Percoll法分离培养肾小管上皮细胞（医学论文）

Percoll法分离培养肾小管上皮细胞（医学） Percoll法分离培养肾小管上皮细胞 【关键词】 Percoll 摘要 :目的 建立良好的肾小管上皮细胞培养方法。 方法 选 用SD幼鼠的肾组织进行细胞培养，采用Per-coll密度梯度离心法分 离纯化肾小管后，选择含10%新生牛血清的DMEM.F12培养基、 5%CO 2 、37?孵箱进行细胞培养。利用传1代的细胞，制作细胞 爬片，用免疫组化、透射电镜进行鉴定。 结果 细胞生长4:5天后 基本达到融合，细胞呈多边鹅卵石铺路样。结合形态学及免疫组化鉴 定，细胞培养传1代后98%的细胞为肾小管上皮细胞。 结论 用 Percoll法分离培养的细胞数量多，均一性生长较好，可重复性操作 较好。为体外研究接近组织原位RTECs细胞功能和特征及药物的筛 选提供了可行性和可能性。 关键词 :近端肾小管上皮细胞;细胞培养;离心法;密度梯度 Abstract:Objective To establish a desirable culture method for rat renal proximal tubule cells,RTECs,.Methods The kidneys of young SD rat were processed to separate and purify the renal tubule cells by Percoll gradient centrifugation.The cells were cultured in 更多精品文档,欢迎来我主页查询 DMEM.F12supplemented with10%calf serum.The bred cells were subcultured and identitied by immu-nocytochemistry and transmission electron microscopy.Results After4-5days， the cultured cells reached almost complete confluence， displaying the typical cobblestone layout.According to the results of cell morphology and immunocytochemistry，the purity of secondary cultured renal tubular epithelial cells reached98%.Conclusion The RTECs dissociated by Percoll gradient centrifugation，when cultured，will yield rich and homogeneous harvest，offering a model，simulating the RTECs in vivo，for physiological and pharmacological studies. Key words:proximal renal tubular epithelial cell;cell culture;centrifugation;density gradient 近年来，在对各种肾缺血性损伤导致肾衰的研究中发现，尽管 缺血性肾衰的发展有多种因素并可分为数个进展阶段，但是肾小管细 胞的损伤是其最终促成因素,1, 。大鼠肾的亚细胞部分也在一般情 况下被用来进行各种肾药物的代谢及免疫组化的研究,2, 。因此， 本研究旨在通过建立良好的肾小管细胞培养模型，为研究肾小管细胞 的缺血、缺氧及各种中毒性损伤等的发病机制、治疗药物筛选提供一 更多精品文档,欢迎来我主页查询 个良好的实验平台。 1 材料和方法 1.1 材料 SD大鼠3只，雌雄不拘，体重,50〒10,g，由徐州医学院实验动物中心提供。细胞培养液DMEM.F12,1?1,液,美国Hyclone公司,，添加1.2g.L碳酸氢钠，?型胶原酶购自Sigma公司，新生牛血清购自杭州四季青公司，青.链酶素购自华北制药，Percoll细胞分离液购自美国Pharmica公司，胰蛋白酶,美国Sigma公司，国内分装,，乙二胺四乙酸盐,EDTA,国产分析纯，GL20C超速冷冻离心机,武汉仪器厂,，倒臵相差显微镜,日本Olympus产品,，抗细胞角质素抗体,cytoteratin18,、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶,SABC,即用型试剂盒购自武汉博士德公司，联苯胺,DAB,显色试剂盒购自北京中山公司。 1.2 方法 1.2.1 肾小管节段的分离 大鼠实验前4h禁食禁水，以10%水合氯醛3.5ml.kg腹腔注射麻醉大鼠后无菌取肾，将其臵入含有双抗的4?生理盐水培养皿中，去除肾包膜，冰上操作，分离剪碎肾皮质约1mm大小，用生理盐水反复冲洗3次后，将其转移至含有0.25%血清、1g.L?型胶原酶的DMEM.F12溶液中，37?震荡消更多精品文档,欢迎来我主页查询 化20min，用移液管轻轻吹打15:20次，然后将尚未消化的肾皮质更换到新的胶原酶溶液中，继续震荡消化20min，再次吹打15:20次，将2次消化后的细胞悬液经100目不锈钢筛网过滤，并用玻璃棒轻轻研磨同时以生理盐水冲洗，取网下液体经200目筛网过滤后将其转移到离心管中，900r.min离心6min。离心后弃上清，将细胞沉淀用DMEM.F12制成4ml细胞悬液，取预先配制好的45%的Percoll分离液，将细胞悬液轻轻铺于其上，用GL20C超速冷冻离心机离心,13000r.min，4?，30min,，离心后取近管底的F2层，即为分离纯化的近端肾小管细胞节段,图1,。将分离纯化的肾小管细胞节段用生理盐水离心洗涤，1000r.min，10min，洗涤2次。 图1 Percoll法分离的肾小管细胞节段,〓100,,略, 1.2.2 细胞的原代培养及传代 向上述细胞沉淀 中加入含10%小牛血清的DMEM.F12培养液，吹打混匀后，接种到50ml玻璃培养瓶内，臵入37?、5%CO 2 培养箱内孵育，1.5h后将培养瓶中的细胞悬液转移到25ml塑料培养瓶中，用细胞计数板调整肾小管细胞节段密度为5〓10 5 ，24h后再补1:2ml培养基，72h左右首次换液。之后每2天换液1次。 原代培养4:5天，肾小管上皮细胞基本达到90%的融合。倾空瓶内培养液，用生理盐水洗涤细胞2遍，然后向培养瓶内加入更多精品文档,欢迎来我主页查询 0.25%胰酶-0.02%EDTA复合液约1.5ml，充分晃动培养瓶，使消化液覆盖整个细胞面，在倒臵相差显微镜下观察1:2min，见瓶内大部分细胞收缩变圆，立即返回操作台内，将消化液倾倒出，然后盖上瓶盖，将其放入37?培养箱内，利用瓶内残余的胰酶继续消化2:3min。然后取出在显微镜下观察，见几乎所有细胞都收缩变圆，加入含血清的培养液，用吸管吸取培养瓶内的液体轻轻吹打瓶壁，获得细胞悬液，900r.min离心6min。然后按1?2分装接种。4:5天后可传第2代。 1.3 细胞纯度鉴定 1.3.1 细胞爬片的制备 将经过浸泡酸、高压消毒后的盖玻片放入24孔板，准备接种传1代肾小管上皮细胞。在盖玻片上滴上含肾小管上皮细胞5〓10 8 个.L的细胞悬液，放入37?、5%CO 2 培养箱中培养2h，再加入DMEM.F12完全培养液进行培养，待细胞爬满玻片后取出。 1.3.2 肾小管上皮细胞的鉴定 1.3.2.1 免疫组化 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶法,SABC法,对爬片的肾小管上皮细胞,RTECs,进行免疫组化染色。取出盖玻片，冲洗干净培养液后加入冷丙酮固定20min。加一抗细胞角质素抗体cytokeratin18,1?200,，阴性对照以PBS代更多精品文档,欢迎来我主页查询 替。4?过夜，依次加入生物素标记的小鼠抗大鼠的IgG,二抗,及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，以DAB显色。阳性结果为胞核周围及胞质内散在分布、强度不一的棕褐色颗粒状、点状染色。高倍镜下观察，计数10个连续不重叠的视野中阳性细胞个数，计算阳性细胞百分比。 1.3.2.2 透射电镜 应用徐州医学院神经生物学实验室H-600型透射电镜观察肾小管上皮细胞的特征性超微结构。 2 结果 2.1 培养结果 原代培养12:24h见肾小管细胞节段贴壁;24h后有少量上皮样细胞从肾小管节段周边爬出;72h后有大量上皮样细胞从肾小管节段爬出;72:96h后见细胞呈指数样生长;120h后细胞已基本能达到融合，镜下观察可见细胞体积较大，细胞间紧密相连，融合成片及呈复层生长，核较大呈椭圆形，多见有2:3个核仁，呈多边鹅卵石铺路样,图2,。传代后的细胞生长迅速，3:5天后可传第2代，传3代后细胞可能因缺乏特殊的生长因子及特定的细胞外基质，生长渐渐缓慢，往往不能进一步传代。 < 更多精品文档,欢迎来我主页查询