钙含量从4周开始随时间的推移逐渐升高,12周达到高峰. 此后进入平台期CsA 组的钙含量在移植后4,8,12,16周4个不同时点显着低于对照组(P<O.O1);?移 植后早期,csA组的内 皮细胞脱落和平滑肌细胞的坏死情况较对照组轻结论:同种瓣移植后早期使用环 孢素A具有抗钙化作 用. 【关键词】移植,同种;环孢菌素;大鼠,Sprague—Dawley;大鼠,Wistar;钙化 【中图分类号】R542.5『文献标识码1A CyclosporinAtherapyinpreventingcalcificationafteraorticvalve homografltransplantion CHANGQing,LIShou—xian,GONGXing-jun,ZHANGXi—quan (DepartmentofCardiovascularSurgery,QiluHospitalofShangdongUniversity,Jinan250012, Shandong,China) 【ABSTRACT】 Objective:Toevaluatetheimmun0suppressiveeffectofCyclosporinA(CsA)onaortic valveallograftdurabilityanditspreventiononcalcification.Methods:Aorticvalvehomograftwashetero— topicallyallograftedontoabdominalaortafromSprague— Dawley(SD)ratstoWistarrats.Theratsweredivided into3groups,testgrouptreatedwithCsA(0.15mg/kg),isogeneicgroupandcontrolgroup.Theratswere sacrificedinbatchesat2,4,8,12and16weekspostoperatively.Bloodsampleswereobtainedforaccessing theexpressionofCD25,CD71,andAVHwereobtainedforaccessingthecontentofcalcium.Atthesame f基金项/:tI11J尔省科技厅基金资助课题(NO.022l30108) 【作者谚愈j常青(1971一),男,博上研究生,主治医师,主要从事同种瓣移植的基础 和临床研究.现在青岛大学医学院附属医院心血管外科. 【通讯作者1李守先.教授.博{生导师 702山东大学(医学版)43卷8期 time.the(:hanges()fen(totheliocvteandthesmoothmusclecellswereobservedundertransmissionelectron microscope.Results:TheexpressionsofCD25andCD71incontrolgroupweremuchhigherin2-4weeks afteroperationthanthoseinothertimes.TheexpressionsofCD25andCD71intestgroupandisogeneic groupweremuchlowerthanthoseofcontrolgroupatearlystageoftransplantation.Thecontentofcalciumin controlgroupincreasedat4weeksafteroperationandreachedthehighestlevelat12weeksafteroperation. ThecontentofcaMuminisogenenicgrouphadnodifferencewiththatofpre-transplant.Thecontentofcal- ciumintestgroupwaslowm'thanthatofcontrolgroupat4-16weeksafteroperation.Conclusion:CsAtreat- mentcanpreventcalcificationafteraorticvalvehomografttransplant. 【KEYWORDSjTransplantation,homologous;Cyclosporine;Rats,Sprague-Dawley;Rats,Wistar; a1Cification 与异种材料的瓣膜比较.同种瓣具有优良的 抗血栓,抗感染性能及良好的ff『L流动力学效果.且 移植技术口趋成熟.使用方便.广泛应用于临床治 疗先天性心脏病及瓣膜病,f咀同种瓣移植后远期 的钙化成为影响其使用的主要问题….解决同种瓣 移植后的钙化是心m管外科多年来研究的热点和 难点. 环孢素(CycIOSporineA.CsA1是从霉菌的代 谢产物中提取的一种由11个氨基酸组成的环化 多肽1976年发现它有免疫抑制作用后开始应用 于临床降低了移植患者的死率,目前CsA仍 是移植免疫抑制治疗的一?线药物CsA的靶细胞 主要是T细胞.主要作用于T细胞活化的早期. 通过抑制IL.2等的产牛而选择性地抑制T细胞 的功能【2】本研究采用大鼠同种异体带瓣主动脉腹 主动脉异位移植模型.对其移植后不同时点的免 疫指标和钙含量进行监测.旨在探讨同种瓣移植 后早期使用CsA的抗钙化作月_J 1材料与方法 1.1动物来源与分组供体选用健康近交系SD 大鼠,体重200,260g,购f{北京维通利华实验动 物技术有限公司:受体选用健康近交系Wist大 鼠,体重200,260g.购I』J东大学实验动物中心 CsA购自华北制药彳丁限公司mE号:041001) 受体大鼠分3组.符组移植手术相同.每组40 只.CsA组:手术后次IJ起腹腔注射CsA15m绯g-(11, 共2周;对照组:不予其他处理;同慕因组:行同一 种系的近交系大鼠同种异体瓣膜移植同时.将3 组的大鼠随机再分为5组.每组8只.分别在移植 后的2,4,8,12,16周处死,测定移植物的钙含量; 并检测CD25和CD71的表达 1.2同种异体带瓣主动脉的移植供体大鼠麻 醉后仰卧固定.消毒胸部.前正中切口进胸.暴露 心脏.游离升主动脉.8-0缝线结扎左右冠状动脉 开口.自无名动脉开口近端离断升主动脉.取下心 脏.保留2个主动脉瓣叶及相应宽度主动脉壁和 瓣下心肌.深低温保存60d后移植 受体大鼠麻醉后仰卧固定.消毒腹部.正中切 口进腹.分离后腹膜.游离左肾静脉下方腹主动脉 至髂动脉分又处动脉夹阻断后.纵行切开腹主动 脉前壁.取预先准备之供体.瓣膜部分在腹主动脉 近心端.以8-0无创伤缝线三定点连续缝合补片 式移植于受体腹主动脉前壁开放后触摸远端动 脉搏动良好.腹腔内留置少量庆大霉素.缝合切 口以术后苏醒且次日无下肢瘫痪作为手术成功 标准. 1.3同种异体带瓣主动脉的透射电镜观察取 样后3%磷酸戊二醛固定2h:10%锇酸固定1h: 0.1mmol/L磷酸缓冲液漂洗后酒精脱水在丙酮 中浸泡30min丙酮包埋剂混合液(1:2)浸透17 h将样品移到有包埋剂的烤箱中温聚合后超薄切 片机切片醋酸双氧铀染色30rain后彻底水洗3 次柠檬酸铅染色30rain后彻底水洗3次电子 显微镜观察 1.4CD25和CD71的测定移植后2,4,8,12, 16周自下腔静脉采血,肝素抗凝后.流式细胞仪 检测CD25和CD71的表达CD25.FITC和CD71. FITC单克隆抗体购自晶美生物工程有限公司溶 血素为BECTON.DICKINSON公司产 取肝素抗凝血100txl加相应的荧光标记单 常].r.等.他求AI埘治同种异怍带稚尤『l?管移植后化的研究7? 克降抗体20,窀m啦圯H3{1llli.-几挤川 索2n1l讹,】0miI1l,川fH2?()drain离心. 洗涤2陕.拜1l,加几0.5mll嘶彩粜I}醛怂汗 细胞.J'f』【榆删』fill胞ffBE(TI】—DICKIN— (),公)激毙光离子澈圯.波长488 ml】.榆il010000十淋L2圳融,IIffi敞gJ和 侧li'il舶敝蚶的f;j[!冬J.川l1(.'m软件进行分 折 1.5移植物钙最的删采』I1晾_F火焰l收 齿'I移植248,12,l6I,q址九眦.取f1_移植 物.无离F水消洗.滤纸洗l水衢玻璃【n【耵I 加样头川盐fn硝浸?24ll-尢离子水清洗后 烤十将,烧杯f爆前r蝉l温『gt3}1) 至重.IU天平币4:重.冉将待驯样般八十燥的 小烧杯.十僚划'tl匝.量捕样If?.重将已 称再的纵5.5-?_能柑,『f1,打I12?l消化澈fH,O: HCIO:I1.盖J'巾…?.电性扳l1Jf1热消化取r 丧I甑皿.加热燕『:碳化为I0.5ll1I2l『】I/I HNO济澉.溶残沂.加0I2I[Il5c)氧化镧溶 液川支离r水定锌II't仃洲定.删的比晰. 标艘液埘化求…If川试制作卒对照.以 GBS(62067:物l(蚂r1I1I,顷拧制i}J心) 什:质鳍制 1.6统汁学处录川SI-lj软忭世所得数 据均以=,J.f谶J钏l此水徽扭:世fr平方根反 止弦变换).愉验采川忻…吐汁资料(VjTy菱 分析的椅骑.绀i'li】均敬J比较J;Jr{盘验电镜 观察按心凡内l,抛,有部j,I.q细胞 争歧胞盖讣,3个耋挺.j』上衍等级资岫 秩干?检验 2结果 2.I同种计体带瓣f动肺的l乜镜观察l 2刘照移植!J-IiJ化柯2例宵部分 细胞贱.{,余6例尤l戍细胞.J1现内掉』 膜断裂..rfi千JlJ【胞尚完:{:s,8倒均柯部分 内皮圳胞仔.EL搏』川壤.甜H儿细胞完 整?扦置拌f】{1^并件cP<0.【】I】 利麒21【4J制时内慢胞脱浩:滑肌细 胞坏北.特彳丁^构消失.V'J磺帐,纠胞结铀谳 缩不清.纳胞脱消灭^在移十l4同时内腹 细胞脱落.也…删平滑JjJ【细胞上f,化.但群度较 对照"--'11轻 5-]l对组2IA.x4[】??.l4吼×IO(1(时的适时l邑 谴挝辜 Fig1ria1]Hmlhleleeln)rlmitrll~lclI…imagenll:otltml r.ii1_) A2khJnnnll1IiIliiIx4cW)I11:l{4wbafter Ira1'SlIlj}_II}IIif'lII×10)n1 M2(:2j?.x2000)t.i4latlB,×l5c0?J的透射电 能脱嚓结 Fig2Tnlii…l一l『l一i11_『1l【-opi{imageCsAgroup A2t-k,after_】HrIl}Imflati<m{x2f】[H:B4w?ksafler I13]1isp1.liIlIl(?ll×【5L)【】cl? 同蜒Iq211f,移植后符个圳问的形态完整.1q 发细胞平?平滑IIJL21~胆完整.光拟协 21CI)25干?CI}71的测定结粜l也表I对照组 移梢2,481'19(:D25和CI)71旧表达均较同基 卦ll奄(P<O.(】11.12羊llI6/a]n(.I}25_秆lCI)7I的 丧【J土均较嗣蛙I坦高【O.05}.H2,4,8,I2周4 不I亓JIt,J点比较仃毒蕞开f,().01).12与l6周 的挺达无l啊差异t154)05).挺逃的高峰刚段 土受,f移帕剖(2周1.C1)25的表达存2周 时最高.【1)7lfl勺丧丛0-4同Hlf撮高.此后的嵌达水 一逐渐同落12恻l同搭慨低水甲.与同基网组 /t:较有差【P<O051.fJ5有低水平的饱疫排斥『同基 II:l{Jl齐1,fl,J段(.I)25_1CD7I的太退均无差异 (,j>I)05)A绀存移悄后2,4例t:D25垌lCI)71 的达lWftgJ.对照组(P<001).1fu移植后8,l2 自I16时的表丛水与埘j{(i自l无差异(,J>005). 24移植物量呐临删&22周时3个 纽的钙禽右t阿曲比较尤差异(P>O.05),刘照组4, 812,l6周4个In'JII,J点m钙禽较基组艟 704山东大学(医学版)43卷8期 着升高(P<0.O1),且2,4,8,12周4个不同时点的 钙含量比较有显着差异(P<0.01),但12与l6周 的钙含量无明显差异(P>0.05).同基因组在各个 时间比较无显着差异0.05). 表l移植术后不同时问CD25和CD71的表达(%) 组别—一4商CD25CD71 8周12周16周2周4周8周12周16周 对照组 13.13+2.0410.89+1.257.25+1.135.55+1.225.55+1.1911.64+1.3115.25+1.508.11?1.226.63~1.126.56~1.22 CsA组8.09?1.877.83~1.217.20~1.195.50~1.12A5.52~1.09A7.51?1.379.72~1.3r8.06~1.196.50~1.2O6.65~1.18 同基因组4.49~1.454.12~1.153.98~1.133.91?o.853.93~1.195.35-+1.255.02~1.095.06~1.315.03~1.145.04~1.16 尸l<O.01.P>0.05VS对照组 表2移植术后不同时间移植物的钙含量(m/p.g?g) 组别 对照组 2周4周8周12周16周 865.784~l79.2l63005.804~103.O8l3790.652~242.4704573.684~202.3954597.345+18 5.440 CsA组862.504~73.4392237.961? 184.6533044.221-+204.5013686.249~203.3493708.615~179.157 同基因组 8l1.196-+61.109A812.976~113.737825.239~113.280858.987~134.44r866.499~159.6 44 P<0.01.P>0.05V8对照组 3讨论 CD25抗原是相对分子质量(Mr)为55的单链 糖蛋白.为IL.2的低亲和力受体.见于活化的T 细胞,B细胞和巨噬细胞.是反映T细胞早期活化 增殖的标志14?51.CD71(转铁蛋白受体)表达在大多 数增殖的细胞上.包括活化的淋巴细胞,单核细 胞,网织细胞和原始红细胞等.也是T细胞活化的 重要标志[61. 同种瓣移植是一种比较特殊的组织移植.初 期没有强烈的免疫排斥.也未在短期内出现移植 物功能丧失.因此.对同种瓣移植后是否存在免疫 反应有争议.许多学者认为.同种瓣移植不会引起 免疫排斥.或者即使存在免疫排斥.其程度很微 弱.有学者的研究表明.同种瓣具有免疫原性.移 植后存在免疫排斥反应.并证实免疫排斥是同种 瓣移植后钙化的主要原因ll7I,,且发现同系的大鼠 之间行同种带瓣主动脉移植后的钙含量明显低于 非同系大鼠.并推测钙含量的高低与免疫反应有 关.刘维永等证实移植物免疫反应程度与钙含量 有明显的正相关性[大J此.许多学者建议同种瓣 移植后短期使用小剂量免疫抑制利以防治同种瓣 钙化B,7,91Yankah等【【0l发现大鼠同种瓣移植后2周 给予小剂量CsA(10mg/kg1可以抑制钙化李东玉 等…J证实,适当的免疫抑制剂(CsA15mkg)对同 种移植免疫排斥有明显的抑制作用 本研究结果表明.移植后短期使用CsA只能 抑制早期2,4周的免疫排斥.并不能抑制8周以 后的免疫排斥即使不用免疫抑制剂,在8周免疫 排斥的水平也会回落至极低水平 同种瓣的钙化从4周开始.随时间的推移,钙 含量逐渐升高.在12周达到高峰.此后进入平台 期对照组4,8,12,16周4个不同时点的钙含量 较同基因组显着升高(P<0.01),证实了钙化与免 疫排斥密切相关.CsA组在移植后4,8,12,16周4 个不同时点的钙含量显着低于对照组(P<0.01), 说明移植后短期使用CsA抑制早期的免疫排斥. 从而降低了同种瓣钙化的程度. 内皮细胞是同种瓣中免疫原性最强的细胞. 平滑肌细胞免疫原性仅次于内皮细胞大量研究 证实.内皮细胞对维持同种瓣的功能至关重要,它 可以保护其下面的胶原结构和平滑肌细胞,阻止 钙盐的沉积和血栓形成.预防变性和钙化.P1is. sonnier等ll2J发现同种异体带瓣主动脉壁是免疫排 斥的主要地点.内皮细胞最早受到免疫攻击而坏 死脱落.随后出现细胞免疫和体液免疫引起的慢 性平滑肌损伤以及坏死钙化 电镜观察表明.移植后早期(2,4周)CsA组内 皮细胞破坏损伤情况较对照组明显减轻(尸< 0.01).平滑肌细胞的破坏也较对照组轻.我们推 测.移植后早期使用免疫抑制剂抗钙化的机理在 于保护同种瓣内皮细胞和平滑肌细胞.降低了其 所受到的免疫攻击 同时.我们发现.尽管CsA组的钙含量降低 了,但仍高于同基因组(P<0.01),使用CsA的确降 低了同种瓣的钙化程度.但此种程度的钙含量降 低对同种瓣功能和血流动力学的实际改善效果尚 常青.等.环孢素A防治同种异体带瓣大血管移植后钙化的研究705 需进一步研究.此外,CsA组在移植后8周后仍有 低水平的免疫排斥,且与对照组尢差异(P>O.05), 因此.移植后短期使用CsA来抑制免疫排斥和钙 化,尚需进一步观察其远期效果. 【参考文献】 【2】 【3】 【4】 【5】 【6】 陈庆良,刘迎龙.同种带瓣管道的研究和应用进展….巾 围分子心脏病学杂志20033f3):164—166. 施晓雷.丁义涛.仇毓尔.CsA和FK506在肝移植巾运 用的比较研究进展IJl_/ffH_~外科杂志,2004,12(1):77—79. 易定华.高双斌.刘维永.原子火焰吸收法测定异种生 物瓣钙含量的方法….巾华物珲医学杂忐,1988,10(2): 170—172. 邹雄,张利宁.分子免疫学与Il缶床lM1.济南:山东科技 版社.2003.54—55. 陈剑.周清.徐锦堂,等.FK506滴眼液抑制兔同种异 体角膜缘移植排斥反应的免疫病理学研究….中国实 用眼科杂志.20HD3.2】f9):696—698. 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