黄鳝血清、肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

黄鳝血清、肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及部分特性 黄鳝血清、肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及 部分特性分析 第26卷第3期 2007年3月 水产 FISHERIES 科学 SCIENCE V01.26No.3 Mar.2Oo7 黄鳝血清,肠黏液免疫球蛋白的 分离纯化及部分特性分析 张静,安利国,张福淼,谢萍,杨桂文 (山东师范大学生命科学学院,山东济南250014) 摘要:采用硫酸铵盐析,SephadexG-200凝胶层析等方法从黄鳝血清和肠道黏液中分离纯化出黄鳝 血清和黄鳝肠黏液免疫球蛋白.SDS—PAGE分析表明,二者的理化性质相同;经$一巯基乙醇处理后解 离形成重链和轻链两个亚单位,分子量分别为74kD和29kD.试验结果表明,黄鳝血清和肠黏液中存 在免疫球蛋白,二者具有相同的层析和SDS.PAGE电泳特性. 关键词:黄鳝;血清;肠黏液;免疫球蛋白 中图分类号:Q956文献标识码:A文章编号:1003.1111(20o7)03-01304)4 鱼类是低等的脊椎动物,具有以免疫球蛋白为 中心的特异性体液免疫.近几年,已经从多种鱼类 的血清口?和肠黏液口J圳中分离提取到免疫球蛋 白(IgM).由于鱼类肠道中存在大量黏液,而且对 鱼类血清和黏液中免疫球蛋白进行研究,不仅可以 丰富人们对鱼类免疫学,比较免疫学的认识,而且 有助于了解鱼类特异性免疫防御机制,尤其是对鱼 类黏液性免疫机制的认识,为鱼类病害防治中口服 疫苗及浸泡疫苗的开发提供理论基础. 黄鳝(Monopterusalbus)是我国特有的经济 鱼类之一,具有较高的经济和食用价值.其肉质 细嫩,营养丰富,除食用价值外还具有一定的药用 ,黄鳝的人工养殖获得了迅速发展, 价值.近年来 但对黄鳝的免疫机制了解甚少,迄今未见有关黄 鳝免疫球蛋白研究报道,这制约了黄鳝养殖的免 疫预防和病害防治.对黄鳝免疫球蛋白进行研 究,不仅丰富鱼类免疫学研究,而且为进一步研究 黄鳝的特异性体液免疫机制奠定基础,促进黄鳝 养殖业的发展. 1材料与方法 1.1材料 黄鳝3尾,购自济南市海鲜批发市场,健康,无 损伤,体长4O一50cm,体重200—240g. 1.2血清免疫球蛋白的分离纯化J 1.2.1血清的制备 将黄鳝断尾取血,收集血液,置室温lh,放入 冰箱4?静置过夜,待血清充分析出,4000r/min离 心15min,收集上清液(约3.6m1). 1.2.2血清免疫球蛋白的分离纯化 将收集的血清用生理盐水等倍稀释,加入饱和 硫酸铵至体积分数为45%,放入冰箱4?静置过 夜,次日,4?,10000r/min离心30min,收集沉 淀,用4.0ml0.02mol/LpH8.0的Tris.HC1缓冲 液将沉淀复溶,0.02mol/LpH8.0的Tris—HC1缓冲 液透析24h,SephadexG-200凝胶过滤层析,洗脱 液为0.02mol/LpH8.0的Tris—HC1缓冲液,洗脱 速度为16ml/h,每只试管收集10min,紫外分光光 度计A:..下检测,收集第一峰,即为黄鳝血清IgM, 一 20?冻存备用. 1.3肠黏液免疫球蛋白的分离纯化… 1.3.1肠黏液的制备 从上述采过血的黄鳝中取出肠,仔细剔除肠系 膜和血管,用0.6%生理盐水冲洗肠中秽物,纵向剪 开肠,再横向把肠剪成小段,放入0.6%生理盐水 中,4?,温和搅拌3h,10000r/min离心30min,收 集上清液(约34.5m1). 1.3.2肠黏液免疫球蛋白的分离纯化 将收集的上清液加入饱和硫酸铵至体积分数 45%,放入冰箱4?静置过夜,次日,4?10000r/ min离心30min,收集沉淀,用2.0ml0.02mol/L pH8.0的rlds.HC1缓冲液将沉淀复溶.0.02 mol/LpH8.0的Tris.HC1缓冲液透析24h,Sepha— dexG-200凝胶过滤层析,洗脱液为0.02mol/L pH8.0的Tris.HC1缓冲液,洗脱速度为16ml/h, 收稿13期:2006—07—28;修回13期:2006—09—19. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30070586). 作者简介:张静(1982一)女,硕士研究生.通讯作者:杨桂文(1967一),男,副教授,研究 方向:鱼类免疫学;E—mail:yanggw@sdnu. edu.cn. 第3期张静等:黄鳝血清,肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析131 每只试管收集10min,紫外分光光度计A:..下检 测,收集第一峰,即为黄鳝肠黏液IgM,一20%下 冻存备用. 1.4SDS—PAGE测定IgM亚单位分子量 采用Mini.Protain2Cell(BioRad)进行变性不 连续垂直凝胶电泳,浓缩胶体积分数为4%,分离胶 体积分数为12.5%.取收集样品1O,2O与等 体积的样品缓冲液混合,沸水浴5,10min,各孔分 别按上样,恒定电压8OV,120rain.电泳后的 凝胶用快速银染法染色,待显色至背景清晰照相. 所用标准分子量为14.4,20.1,31.0,43.0,66.2, 97.4kD(Sagon). 2结果 2.1SephadexG-200凝胶过滤层析纯化黄鳝血清 IgM和黄鳝肠黏液IgM 黄鳝血清IgM和肠黏液凝胶IgM层析见图1, 图2.由图1,图2可见,黄鳝血清IgM和肠黏液 IgM均呈现典型的IgM吸收峰,在相同的层析条件 下,血清免疫球蛋白的洗脱体积为34.58nll,肠黏 液免疫球蛋白的洗脱体积为35.84nll. n4 O 218345O668298 管号 图1黄鳝血清lgMSephadexG-200凝胶层析 2.2SDS—PAGE测定黄鳝血清,肠黏液IgM亚单位 分子量 黄鳝血清IgM和肠黏液IgM凝胶过滤层析见 图3.由图3可见,纯化后黄鳝血清和肠黏液IgM 均呈现2条较清晰的蛋白条带,这是B一巯基乙醇的 还原作用将IgM降解成重链(H链)和轻链(L链). 对电泳结果进行计算分析,可以确定黄鳝血清和肠 黏液IgM重链和轻链分子量分别为74kD和29 kD. 2 1.6 量 虽1.2 蛔 0.8 鬟 0?4 0 2l83450668298 管号 图2黄鳝肠黏液IgMSephadexG-200凝胶层析 6 誊?97.400 簟?66,20o -?43,000 图3SDS—PAGE(12.5%)图谱 1.黄鳝全血清;2.黄鳝血清IgM;3黄鳝血清IgM; 4.肠黏液IgM;5肠黏液IgM;6蛋白分子量标准 3讨论 笔者通过硫酸铵盐析及凝胶过滤的方法首次 从黄鳝血清和肠黏液中分离纯化出免疫球蛋白. 凝胶过滤层析图谱显示黄鳝血清和肠黏液中的免 疫球蛋白均呈现典型的IgM吸收峰.SDS—PAGE显 示经巯基乙醇处理后,免疫球蛋白解离为H链和L 链2个亚单位.研究结果表明,黄鳝血清和肠黏液 中存在免疫球蛋白,并且二者免疫球蛋白具有相同 的层析和SDS.PAGE电泳特性. 鱼类IgM在血清中通常以四聚体的形式存在, 分子量为700,850kD,因此在SephadexG-200柱 中IgM作为第一个洗脱峰被洗脱下来.文献报道 鲫[21,黄颡鱼,草囱一【引,欧洲鳗[51,鲈[61,莫桑比 克罗非鱼"和大黄鱼【8]等血清IgM重链的分子量 为52,79kD;轻链的分子量一般为25,29kD.黄 鳝血清IgM在SDS—PAGE变性条件下显示2条主 要的条带,分子量分别为29kD和74kD,由此可见 黄鳝血清IgM轻重链分子量与上述鱼类接近.从 鲤H】,鲑和沟鲶黏液中分离的IgM其电泳特 性与血清IgM无明显区别.而黄鳝肠黏液IgM通 628 LL吼 县o?N书馨米 f 水产科学第26卷 过SDS—PAGE测得其重链和轻链分子量分别为74 kD和29kD,在分子量和电泳特性上与黄鳝血清 IgM也无明显区别,区别可能存在于糖基化程度和 组分的不同,这有待于进一步研究.血清IgM和肠 黏液IgM重链上方存在1条较明显的蛋白条带,分 子量为97kD,分析可能是由以下原因造成:?由于 盐析法及柱层析法进行蛋白纯化的过程较长,易产 生蛋白质降解,而且溶液的离子强度,pH,温度等因 素也会导致蛋白质的重新聚合,所以,这些蛋白带 可能是免疫球蛋白的聚合物,降解物,或连接链;? 由于IgM上的寡糖链在电泳过程中有的与IgM分 离,有的不分离,从而导致重链上还有1条明显的 条带;Bromage等利用SpA吸附和SephacrylS一 300凝胶层析的方法从6种硬骨鱼中分离纯化其免 疫球蛋白,其中在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中观察到了3条不同的重链,其分子量分 别是75,85,95kD.此蛋白条带究竟是由于试验原 因造成的,还是黄鳝本身存在的另外1条重链条 带,需要进一步研究验证. 随着黄鳝养殖业的迅速发展,黄鳝的病害也频 繁发生,使用免疫防病技术防治病害其优越性在于 能有效增强水产动物自身防御能力以维持机体内 环境的稳定,从而达到健康养殖和持续发展的目 的.免疫球蛋白是鱼类特异性体液免疫应答中最 主要的介质,对鱼类免疫球蛋白的研究是鱼类免疫 学研究的关键.本试验证实了黄鳝血清和肠黏液 中均存在免疫球蛋白,这不仅丰富了黄鳝的免疫学 材料,而且为黄鳝使用免疫防病技术进行病害防治 提供了理论基础. 参考文献: [1]杨桂文,安利国,温武军,等.鲤肠黏液与血清中免疫 球蛋白的比较研究[J].中国水产科学,1999,6(4): 109.110. 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Comp.Immunol,1987,11(4):737~38. 第3期张静等:黄鳝血清,肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析133 IsolationPurificationandPartialCharacterizationofSerum andIntestineMucusIgMfromRiceFieldEel(Monopterusalbus) ZHANGJing,ANLi—guo,ZHANGFu—miao,XIEPin,YANGGui—wen (CollegeofLifeSciences,ShandongNormalUniversity,Jinan250014,China) Abstract:ImmunoglobulinMwaspurifiedfromtheseiMmandintestinemucusofthericefiel deelMonopterus albusbyammoniumsulfateprecipitation,andSephadexG一 200gelfiltration,andwaspartiallycharacterizedonso— diumdodecylsulfate—polyacrylamidegels(SDS— PAGE)underreducingconditions.TheseiMmandintestinemucus IgMtreatedwithmercaptoethanolwasdissociatedintotwosubunits,theHandLchains,andtherelativemolecular massoftheHandLchainwas74kDand29kD.AsdeterminedbySDS--PAGE,theseiMmandintestinemucus IgMhavethesamephysicalandchemicalproperties.TheresultsrevealedthatboththeseiMmandintestinemucus ofthericefieldeelhaveimmunoglobulinMandtheyhavethesan'lesephadexG-200chromatogramandSDS—PAGE electrophoretogram.TheanalysisoffishseiMmIgMandintestineIgMmightofferthebasicinformationforfurther comparativestudies. Keywords:Monopterusalbus;seiMm;intestinemucus;immunoglobulinM(IgM) (责任编辑:晓荷) 辽宁省海洋与渔业厅提出2007年全省海洋与渔业工作新目标 2007年2月7日,辽宁省海洋与渔业厅在沈阳召开全省海洋与渔业暨党风廉政建 设工作会议.会议深入贯彻落实了党 的十六大及其历次全会,省第十次党代会和省委十届二次全会,省农村工作会议, 全国海洋厅局长暨党风廉政建设工作会议, 全国渔业专业工作会议和省纪委二次全会精神,以科学发展观为统领,总结回顾了 过去一年的工作,交流了经验,表彰了先 进,部署了全省海洋与渔业和党风廉政建设工作,提出了今年全省海洋与渔业工作 新目标. 全省海洋与渔业工作基本思路是:六抓,六保,六促. 1.抓,保服务,促管理.要进一步抓好海域使用管理制度,渔业资源管理制度,海 洋环保监督管理制度建设和落实, 确保为加快沿海经济带建设提供优质服务,促进海洋与渔业管理水平的提高. 2.抓机遇,保监测,促友好.抢抓国家整治渤海环境的新机遇,积极争取将更多的渤海辽宁海域的海洋环保项目列入国 家规划,抓好落实,确保做好海洋环境监督管理和人海排污口监测工作,促进海洋环境友好型的建设. 3.抓十增,保倍增,促增收.继续采取措施,抓好"十增".即增优良品种,增精深加工,增精品渔业,增工厂化养殖,增人 工增殖放流,增域外捕捞,增科技贡献率,增名牌产品,增水域开发,增单位价格.保证渔业倍增主要目标的实现,千方百计促 进渔民增收和海洋经济倍增. 4.抓安全,保平安,促和谐.一是下大力量,继续抓好渔业安全生产,建立严格的责任制,加大执法检查力度,消除事故 隐患,堵塞漏洞,确保实现渔业安全生产根本好转,努力建设"平安渔业".二是下大力气抓好水产品质量安全.认真总结应 对"多宝鱼"事件的经验教训,加强管理,严格标准,建立并推行渔用物资准入制,养殖生产日志制,商品鱼准出及标识制,首 查责任制,严把育苗关,进苗关,饵料关,用药关,销售关,真正实现从水体到餐桌的全过程监管,切实保证水产品质量安全,努 力构建和谐渔业.在全省营造抓质量,保安全,讲诚信,守法规,创名牌,迎奥运,努力把辽宁海鲜打造成奥运名餐,为奥运做 贡献的发展氛围和环境. 5.抓示范,保提高,促文明.抓实抓好海监,渔政示范建设工作,切实解决海监,渔政队伍存在的问,积极推进依照公务 员法管理,采取有力措施,加强,提高素质,确保打造一支政治合格,作风过硬,业务优良,纪律严明,执法公正的海监,渔 政队伍,树立良好的形象,促进海洋与渔业执法文明窗口建设. 6.抓"九化",保发展,促进渔业现代化.切实抓好渔业布局区域化,渔业开发产业化,渔业装备机械化,渔业生产标准 化,渔业养殖工厂化,渔业加工精深化,渔业经营市场化,渔业管理现代化,渔业服务 社会化,确保渔业经济又好又快发展,促 进渔业现代化建设,加快推进社会主义新渔村建设. 今年全省海洋与渔业九项工作是,进一步促进海洋经济又好又快发展,进一步为沿海经济带建设提供优质服务,进一步 强化海域审批和海洋执法监察工作,进一步加强海洋环境保护,进一步推进渔业增长方式转变,进一步强化渔业综合管理,进 一 步推进科技创新,进一步推动工作又好又快,进一步加强党风廉政建设. 今年全省海洋渔业工作目标是,全年力争完成海洋经济总产值1760亿元,为建设国家沿海经济强省奠定基础;全省渔业 经济总产值争实现720亿元;渔民人均纯收人力争达到950o元. (辽宁省海洋与渔业厅信息中心供稿)