甲状腺乳头状癌高细胞变异MMP2的检测及其临床意义

甲状腺乳头状癌高细胞变异MMP2的检测及其临床意义 上海交通大学 硕士学位甲状腺乳头状癌高细胞变异MMP-1、P53、COX-2的检测及其临床 意义 姓名:金城 申请学位级别:硕士 专业:耳鼻咽喉-头颈外科 指导教师:王家东 20090301 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 上海交通大学硕士学位论文 前 言 传统上甲状腺癌分为分化型甲状腺癌髓样癌和未分化癌。随着对甲状腺癌认识的深入，同时病理学上又把甲状腺癌分为高分化，中间分化和低(未)分化三型。中间分化型甲状腺癌比普通的分化型甲状腺癌侵袭性高比低(未)分化型甲状腺癌侵袭性低故又被称为中间分化型甲状腺癌，包括髓样癌，甲状腺高细胞变异TCV柱状 岛状细胞癌IC和 Hürthle 细胞癌(表1)【1，细胞变异CCV弥漫性硬化性变异DSV 2】.中间分化型占所有甲状腺癌的 15,24,。高细胞变异(TCV)是甲状腺乳头状癌的一种，其肿瘤细胞的高度是其宽度的 2 倍或以上，并以其特有的形态学特征命名为高细胞变异【11】。根据 Johnson 等的研究，定义为乳头状癌中至少 30的细胞的高度是其宽度的 2 倍。甲状腺癌高细胞变型发病率大约在 4,到 12,之间【12】，但是很多病例都没被诊断，这是由于这种分型没有被广泛接受，而且没有客观的诊断，许多学者认为至少 30,的分化型甲状腺癌应该进行详细的细胞学特征描述【13】 ，而有的学者认为这比例应该达到 50,70,【14】。高细胞变型的患者平均年龄 51岁，高于普通分化型甲状腺癌。性别比上二者无显著性差异，女性发病率约为男性的二倍，但是肿瘤直径明显大于分化型甲状腺癌，达到 3.1cm。甲状腺癌高细胞变异在细针穿刺下与普通型甲状腺癌细胞学特征相似，普通甲状腺癌的细胞核特征为核大，内有假包涵体，核沟和颗粒状的染色质。其区别 PTC 的独特病理学特征包括大而长的细胞，有丰富的颗粒状胞浆，奇特的细胞核位置，和大量的多核细胞【15】。其 1 上海交通大学硕士学位论文大量的嗜酸性细胞浆把肿瘤细胞的高度变成其宽度的 2 倍以上(图 1)。其与柱状细胞变异(CCV)的区别在与 CCV 细胞核有分层，细胞浆含量少。高细胞变异(TCV)的全球报道的不多，主要是因为对他缺乏客观的诊断标准，与其他变异难于区分，使大多数人对 TCV 的认识不多。 在 2007 年的一篇文献中，在 107 个月的随访中，局部复发，远处转移和肿瘤相关死亡率分别为 71.4,，50,和 42.9【7】。高细胞变型被认为比分化性甲状腺癌更有侵犯性，愈合更差。 肿瘤的发生、侵袭和转移是当前研究的热点之一，其中血管生成是肿瘤生长和转移的基础。肿瘤血管在形成过程中，不仅需要各种血管生成因子促进内皮细胞增生，还需要蛋白酶溶解血管的基膜才一能以出芽的方式新生若要进一步在周围空间内伸展仍需要溶解周围的基质。这一过程可由基质金属蛋白酶类来完成。MMPs 是肿瘤细胞形成过程中所需要的一类蛋白水解酶，是一组由结缔组织细胞分泌的，参入细胞外基质降解的 zn2依赖性的蛋白酶家族。MMP-1 又称胶原酶-1，成纤维细胞胶原酶或间质胶原酶，由结缔组织细胞、内皮细胞及巨噬细胞产生，作用底物为 I、II、III、VI、X 型胶原，明胶，蛋白多糖等。尽管 MMP-1 在体外可由许多正常细胞产生，但与其他多种 MMPs 一样，在正常 休眠组织中 MMP-1 水平极低，一般难以检测。在体内，MMP-1 主要在生理和病理条件下，组织生长、重构期间表达，广泛发挥其生物学功能。其基因定位于染色体 11q22,q33，通过改变细胞的微环境作用于肿瘤初始阶段，从而有利于肿瘤的形成，而且它与肿瘤的侵袭及转移有关。MMP-1 还可以通过细胞粘附分子如 CD44 和整合素等来调节细胞和基质的相互作用，从而促进 2 上海交通大学硕士学位论文细胞的转移。Sugioka 等认为 C-Jun-NHZ-terminal 激酶途径参与了肝癌细胞 MMP-1的表达，使 MMP-1 表达增多，引起了肝癌的转移。近期研究表明许多恶性肿瘤细胞可以产生 MMP-1，通过旁分泌作用于癌基质，影响恶性肿瘤侵袭和转移能力。Brumme等发现在宫颈癌组织中 MMP-1 的表达增多，并且随着肿瘤分级和分期的增加而增加。Schutz 等发现在肺鳞癌中 MMP-1 的表达较正常肺组织增多，认为其可能参与了肺鳞癌的侵袭和转移。Patel 等研究发现甲状腺癌中 MMP-1 的表达明显高于良性和正常甲状腺组织。Korem 等人对良恶性甲状腺细胞中 MMP-1 和 TIMP-1 基因表达的调节进行研究，发现 MMP-1 和 TIMP,1 比例失衡导致 p53 基因定位于 17 号染色体ECM 降解，甲状腺癌容易产生浸润和转移。 人类 短臂 1 区 3.1 带(17P13.1)，全长 16-20kb基因组有 11 个外显子，10 个内含子。p53 基因具有进化保守性，可在 DNA 复制水平上调节细胞的正常生长，是细胞生长的重要的调节因子。 基因分为野生型 p53 (wtp53)和突变型(mp53)。wtp53 的抗肿瘤作用主要是阻止 G1/G0 期，使细胞不能进入 S期，从而抑制细胞的增殖，更重要的是，wtp53 基因在诱发细胞凋亡中起到了重要作用，Sanding 等用腺病毒转染 p53 基因和 p16 基因在肿瘤体外培养细胞系中，观察到p53 基因过度表达引起肿瘤细胞凋亡。在所有人类肿瘤中，p53 基因大约有 50的突变率。Levine 等提出两次突变的假说:首先是 p53 基因编码区发生突变，通过反式显性灭活作用，引起点突变细胞克隆的扩增，随后发生 p53 等位基因的丢失，导致肿瘤的形成。突变型 p53 不但丧失了野生型 p53 抑癌活性，而且促使细胞恶性转化，使 p53 基因由抑癌基因转为原癌基因。正常细胞中的 p53 蛋白是无突变的 wtp53 蛋 3 上海交通大学硕士学位论文白，具有肿瘤生长抑制功能，因其半衰期较短不易检测到，然而突变型 p53 蛋白的半衰期明显延长，因此用免疫组化检测到的 p53 蛋白通常意味着该基因突变。突变 p53 失去了抑制细胞生长的功能，从而促进肿瘤的发生。多项研究显示 p53 在甲状腺癌中的表达与甲状腺癌分化程度、淋巴结转移、肿瘤 TNM 分期均具有相关性，提示 p53 基因突变可能是甲状腺癌发生发展中的一个重要因素。 环氧化酶cyelooxygenase，COX又称前列腺素内过氧化物合成酶，是前列腺素PGs合成过程中一个主要的限速酶，可将花生四烯酸AA代谢成各种前列腺素产物，从而参与机体的多种病理生理过程，如炎症、发热、出凝血机制等。近几年来，国外诸多研究表明，COX 除了在上述炎症等过程中发挥重要作用外，还与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，成为肿瘤防治的一个新靶点。目前已证实可能有 COX,1和 COX,2 两种同工酶，COX,1 表达于多数的组织及细胞，被认为是管家基因COX,2 在正常组织中不表达，但可在各种刺激因素的作用下诱导表达，故又称为诱导型早期反应基因，参与恶性肿瘤的发生、发展，其过度表达与肿瘤新生血管的形成有关。其过度表达导致肿瘤发生的可能机制是:l催化合成大量的 PGs，刺激上皮细胞增生2通过上调原癌基因 bcl,2 和下调 E,cadherin、TGF,p 受体的表达，抑制细胞凋亡3在肝外将间接致癌物代谢成终末致癌物4通过上调 ECF、vEGF、 内皮素,1等表达，促进肿瘤血管形成5通过刺激基质金属蛋白酶分泌，促进肿瘤转移等 目前认为 COX-2 对肿瘤血管形成的调控机制其中的一个重要原因是 COX,2 可以上调MMPs 的表达，降解 ECM，调节细胞戮附，并上调促进血管生长因子的表达，促进肿瘤血管生成而增加肿瘤的侵袭力和转移力。 4 上海交通大学硕士学位论文 我们的研究包括两部分:临床研究和实验研究。临床研究部分主要研究甲状腺乳头状癌高细胞变异(TCV)与普通型甲状腺乳头状癌之间相比淋巴结转移率，远处转移率和因甲状腺疾病死亡率的差别。实验部分通过免疫组化方法检测 MMP-1，P53，COX-2 的表达，对其在高细胞型变异与普通甲状腺乳头状癌中的表达进行研究。以进一步证实两者的预后差别及其 MMP-1，P53，COX-2 在甲状腺癌高细胞变异中的发生，发展，转移中的作用。统计方法: 统计学处理应用 SPSS10.5 软件分析各组数据，临床数据采用 t 检验和 x2 检验，生存率采用 Kaplan-Meier 法检验 实验数据以“”及以上者为免疫组化阳性组，多组数据阳性率的比较采用 x2 检验，条件不满足者用精确概率法检验。三个实验数据相关性分析用精确概率法检验。当 Plt0.05 表示差别有统计学意义。 5 上海交通大学硕士学位论文 第一部分 临床研究部分1.材料和方法:1.1 病例选取 选取 1993 年 6 月到 2006 年 12 月间就诊上海交通大学医学院附属仁济医院耳鼻咽喉-头颈外科的甲状腺乳头状癌病例 413 例，所有患者均为初次手术。对所有病例的病理切片进行分类，分类标准为: 1.1.1 甲状腺癌高细胞变异(TCV) :为了减少主观上错误，选取乳头状癌中至少 50的 倍为高细胞变异。 1.1.2 普通甲状腺乳头状癌:排除所有细胞的高度是其宽度的 2 中间分化型甲状腺癌，包括所有甲状腺高细胞变异TCV柱状细胞变异CCV弥漫性硬化性变异DSV岛状细胞癌IC和Hürthle 细胞癌。 1.1.3 所有病理标本均由病理科医生进行分类，病理科医生确定分类标准后多所有切片两名医生进行各自分类。把两人的所有切片分类结果进行对照，选取结果相同的病例，对结果有异议的再由 3 名病理科医生进行讨论，最后确定其分类。1.2 临床资料 术前所有患者临床上均无发热、颈前疼痛和压迫感等特殊表现，血检促甲状腺激素、三碘甲状腺原氨酸均正常。B 超提示甲状腺内存在实质性肿块。术前诊断为甲状腺肿块，术中冰冻病理诊断为甲状腺乳头状癌，均行常规甲状腺乳头状癌手术 6 上海交通大学硕士学位论文方法:大于 1CM 的肿瘤行癌侧甲状腺全切除，甲状腺峡部全切，健侧甲状腺次全切除部分病例健侧未切除，及择区性颈淋巴结清扫术(?、?、?、?区)。若肿瘤两侧同时发生，则行双侧甲状腺全切术，及择区性颈淋巴结清扫术。有 21 例患者在家属要求下?区颈淋巴结清扫术，其中普通甲状腺癌乳头状癌病人 20 例，高细胞变异的病人 1 例。1 例高细胞变异的病人术前癌灶已发生转移的病例行姑息手术(左侧甲状腺肿块切除，左侧食道沟转移肿块切除，胸骨上窝肿块切除)。小于 1CM 的肿瘤则仅行癌灶侧甲状腺次全切除术加?颈淋巴结清扫术，有 6 例患者在家属要求下择区性颈淋巴结清扫术，均为普通型甲状腺癌乳头状癌病人。 1.3.随访:对所有病例进行门诊、电话及信件随访，所有病人均被要求补充甲状腺素，病人 3-12 月进行 B 超及 FT3，FT4TSH 检查，根据检查结果调整甲状腺素的剂量。对有复发等可疑病例进行胸片及 CT 检查，对甲状腺全切病人检查 Tg 检查。对复发病例，甲状腺癌局部复发或/和淋巴结转移的病例行甲状腺全切择区性颈淋巴 131结清扫术，术后 I 内放射(RAI)治疗，必要时行外放射治疗(RT)。甲状腺癌复发且有淋巴结以外转移行甲状腺全切术淋巴结清扫术RAIRT。2.结果: 所有切片分类后发 现甲状腺乳头状癌高细胞变异(TCV)有 28 例，其它中间分化型甲状腺癌类型 36 例，两例病人未发现病例切片，剩余为 347 例普通甲状腺乳头状癌病例。 TCV 与传统甲状腺乳头状癌相比年龄无明显差异(平均 49.6 对 46.2 岁 Pgt0.05)，TCV 肿瘤大小比传统甲状腺乳头状癌相比明显要大2.3cm 对 1.9cm，Pgt0.05TCV 多 7 上海交通大学硕士学位论文中心比例比传统甲状腺乳头状癌相比要多57.1对 29Plt0.05淋巴结转移率有明显的不同。(82.5对 35.5，Plt0.05)(表 2) ，其中 1 例 随访结果发现总共有 24 例病人因为各种原因失访(失访率为 5.8)为 TCV，22 例为普通甲状腺乳头状癌病例，其它甲状腺癌 1 例。失访病例均按照失访当年死亡计算。截至随访最后时间，TCV 病人中随访 2,3 年的有 7 例，其中 1 例随访 3 年发生转移后不久失访，随访 4,5 年的 6 例，随访 6,8 年的为 9 例，随访 8,10 年的为 5 例，10 年以上 1 例。随访结果显示普通型甲状腺乳头状癌与甲状腺癌高细胞变异(TCV)有明显的差异，TCV 的局部复发率为 39.3，比 PTC 的 9.3,明显要高(Plt0.05)，TCV 远处转移率为 28.6，明显高于 PTC 的 7.9 ，与普通甲状腺乳头状癌的 7.5有明显差异 ， (Plt0.05)，疾病相关死亡率为 21.4 (Plt0.05) TCV在复发的 13 个病人中，5 人是局?扛捶?? 人局部复发远处转移，1 人只有远处转 ，1移。远处转移最多发生于肺(5 人)与骨(1 人) 人肺与骨均发生转移。6 例死亡病例中，均为发生远处转移后死亡。生存率分析研究显示 TCV10 年生存率 53.6比 。PTC 的 80.8要低得多(Plt0.01)(表 3，图 2) 8 上海交通 1 甲状腺癌根据分化情况分类 高分化型甲状腺癌(低恶性) 大学硕士学位论文 表 普通的乳头状癌 甲状腺微癌 有包膜的甲状腺癌 囊性的甲状腺癌 普通的滤泡型甲状腺癌 中间分化型甲状腺癌 高细胞型变异 柱状细胞型变异(非囊性) 弥漫性硬化性变异 岛状细胞癌 Hürthle 细胞癌 髓样癌 低分化型甲状腺癌(高恶性) 未分化型甲状腺癌 图 1 TCV 的病理学特征 图 1 大而长的细胞，有丰富的颗粒状胞浆，奇特的细胞核位置，和大量的多核细胞。其大量的嗜酸性细胞浆把肿瘤细胞的高度变成其宽度的 2 倍以上HE×300 9 上海交通大学硕士学位论文 表 2 临床资料: 普通 PTC TCV P值 病人数 347(84) 28(6.8) 平均年龄岁 45.2 48.1 gt0.05 年龄范围(岁) 15-83 28-72 性别 gt0.05 男 16.6 14.3 女 83.4 85.7肿瘤大小(cm) 1.9 2.3 gt0.05 多中心(,) 29 57.9 lt0.05 淋巴结转移率 22.3 71.4 lt0.01 () II 区 5.3 35.7 lt0.01 III 区 10.2 25 lt0.01 IV 区 5.6 39.3 lt0.01 VI 区 16.7 64.3 lt0.01 表 3 截至最后的随访结果: 普通 PTC TCV P值 局部复发病例 9.3 39.3 lt0.05 远处转移病例 7.9 28.6 lt0.05因甲状腺疾病死亡病例 7.5 21.4 lt0.05 有转移仍成活的???2.4 7.1 lt0.05非甲状腺疾病死亡的病 4.9 3.6 gt0.05 例 10 年生存率 80.8 53.6 lt0.01 10 上海交通大学硕士学位论文图 2 PTC 与 TCV 生存率分析 11 上海交通大学硕士学位论文 第二部分 实验部分1.材料和方法:1.1 标本选取:选取临床研究中的高细胞变异病人的石蜡块 28 例，随机选取普通甲状腺癌乳头状癌 50 例，以甲状腺腺瘤中正常的甲状腺组织石蜡块 20 例作为对照组。高细胞变异与普通甲状腺乳头状癌标本经统计年龄、性别、肿瘤大小均没有显著性差异(Pgt0.05)。选取的普通甲状腺癌乳头状癌病例与全部普通甲状腺癌乳头状癌标本无明显统计学差异(Plt0.05)。1.2 试剂及仪器1.2.1 所用试剂 浓缩型 MMP-1 兔抗人多克隆抗体，浓缩型 p53 鼠抗人单克隆抗体，COX 一 2兔抗人单克隆抗体，均来自上海华美试剂有限公司。 浓缩型柠檬酸抗原修复缓冲液，浓缩型 EDTA 抗原修复缓冲液，DAB 酶底物显色试剂盒，Max Vision 试剂盒，其余试剂如二甲苯，乙醇，柠檬酸钠，氯化钠等均为国产分析纯，均来自上海华美试剂有限公司1.2.2 所用仪器 病理组织切片机LeitZ，1512 型德国医用微波炉HITACHI 日本光学显微镜Olympus 日 本 , 20’C 低 温 冰 箱 海 尔 OLYMPUS 显 微 镜 照 相 系 统 日 本OPATICALCO.LT病理图像分析仪DMR550 型，德国莱卡公司 12 上海交通大学硕士学位论文 其他:微量加样器一次性吸头载玻片盖玻片孵育盒塑料耐高温切片架等。1.3.实验步骤 l所有标本均经 10中型福尔马林固定，常规组织处理，石蜡包埋。 2石蜡切片脱蜡至水:处理前先将切片在 37?恒温烤箱中烘烤小时。在二甲苯 I、II 中各浸泡 15 分钟、10 分钟，在 95酒精 I、II 中各浸泡 10 分钟，再在 85酒精中浸泡 5 分钟，用自来水冲洗。用 PBS 冲洗，2 分钟，三次。 3抗原修复:切片浸入 0.01M 构椽酸缓冲液中，微波炉煮沸持续 10 分钟，在室温冷却 20 一 30 分钟。用 PBS 冲洗，2 分钟，三次。 43H2O2:室温孵育 5 一 10 分钟，以去除内源性过氧化物酶。用 PBS 冲洗，2分钟，三次。 5分别滴加 1:100 稀释 MMP-1 兔 :100 稀释 p53 鼠抗人单克隆抗体，COX 一 2 兔抗人单克隆抗人多克隆抗体，1 抗体工作液于切片上，4?过夜。用 PBS 冲洗，2分钟，三次。 6)每张切片滴加 5Oul 即用型 Max Vision 试剂，室温下孵育 15 分钟，PBS 液冲洗 3 分钟，3 次。 7)除去 PBS 液，每张切片滴加 1O0ulDAB 溶液，显微境下观察 5 分钟，自来水冲洗。 8苏木素复染 2 分钟，清水冲洗，85、95、100酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。1.4 结果判断 13 上海交通大学硕士学位论文 所有免疫组织化学切片均由头颈外科医生和病理科医生共同决定诊断。MMP-1，COX,2 以胞浆内出现棕黄色颗粒.