酶解脂肪在牛奶增香中的应用.doc

酶解脂肪在牛奶增香中的应用.doc 摘要 奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之一，主要用于冷食、糖果、饮料等的增香。奶味香精还可用于饲料的加香，可以显著改善饲料的适口性，提高动物采食，在饲料行业具有很好的推广应用前景。因此，奶味香精系列产品的开发具有广阔的市场前景。 目前奶味香精的制备大致有以下几种:用单体香原料进行人工调配;利用相关微生物水解奶油，再经修饰调配而成奶味香精;采取天然萃取物调配花色香精。酶法水解制备奶味香精是以奶油(或稀奶油)做原料，利用酶解技术将奶油在一定条件下进行水解以增香150到250倍，产生具有奶香特征的化合物。它是天然的食品添加剂，香气自然、柔和，对加香产品内在质量有明显的改善和提高，赋予加香产品天然奶香口味，这是单体香料调配而成的同类奶味香精所达不到的。酶法奶香料的生产方法基于选择适宜的奶油品种，通过它们的作用使奶油中的脂肪酸(饱和与不饱和的)甘油三脂、酮酸和羟酸的甘油三酯酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸和羟酸。脂肪酸中偶数碳的香气贡献较大，羟酸进一步脱水环化生成不同碳数的丙、丁位内酯，尤其是偶数碳丁位内酯，其含量虽少，香气贡献却很大。酮酸进一步脱二氧化碳，生成甲基酮类化合物，起到增香作用。奶香组分一般包括醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、内酯、硫化物等，其香气来源一是鲜奶中的天然香气成分，二是乳品加工中形成的香气成分，主要包括双乙酰(2，3—丁二酮)、乙偶姻、丁位内酯类、丁位癸内酯、丁位十二内酯和牛奶内酯等。 本实验选取了3种微生物来源的脂肪酶对稀奶油进行酶解。结合AV值测定和感官评价，筛选出对稀奶油水解特异性最强、水解物香气评分最高的实验用酶。通过单因素实验与正交设计探索优化实验用酶水解稀奶油的工艺条件。确定牛奶的主要风味贡献基料成分。 关键词:稀奶油，脂肪酶，水解，正交设计 目录 摘要 第一章 绪论 1.1研究背景 1.2文献综述 1.3研究确定和原则与说明 第二章 脂肪酶的筛选 2.1 前言 2.2材料与仪器 2.3实验方法 2.4 结果与讨论 2.5本章小结 第三章 RO酶水解稀奶油的工艺条件的探索和优化 3.1 前言 3.2材料与仪器 3.3实验方法 3.4 结果与讨论 3.5本章小结 第四章 结论 参考文献 致谢 第一章 绪论 1.1 研究背景 1.1.1 奶味香精相关介绍 奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之-，主要用于冷食、糖果、饮料等的增香。奶味香精还可用于饲料的加香，可以显著改善饲料的适口性，提高动物采食，在饲料行业具有很好的推广应用前景。因此，奶味香精系列产品的开发具有广阔的市场前景。 奶味香气主要是由低级脂肪酸、羰基化合物以及极微量的挥发性成分组成。中短链脂肪酸对奶味香气直接贡献较大，是构成奶香的直接因素. 奶香组分-般包括醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、内酯、硫化物等，其香气来源-是鲜奶中的天然香气成分，二是乳品加工中形成的香气成分，主要包括双乙酰(2，3—丁二酮)、乙偶姻、丁位内酯类、丁位癸内酯、丁位十二内酯和牛奶内酯等。 1.1.2 奶味香精的制备 目前奶味香精的制备大致有以下几种:用单体香原料进行人工调配;利用相关微生 物水解奶油，再经修饰调配而成奶味香精;采取天然萃取物调配花色香精。酶法水解制 备奶味香精是以奶油(或稀奶油)做原料，利用酶解技术将奶油在-定条件下进行水解以增香150到250倍，产生具有奶香特征的化合物。它是天然的食品添加剂，香气自然、柔和，对加香产品内在质量有明显的改善和提高，赋予加香产品天然奶香口味，这是单体香料调配而成的同类奶味香精所达不到的。酶法奶香料的生产方法基于选择适宜的奶油品种，通过它们的作用使奶油中的脂肪酸(饱和与不饱和的)甘油三脂、酮酸和羟酸的甘油三酯酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸和羟酸。脂肪酸中偶数碳的香气贡献较大，羟酸进-步脱水环化生成不同碳数的丙、丁位内酯，尤其是偶数碳丁位内酯，其含量虽少，香气贡献却很大。酮酸进-步脱二氧化碳，生成甲基酮类化合物，起到增香作用。 近年来大量研究结果明，酶在有机溶剂中不仅能保持其生物活性，而且有许多突出的优点:可以增加有机底物的溶解度从而提高底物浓度;有机溶剂影响反应平衡，控制反应向产物侧移动，减少水介质可能带来的副反应;产物的分离与纯化比在水中容易;酶不溶于有机溶剂，利于酶的回收与再利用;反应条件温和，反应易于进行;可抑制微生物的污染等。目前在非水介质中获得应用的酶包括氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类及异构酶类等。 1.1.3 微生物脂肪酶在牛奶增香中的应用 应用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋予奶制品独特的风 味。脂肪酶释放的短碳链脂肪酸(C4-C6)使产品具有-种独特强烈的奶风味，而释放的中碳脂肪酸(C10-C14)使产品具有皂似的风味。同时，由于脂肪酸参与到类似微生物反应的过程中.增加了-些新风味物质的形成.如甲基酮类、风味酯类和乳酯类等。传统奶酪制品加工所用的脂肪酶大都来自动物组织，如猪、牛的胰腺和年幼反刍动物的消化道组织，不同来源的脂肪酶会产生不同风味特征。脂肪酶还可使用在羊奶仿制牛奶的制品中。对不同奶源的奶制品，脂肪酶的使用可大大改善其原有的不良风味，促使新的风味的产生，并能改进乳制品的营养价值。脂肪酶在生产酶改性奶酪制品中起关键作用，酶改性奶酪中含有的游离脂肪酸比只经过普通处理的奶酪中要高10倍以上，这对于其作为风味增强剂是十分有利的。 运用脂肪酶对乳脂肪进行适当程度的分解，促进风味物质的产生，能赋予牛奶更丰富饱满的风味。不同类型的脂肪酶能够产生不同的风味，如需进行初步的风味评定可采用如下的工艺进行。 1.2文献综述 1.2.1脂肪酶简介 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量;动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程;细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专-性，且微生物来源的脂肪酶-般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 脂肪酶是-类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他-些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他-些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara;Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(Veeraragavan等)。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高 稳定性和活性，对底物有特异性(Schmid等;Kazlauskas等)。 脂肪酶的催化特性在于:在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这-现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的-个特征。酯酶(E C3.1.1.1)作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸(?C8)形成的酯。 脂肪酶 是重要的工业酶制剂品种之-，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是-种特殊的酯键水解酶,它可作用于甘油三酯的酯键,使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是-种活性蛋白质。因此，-切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。 脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌[ 脂肪酶可将甘油酯(油、脂)水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。 反应式为:RCOOH+NaOH ? RCOONa+H2O 1.2.2微生物脂肪酶制备天然奶味香精的研究进展 奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之-，主要用于冷食、糖果、饮料等的增香。奶味香精还可以用于饲料的加香，可以显著改善饲料的适口性，提高动物采食，在饲料行业具有很好的推广应用前景。 目前奶味香精的制备大致有以下几种:用单体香原料进行人工调配;利用相关微生物水解奶油，再经修饰调配而成奶味香精;采用天然萃取物调配花色香精。酶法水解制备奶味香精是以奶油(或稀奶油)做原料，利用酶解技术将奶油在-定条件下进行水解以增香150-250倍，产生具有奶香特征的化合物。它是天然的食品添加剂，香气自然、柔和，对加香产品内在质量有明显的改善和提高，赋予加香产品天然奶香口味，这是单体香料调配而成的同类奶味香精所达不到的。酶法奶香料的生产方法基于选择适宜的酶源，通过它们的作用使奶油中甘油三酯水解出奶香所需的脂肪酸(饱和与不饱和的)、甘油二酯、甘油单酯、酮酸和羟酸。脂肪酸中偶数碳的酸对奶香气贡献较大，羟酸进-步脱水环化生成不同碳数的丙、丁位内酯，尤其是偶数碳丁位内酯，其含量虽少，香气贡献却很大。酮酸进-步脱羧，生成甲基酮类化合物，起到增香作用。奶香组分-般包括醇类、醛类、酸类、酯类、内酯、硫化物等，其香气来源-是鲜奶中的天然香气成分，二是乳品加工 中形成的香气成分，主要包括双乙酰(2，3-丁二酮)、乙偶姻、丁位癸内酯、丁位十二内酯、牛奶内酯等。 20世纪70年代以来，国内外香料香精公司在利用生物酶处理天然奶油生产天然奶香精基料十分活跃，有大量的文献和专利报道了在该方面的研究进展。1981年日本长谷川公司公布了利用脂肪酶处理食用油、脂肪、糖和氨基酸生产奶香料的专利。1982年日本高砂鉴臣香料有限公司的研发人员报道了利用微生物脂肪酶生产奶香料的研究，该研究对不同来源酶-动物性酯酶(牛前胃酯酶、猪胰脂肪酶)和微生物脂肪酶(柱状假丝酵母、产碱杆菌266和679、根霉菌、藻菌)对奶油的作用进行比较研究，结果表明，动物性脂肪酶主要对C4和C6脂肪酸表现了高活性，而微生物脂肪酶主要对C16脂肪酸表现高活性，此外，柱状假丝酵母脂肪酶作用奶油后得到了极好的奶香料，它对C4和C6脂肪酸 脂肪酸和C18:l脂肪酸却表现了较高活性。1983年，美国Bakal表现了低活性，而对C16 等人报道了利用油溶性脂肪酶水解奶酪或奶油和脱脂牛奶开始馏出物得到具有香气的人造奶油。1986年，芬兰Kalo P.等人瞵J报道了利用脂肪酶转酯化改变固体成分和菜籽油中的甘油三酯成分，从而改变产品的熔化特性，为制备低熔点天然奶油香基提供了-个研究思路。1989年日本YOSh等人利用脂肪酶处理油脂和杂醇油制备得到具有发酵水果香型香料物质，为生物酶解产香提供了-个新的方法。Verlm等人利用Rhizopus arrhizus 脂肪酶作为催化剂，对奶酪、重组奶酪进行水解，发现产物中的脂肪酸成分有很大的差异，而且利用酶水解牛奶脂肪得到的游离脂肪酸组成受反应条件、酶浓度和酶专-性的影响，因此，在工艺稳定性研究中，非常有必要保持反应条件和酶浓度的不变化，当然，由于不同酶、酶浓度和反应条件能得到不同的脂肪酸组成，所以，可根据需要设计不同香气风格产品。Yamamoto等人利用脂肪酶、蛋白酶、乳酸菌和天然奶油、脱脂牛奶、水混合反应获得发酵奶香料，该产品奶香丰富厚实，此外，该发酵奶香料具有稳定的游离脂肪酸、磷钨酸和丁二酮含量，可以看出国外先进科研机构在开发新型奶香料时均会对产品的香气成分进行分析，找出影响产品风格的关键香气成分。日本长谷川公司将含有25,脂肪的天然奶酪500g经85?灭菌15分钟后，冷却到40?，然后利用10 g去离子水溶解来自色素杆菌的脂肪酶O.25g，前后两者混合，在40?下搅拌反应16 h获得495 g奶油香料，该奶油香料的酸值为32，在饼干和人造奶油加香中具有很好的效果。1993年，又公布了利用来源于青霉属的脂肪酶生产持久留香的奶香料的专利，由于该产品具有较好的稳定性，因此，再饼干等需要高温处理的产品中得到了较好应用。利用固定化脂肪酶在溶剂中催化含香气和不含香气的脂肪和油(如可可脂和脱臭棕榈油)得到具有极好香气的转脂化油脂，这种油脂被用于制造巧克力。KaIlisa?等人利用Lipase和亚麻籽油混合，然后用其处理碾磨过的大豆，制各得到清新香气物质，经提取分析，证明该物质由正己醛、1-戊烯,3-醇、反-2-己烯醛、顺-2-戊烯醛按3.7:3.4:2:l比例组成，给生物产香又提供了-个新的思路。Tomasini.等人利用来源于青霉属(Pemcillium roqueforti)的脂肪酶分解脂肪生产蓝奶酪香气香料，他们在对奶油和黄油两种底物的比较中发现，经u玎 灭菌过的奶油是产生具有奶酪香气特征的游离脂肪酸的最佳底物。Silver R.S.等人利用-种脂肪酶、-种蛋白酶和-种肽酶组成的酶系统处理蛋自、脂肪、酸和水混合物，获得了高度强化的奶酪香料前体，该香料前体经加热灭酶后能得到很强的香气成分物质，能被用于奶酪的生产。EteIova M.等人研究了荧光假单胞菌脂肪酶对牛奶脂肪脂肪酸释放的 和14?储存7天的变化进行跟踪，发现中碳作用，他们对添加-定量细胞的牛奶在pH=6.5 链脂肪酸(C12—C16)被首先释放出来，然后释放长链脂肪酸(C18)，然而短链脂肪酸(C6-C10)仅生成很少的量。专-性脂肪酸从牛奶脂肪中释放出来的变异系数主要影响pH和游离脂肪酸浓度之间的关系。当长链脂肪酸的释放占主要优势时，它与pH的缓慢下降相关;当短链脂肪酸的释放为主时，牛奶的pH发生明显下降。 在国内，1999年杭州绿晶香料有限公司的张之涤进行了酶法奶类香精的研制和应用 (Yeast)、细菌(Bacteria)、放线菌的脂肪酶的分解研究，他首先对根霉(Rhlizopus)、酵母 率和各种脂肪酸含量进行评价，并确定奶油酶解率为55,嗡0,和反应时间为3-4 h较适宜，最终利用奶油酶解物作基础原料调制成自腕香精和牛奶香精，在利用奶酒酶解物和乳化工艺相结合制成乳化鲜奶和乳化炼奶香精。武彦文等人对酶法水解奶油制备奶味香精进行研究，他们选取了脂肪酶PaJataSe 2000 L(丹麦Novo公司)对不同类型的奶油、奶酪和牛奶进行酶解，结果发现，在非水介质下水解得到的奶香浓郁和赋香效果明显的奶味香精。水解时以乙醇或丙酮为溶剂，在pH7.0、50?下水解4 h，酶用量为1‰1.5,时得到的奶味香精香气最浓郁。刘敏尧等人以天然奶油为原料，经过加水稀释、搅拌乳化、巴氏杀菌、降温、酶解、灭酶、浓缩而制成奶味香精，其特征在于:在酶解工艺中，采用复合酶制剂，复合酶制剂以脂肪酶为主要成分，其他成分还包括蛋白酶、葡萄氧化酶、过氧化氢酶和乳糖酶中的-种、两种、三种或四种;复合酶制剂的添加量以原料重量计为O.2,.10,;酶解温度为35.55?，酶解时间为4.16小时。该发明制备的奶味香精，香气自然、柔和，与传统工艺制备的产品相比，可增香150,250倍，对加香产品的内在质量有明显的改善和提高，是-种理想的天然食品添加剂。 在转酯化研究方面，以前的科研工作者开展了大量的研究，但发现，在这些研究中，主要侧重于提高油脂的凝固点，对通过转酯化降低奶油的凝固点，从而使奶油在常温下仍保持透明液体状的研究未见报道。在这里介绍-个定向转酯化的思路，可作为以后研究降低奶油的凝固点-个技术思路。Garcia等人利用脂肪酶制得的固定化酶催化亚油酸和奶油发生转酯化，释放出短链脂肪酸，特别是丁酸和己酸，最终获得高亚油酸含量的奶油。Caill等人利用甘油酯和包含20(65,C16:l脂肪酸的由12-24碳原子数组成的脂肪酸混合物制备C16:1和C16:0比率大于2(O与C16:1和C18:l比率大于1.2的油脂产品，该产品在食品中有很好的应用，主要通过C16:1专-性酶部分水解鱼油，分馏出脂肪酸。例如，利用脂肪酶水解鲱油得到45,转化率水解物，产物利用丙酮分馏，并利用RllizomuCor miehei脂肪酶重新转脂化得到C16:1含量较丰富的油。因此，认为，若要改变奶油的凝固特性，可定向地利用低碳链脂肪酸与奶油中长碳链脂肪酸进行部分交 换，从而获得低凝固点的奶油香精。 在牛奶香气和滋味研究方面，Kawasa公布了奶香型化合物的组成的专利，专利报道奶香型化合物的组成包括内酯、脂肪酸和脂肪和油的水解产物。此外，奶香料也包括醛、酯、醇、酮、含氮化合物、含硫化合物、蛋白水解物、牛奶和乳制品分馏物等。Hasb研究UHT牛奶香气的变化情况，他们的研究表明，牛奶在热处理过程中香气会发生改变，热处理牛奶会使牛奶成分形成易挥发，利用气相色谱分析UHT全脂、唧半脂和UHT脱脂牛奶发现，牛奶香气受热处理和牛奶成分组成两方面影响。利用感官评价试验对不同温度对处理后的牛奶的感官特性的影响进行评价测定，他们认为在UHT处理工艺下，乳清蛋白变性率和凝乳能力是加热温度对牛奶的物理化学特性影响的最可靠的指标物，在130?或以上温度，乳糖也被用于作为指标物，可口性主要通过对牛奶品尝中香气、余 2秒钟。通过感官评价和主味、新鲜度和强度来判断，他们比较喜欢的工艺是130?处理 成分分析结果发现，与牛奶体态相关的感官标记如奶香、牛奶口感、粘稠度和脂肪随明T处理温度的上升变得更强。在140?杀菌2秒条件下牛奶体态变得更加强烈，但他们发现唧工艺的变化没有导致牛奶特性方面发现明显的差异。Bendall利用-种新发展的溶剂辅助香气蒸发技术(SAFE)对两种不同喂食的新西兰奶牛所产的新鲜牛奶香气成分进行提取和气相嗅觉测量分析比较，在得到的71种香气成分中有66种被鉴定出， 尽管两种牛奶的滋昧有很大差异，但它们所有的组分几乎相同，仅有-种化合物，6-l 2:2内酯是明显的香气活性物质发现于饲料喂食的牛奶中，而在牧草喂食的牛奶中没被发现，因此，不同的牛奶滋味差异首先是由香气物质的含量差异所造成的，即使是采用唯-的喂食方式也有可能发生。Rberts D(D(等人通过实验设计，比较了不同水平的非脂乳固体和牛奶脂肪对香气化合物挥发性的影响，他们利用固相微萃取法和氢火焰检测气相色谱法对三类化合物的行为进行了鉴定，这三类化合物分别是:(1)不受牛奶组成的添加的影响的物质(如丁二酮，2，3(戊二酮，愈创木酚);(2)受牛奶脂肪而不受非脂乳固体影响而导致挥发性降低的物质(如3(甲基丁醛，2-甲基丙醛，4-乙基愈创木酚);(3)挥发性受非脂乳固体影响而降低，但受牛奶脂肪影响降低更加明显的物质(如大马酮，1(辛烯(3(酮)。最后-组是仅有-个表现了香气成分和牛奶蛋白或乳糖之间的相互作用。然而，当体系中存在脂肪时，非脂乳固体不进-步影响香气成分的释放。这个结果表明在液态牛奶体系中，香气化合物被脂肪吸附是主要的保留机制。因此，开发具有纠味作用和热稳定性较好的奶香精将十分有意义。 在乳化产品设计方面，TSujinal利用单甘酯和牛奶蛋白混合物制备食品乳化剂，该乳化剂中的单甘酯主要成分琥珀酸单甘酯、二乙酰酒石酸单甘酯、柠檬酸单甘酯、乙酸单甘酯和乳酸单甘酯，在乳酪和人造奶油中应用后，即使添加少量的牛奶成分，就能使产品具有很好的奶香气。国际上生产天然奶香精基料最著名的公司是美国的伯特毕斯公司，该公司产品剂型齐全，具有水溶性粉末状产品系列、油质香基产品系列、流动性油质产品、水溶性膏状物等剂型，产品特点鲜明，贴近天然产品风格，因此，它的产品应 用遍及冰淇淋、方便汤包、奶类饮品、酸奶、烘烤类、脂肪代用和人造奶油，据不完全统计，伯特毕斯公司的奶香精产品每年在中国的销售额超过-亿元，占据中国奶类香精市场的半壁江山。国内形成规模的生产厂家是天津艾尔森香料有限公司，该公司在产品外观和剂型设计方面处于国内领先地位，它具有油质、粉末和乳化香精三种剂型，目前比较受关注的是其低凝固点油质产品，代表了国内领先技术，据不完全统计，该公司在中国奶类香精市场的年销售额在5000万左右。 1.3研究方案确定和原则与说明 本实验的研究方案分为三个阶段 (1)研究3种脂肪酶对稀奶油的酶解情况并筛选出对稀黄油具有较强特异性的脂肪酶。 (2)探索优化该酶水解稀奶油的工艺条件。 (3)利用感官评定和脂解率对酶解产物的风味进行评价。 1.3.1实验方案 将50g稀奶油加入锥形瓶中。搅拌，乳化，对稀奶油进行巴氏灭菌处理，85C 10min 降温至酶解最适温度，添加脂肪酶水溶液 将锥形瓶置于恒温振荡培养箱。反应至建议反应时间。热处理灭酶，85C 30min。静置分层，取上层酶解物。将酶解物添加入纯牛奶中，添加量为0.1%。分析各个酶解物的酸值AV并对其风味进行感官分析。根据评分，筛选出后续实验用酶及确定其最佳工艺条件。 1.3.2实验用酶的筛选的依据 筛选依据:酶解物具备纯正浓郁奶味，上下分层明显等特点 评价指标:酸值和感官评价 (1)酸值acid value (AV) 依据中华人民共和国国家标准GB/T 5530-2005 动植物油脂酸值和酸度测定，来测定上层酶解物的酸值。酸值的定义为:按照本标准规定的方法测定，中和1克油脂中游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数，用毫克每克表示。 = 56.1*C *V /m AV(mgKOH/g) 式中,C-所用KOH标准溶液的浓度(mol/L);V-所用KOH标准溶液的体积(mL);m-样品的质量(g);56.1-氢氧化钾的摩尔质量(g/mol)。 本实验采用热乙醇测定法来测定上层酶解物的酸值，进而确定上层油脂的酶解程度。热乙醇测定法的原理为:试样溶解于热乙醇中，用氢氧化钾水溶液滴定。试剂:乙醇，最低浓度为95%乙醇 ;KOH，标准溶液的浓度c(KOH)=0.1mol/L ;酚酞指示剂，10g/L，10g的酚酞溶解于1L的95%乙醇溶液中。仪器:微量滴定管、分析天平。测定 方法:将含有0.5mL酚酞指示剂的50mL乙醇溶液置于锥形瓶中，加热至沸腾，当乙醇的温度高于70度时，用0.1mol/L KOH溶液滴定至溶液变色，并保持15s不褪色，极为滴定终点。 (2)感官评价 依据中华人民共和国国家标准GB/T 14454.2-2008 香料 香气评定法。将一定量的上层酶解物溶于纯牛奶中，通过感觉比较评价，筛选出奶香纯正浓郁的实验组。 按表分别对酶解物的香气纯度及强度进行评分，评分结果为二者之和。 表1-1 香气评分标准 香气纯度 分数 香气强度 分数 纯正 39.1~40 浓烈刺鼻 39.1~40 较纯正 36.0~39.0 强烈刺鼻 36.0~39.0 可以 32.0~35.9 较刺鼻 32.0~35.9 尚可 28.0~31.9 比原料风味强 28.0~31.9 及格 24.0~27.9 微强 24.0~27.9 不及格 24一下 原料风味 24一下 1.3.3正交试验设计 优化实验采用正交设计来确定最佳工艺条件。 正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。正交试验设计的基本特点是:用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。 正交试验是用部分试验来代替全面试验的，它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析;当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合。 正交性:任一列中，各水平都出现，且出现的次数相等正交表的三个基本性质中， 代表性:一方面:任一列的各水平都出现，使得部分试验中包括了所有因素的所有水平;任两列的所有水平组合都出现，使任意两因素间的试验组合为全面试验。另一方面:由于正交表的正交性，正交试验的试验点必然均衡地分布在全面试验点中，具有很强的代表性。因此，部分试验寻找的最优条件与全面试验所找的最优条件，应有一致的趋势。 综合可比性:任一列的各水平出现的次数相等;任两列间所有水平组合出现次数相等，使得任一因素各水平的试验条件相同。这就保证了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干扰。从而可以综合比较该因素不同水平对试验指标的影响情况。 正交性是核心，是基础，代表性和综合可比性是正交性的必然结果。根据以上特性， 我们用正交表安排的试验，具有均衡分散和整齐可比的特点。 确定4个实验因素及其每个因素的3个水平，建立正交设计表。 第二章 脂肪酶的筛选 2.1 前言 实验研究了3种不同来源的脂肪酶，分析了稀奶油上层酶解物的酸度及其他性质及对其风味进行评定。筛选出最佳实验用酶。 2.2材料与仪器 稀奶油:光明乳业股份有限公司乳品二厂提供，脂肪含量43,，酸度12 T; 脂肪酶:帝斯曼(DSM)食品配料部提供，性质及建议添加量见表1; 表2-1:DSM脂肪酶性质和建议添加量: 脂肪酶 RO AN 250 来源 Rhizopus oryzae Aspergillus niger Mucor javanicus 活力 8000 LU/g NLT 15000 FCCIII LU/g 250 LU/g 最适反应温度 35-45?C 35-45?C 40-50?C 最适pH 6.5-7.5 4.0-6.0 7.0-8.0 建议添加量 0.5%-1.0% 0.1-0.2% 0.01-0.10% 建议反应温度 35-45?C 35-45?C 40-50?C 建议反应时间 3-4h 4-8h 4-8h 风味类型 增加头香 头香和口感均有增加; 增强牛奶奶油感; 清新感 风味饱满 口感饱满 水解物pH值范围 5.2-5.4 6.3-6.5 5.1-5.5 2.3实验方法 将50g稀奶油加入锥形瓶中。搅拌，乳化，对稀奶油进行巴氏灭菌处理，85C 10min 降温至酶解最适温度，添加脂肪酶水溶液 将锥形瓶置于恒温振荡培养箱。反应至建议反应时间。热处理灭酶，85C 30min。静置分层，取上层酶解物。将酶解物添加入纯牛奶中，添加量为0.1%。分析各个酶解物的酸值AV并对其风味进行感官分析。 乳脂肪的酶解反应实验步骤如下: 1、将50g稀奶油加入锥形瓶中. 2、搅拌，乳化，对稀奶油进行巴氏灭菌处理，85C 10min 3、降温至酶解最适温度，添加脂肪酶水溶液 将锥形瓶置于恒温振荡培养箱 4、反应至建议反应时间 5、热处理灭酶，85C 30min 6、静置分层，取上层酶解物。 7、将酶解物添加入纯牛奶中，添加量为0.1%。 8、分析各个酶解物的酸值AV并对其风味进行感官分析。 9、根据评分，筛选出后续实验用酶及确定其最佳工艺条件。 2.4 结果与讨论 2.4.1 脂肪酶的筛选 实验研究了3种不同来源的脂肪酶，分析了稀奶油上层酶解物的酸度及其他性质及对其风味进行评定。 在各个因素中，酶催反应影响因子的主次关系为:酶浓度>温度>时间。 介于酶浓度是最重要的影响因子。筛选酶时，本实验将其他反应条件都设置为建议反应条件;而将酶浓度作为切入点，将其设置为唯一变量。得到各个酶的最佳酶解物风味，再将3种酶解物做横向比较，筛选胡最佳用酶。 结合各个酶的建议反应条件，初步的参数设置如下: 反应时间:4小时;反应温度:40?;摇床转速:180r/min。 2.4.2 脂肪酶250的酶解反应 如表2-2所示，稀奶油在不同浓度250酶量条件下的反应。 表2-2:不同浓度脂肪酶250下，AV值及其感官评价 编号 对照0 1 2 3 4 5 6 7 酶量 0 0.02% 0.04% 0.06% 0.08% 0.10% 0.20% 0.30% AV 1.6 6.45 9.20 11.22 12.34 13.52 15.09 21.94 感官评分 58 54 52 48 43 41 38 感官评价 淡淡的无增香酸味增较浓烈浓烈的5至7酸味刺鼻，带有较强的 奶香 效果，较加 的酸味 酸味，有油耗味 单薄的油耗味 酸味 图2-1:脂肪酶250的加酶量对AV值的影响 图2-2:脂肪酶250的加酶量对感官评分的影响 如表2-2、图2-1及图2-2所示，感官评分与AV值随着酶量的呈现的变化趋势为负相关。得出如下结论: 结论1:脂肪酶250在建议条件下催化下，实验结果AV和感官评价效果不佳。不宜作为实验用酶。 2.4.3 脂肪酶AN的酶解反应 如表1所示，稀奶油在不同浓度AN酶量条件下的反应。 表2-3:不同浓度脂肪酶250下，AV值及其感官评价 编号 对照0 1 2 3 4 5 6 酶量 0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.25% 0.30% AV 1.40 1.63 2.02 2.5245 3.03 3.48 感官评分 51 54 57 60 65 63 感官评价 淡淡的淡淡的淡淡奶奶香增奶香继奶香最奶香浓 奶香 奶香，与香，较1加 续增强 为浓烈，烈，略带 对照组号略浓 但不刺有刺鼻 无差异 鼻，整体感。 圆润。 图2-3:脂肪酶AN的加酶量对AV值的影响 图2-4:脂肪酶AN的加酶量对感官评分的影响 如表2-3、图2-3及图2-4所示，AV随着E/S增加而增加，感官评分则呈现为先增加后下降的趋势，在0.25%为最高值。得出下列结论: 结论2:编号5(酶浓度为0.25%)，AV值=3.03，且香味奶香最为浓烈，但不刺鼻，整体圆润。 2.4.4 脂肪酶RO的酶解反应 如表3所示，稀奶油在不同浓度RO酶量条件下的反应。 表2-4:不同浓度脂肪酶RO下，AV值及其感官评价 编号 对照0 1 2 3 4 5 6 7 酶量 0 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.60% 0.80% 1.00% 酶质量/g 0 0.0215 0.043 0.0645 0.086 0.129 0.172 0.215 滴定值 0.27 0.6 0.8 1.2 1.32 1.75 1.95 2.35 AV 1.51 3.37 4.49 6.73 7.41 9.82 10.94 13.18 感官评分 64 70 68 63 59 57 53 现象描述 分层效果，油脂厚度，油脂清澈度:0至7逐渐增加。 感官评价 淡淡的稍浓于奶香浓奶香较 奶香 对照组 郁，香味浓，但有4至7异味感依次递增 突出。 异味感 图2-5:脂肪酶RO的加酶量对AV值的影响 图2-6:脂肪酶RO的加酶量对感官评分值的影响 如表2-4、图2-5及图2-6所示，AV随着E/S增加而增加，感官评分则呈现为先增加后下降的趋势，在0.20%为最高值。得出下列结论: 结论3:编号2(酶浓度0.20%)，AV值=4.49，奶香浓郁，香味突出，无异味感。 2.4.5 筛选结果 研究发现，C4-C12的脂肪酸对香气的贡献爱你较大，而C16以上的饱和长链脂肪酸则会带来皂臭味等不良气味，从而影响产品的香气质量，应尽量减少其生成。不同来源的脂肪酶由于酶活性中心结构的差异，水解相同的甘油三酯所表现出的脂肪酸特异性也不相同。因此，筛选出合适的酶是获得纯正、浓郁奶味香基的前提。 如表4所示，结合上述所得3项结论，横向比较: 结论1:脂肪酶250在建议条件下催化下，实验结果AV和感官评价效果不佳。不宜作 为实验用酶。 结论2:脂肪酶AN编号5(酶浓度为0.25%)，结合AV值=3.03，且香味奶香最为浓郁， 但不刺鼻，整体圆润。 结论3:脂肪酶RO编号2(酶浓度0.20%)，结合AV值=4.49，奶香浓郁，香味突出，无异味感。 表2-5:脂肪酶对乳脂肪酶解反应的影响 脂肪酶 250 AN RO AV(mg/g) 6.45 3.03 4.49 感官评价 对增香无贡献，且有较刺奶香最为浓烈，但不刺奶香浓郁，香味突出。无 鼻的酸味 鼻，整体圆润 异味感 感官评分 58 65 70 筛选结论如下: 脂肪酶250在浓度极低的条件下(0.02%)上层油脂即带有不愉快的酸味。首先将其排除。在筛选RO与AN中作为最佳实验用酶的情况下，综合考虑AV值及其感官评价。在AV值上，AN(3.03mg/g)低于RO(4.49mg/g)，且在感官评价上，AN整体也低于RO(70>65)。 综上所述，筛选出脂肪酶RO作为实验用酶进行后续实验。 2.5 本章小结 实验研究了3种不同来源的脂肪酶，分析了稀奶油上层酶解物的酸度及其他性质及对其风味进行评定。 研究发现，C4-C12的脂肪酸对香气的贡献爱你较大，而C16以上的饱和长链脂肪酸则会带来皂臭味等不良气味，从而影响产品的香气质量，应尽量减少其生成。不同来源的脂肪酶由于酶活性中心结构的差异，水解相同的甘油三酯所表现出的脂肪酸特异性也不相同。因此，筛选出合适的酶是获得纯正、浓郁奶味香基的前提。 由表2-5中可以看出，3种脂肪酶酶解物中脂肪酶RO的感官评价最好，其次是AN。这表明脂肪酶RO对乳脂肪的酶解能力较强，而且该酶酶解物各脂肪酶之间的比例协调，风味纯正浓郁。因此选择脂肪酶RO作为实验用酶进行后续实验。 第三章 RO酶水解稀奶油的工艺条件的探索和优化 3.1前言 基于第二章的结论，选择脂肪酶RO作为实验用酶进行后续实验。探索和优化RO酶水解稀奶油的工艺条件。 3.2材料与仪器 稀奶油:光明乳业股份有限公司乳品二厂提供，脂肪含量43,，酸度12 T; RO脂肪酶:帝斯曼(DSM)食品配料部提供。 3.3 实验方法 在锥形瓶中，加入50g稀奶油，热处理(85度，5分钟);降温至所用脂肪酶的最适温度，加入脂肪酶，混合均匀;然后将锥形瓶置于恒温振荡箱中，在适合条件下进行酶解反应。反应终止后灭酶(85度，30分钟)，静置分层，上层酶解物用于进一步分析。 乳脂肪的酶解反应实验步骤如下: 1、将50g稀奶油加入锥形瓶中. 2、搅拌，乳化，对稀奶油进行巴氏灭菌处理，85C 10min 、降温至酶解最适温度，添加脂肪酶水溶液 将锥形瓶置于恒温振荡培养箱 3 4、反应至建议反应时间 、热处理灭酶，85C 30min 5 6、静置分层，取上层酶解物。 7、将酶解物添加入纯牛奶中，添加量为0.1%。 8、分析各个酶解物的酸值AV并对其风味进行感官分析。 9、根据评分，筛选出后续实验用酶及确定其最佳工艺条件。 3.3.1单因素实验 如表2显示，分别考察酶浓度E/S，温度，时间，转速，pH对AV值及其感官评价的影响，反应结束后85度水浴30min灭酶，静置分层。 表3-1:单因素实验参数表 因素 水平 E/S 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.60% 0.80% 温度 35 38 40 42 45 50 时间 3 3.5 4 4.5 5 6 转速 80 130 180 230 280 pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8 3.3.2正交设计 在单因素实验的基础上，以酸值和感官评价为评价指标，对酶浓度，反应温度，反应时间进行正交试验以确定稀奶油酶解的最佳工艺条件。 表3-2:正交试验因素水平表 因素 水平 D pH A酶浓度 B时间 C温度 r/min (%) (h) (?) 1 0.15 3.5 35 6.5 2 0.20 4 40 6.75 3 0.25 4.5 45 7.0 3.4结果与讨论 3.4.1 单因素实验 研究选用脂肪酶RO作为实验用酶，分别对各个单因素做进一步讨论。 (1)E/S的影响 脂肪酶酶解脂肪时，脂肪酶的用量对稀奶油酶解物的风味有较大的影响。脂肪酶用量少时，水解不完全，风味物质生成量少，乳制品的风味尚未充分反映形成;脂肪酶量用量过多时，虽然大大降低反应所需活化能，反应更为迅速，并生成大量的风味物质，但会引起其他不良现象的产生，如水解物变酸，不良风味的形成，同时也相应增加了生产成本。因此，合适的脂肪酶用量是影响稀奶油酶解物的重要因素。 表3-3:E/S对乳脂肪酶解反应的影响 1 2 3 4 5 6 7 编号 对照0 0 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.60% 0.80% 1.00% 酶量 0 0.0215 0.043 0.0645 0.086 0.129 0.172 0.215 酶质量/g AV 1.51 3.37 4.49 6.73 7.41 9.82 10.94 13.18 感官评分 64 70 68 63 59 57 53 感官评价 淡淡的稍浓于对奶香浓奶香较 奶香 照组 郁，香味浓，但有4至7异味感依次递增 突出。 异味感 图3-1:RO的E/S对乳脂肪酶解反应的影响 图3-2:不同RO的E/S对感官评分的影响 如表3-3、图3-1及图3-2所示，随着反应体系中，脂肪酶含量的增加，酸值也在随之增加;当E/S达到0.20%时，奶油风味最为浓郁。但当超过0.20%是，酸值继续上升，但感官评价上则呈降低的趋势，风味则有对照组清淡的奶香味变得有刺鼻的异味感。曾和考虑以E/S为0.20%时最佳。 (2)反应时间的影响 酶解时间的长短直接影响到乳脂肪水解的程度，进而也会影响酶解产物的风味。一般而言，一个酶解反应，反应时间越长，反应就会越彻底。但实际上，乳脂肪的酶解反应过程较为复杂，过长的时间反而会造成不良风味的产生，进而影响整体风味。所以说， 不一定是酶解时间越长越好，并且反应时间的增加会增加相应的生产成本。但如果酶解时间过短，酶解反应不充分，风味物质生成量少，乳制品的风味就不会充分形成。所以要达到理想的风味，反应时间应严格控制。在反应初期，酶解反应的速度较快，酸值和脂解率增加较快;随着底物浓度的下降及酶活性的降低，反应速率逐渐降低，酸值和脂解率的增加趋于平缓。 表3-4:反应时间对乳脂肪酶解反应的影响 1 2 3 4 5 6 7 编号 对照0 0 2 3 3.5 4 4.5 5 6 反应时间/h AV 1.51 3.70 4.49 5.89 6.73 7.85 8.08 8.47 感官评分 48 57 64 71 63 56 54 感官评价 淡淡的与对照组奶香略浓香味增奶香浓郁奶香与编奶香浓又较大 奶香 无异 于对照组 加，但有香纯。无号4相郁，但略的酸败 点刺鼻感 异味感 似，但有带酸味，味和臭 单薄的油影响整体味。 耗味 味道 图3-3:RO酶在不同反应时间下的AV值 图3-4:不同反应时间对感官评分的影响 如表3-4、图3-3及图3-4所示，可以看出，酶解反应进行到4h后，感官评价趋于下降;进行到4.5h后，AV的增加趋于平缓。随着酶解时间的延长，酶解物的酸值过大，风味有原来的奶香变成酸味兼具臭味，气味难以接受。因此，综合考虑选择酶解时间4h较为适合。 (3)反应温度的影响 温度影响着酶解反应的很多方面，其中包括对酶解反应的速度和酶稳定性等的影响。脂肪酶咋最佳反应温度下催化反应时，反应速率快。酶解的最佳温度不仅仅等于简单的酶的最适温度，还跟底物性质、反应时间等因素有关。反应温度低于酶的最适温度时，酶活力低，同时也影响底物的粘度进而影响传质速率，酶与底物接触不充分，最终导致酶解反应不充分。反应温度高于酶的最适温度时，则由于酶在高温下失活，酶活力下降甚至导致变性，最终导致酶解反应速率下降甚至反应停止。 表3-5:反应温度对乳脂肪酶解反应的影响 1 2 3 4 5 编号 35 38 40 42 45 反应温度/? AV 6.45 6.56 6.73 7.01 7.35 63 67 69 60 56 感官评分 感官评价 奶香浓郁，无异奶香浓郁，与奶香浓郁香纯,有油耗味 产生难闻的酸 味感，但香气较3相似 无异味感 臭味 编号3较淡 图2-5:RO酶在不同反应温度下的AV值 图3-6:不同反应温度对感官评分的影响 如表3-5、图3-5及图3-6所示，可以看出，在35-40?范围内，温度的升高能够加快反应的进行，酸值随之增加;酶解物的风味也随之增强;40?时，酶解物香气最为浓郁;温度就上升，酸值也相应增加;但脂肪酶开始失活。到45?时，酶解物的风味变得具有酸臭味。因此，该酶酶解的最佳温度为35-40?。 (4) 摇床转速的影响 由于脂肪酶是一种作用于油水界面上的水解酶，因此，当油水乳化时，提供的相界面面积比较大，脂肪酶可以表现出较高的酶活力，从而提高酶促反应的速度。本实验通过控制摇床转速来增加油水两相界面面积，考察转速对脂解反应的影响。实验结果如图 5所示，脂解率随着摇床转速增加而增加，当摇床转速达到180r/min时，脂解率有明显的增加。当转速继续增加时，脂解率基本不再增加，反而增加了反应的动力消耗。因此，转速控制在180r/min较为合理。 表3-6:转速对乳脂肪酶解反应的影响 1 2 3 4 5 编号 80 130 180 230 280 转速/r/min AV 4.94 5.27 6.83 6.93 7.15 59 62 68 70 71 感官评价 图3-7:RO酶在不同反应转速下的AV值 图3-8:不同反应转速对感官评分的影响 实验结果如图3-7、图3-8所示，脂解率随着摇床转速增加而增加，当摇床转速达到180r/min时，脂解率有明显的增加。当转速继续增加时，脂解率基本不再增加，反而增加了反应的动力消耗。因此，转速控制在180r/min较为合理。 并且在转速在180到280 r/min之间，AV值及感官评分增幅均很小，考虑到反应的动力消耗和生产成本，在后续的正交实验中剔除对转速这一单因素的考虑。 (5) pH的影响 各种酶在一定条件下都有其最适pH值。酶所处反应环境的pH 过低或过高都会影响酶的活性甚至会使酶变性失活。pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适PH，酶的最适pH不是一个常数，它的大小与底物的种类和浓度、缓冲液的性质和浓度、介质的离子浓度、温度、反应时间有关。在测定某种酶的活力时，采用该酶的最适pH，并用适当的缓冲液维持最适pH。 表3-7:pH对乳脂肪酶解反应的影响 1 2 3 4 5 6 7 编号 pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 AV 4.54 5.16 7.35 7.29 6.17 3.93 3.76 52 57 65 71 70 63 51 感官评价 图3-9:RO酶在不同反应pH下的AV值 图3-8:不同反应pH对感官评分的影响 如表3-6，图2-5所示，RO酶在pH6.5-7.0时，处于最佳酶活状态。 3.3正交试验 在单因素实验的基础上，以酸值和感官评价为评价指标，对酶浓度，反应温度，反 44 应时间及反应pH进行正交试验以确定稀奶油酶解的最佳工艺条件。L(3) L(3)99 表3-8:正交实验结果 A E/S D pH AV 编号 B 时间 C 温度 感官评价 4.488 1 1 1 1 1 奶香与酸败味并存 6.171 2 1 2 2 2 气味较好，不浓烈 5.049 3 1 3 3 3 浓烈的刺鼻感 6.4515 4 2 1 2 3 不愉快的气味，过香 6.171 5 2 2 3 1 香味最为愉快 5.3295 6 2 3 1 2 奶香味交淡 5.8344 7 3 1 3 2 淡淡奶香 5.4978 8 3 2 1 3 较浓郁，但不如5 5.3295 9 3 3 2 1 淡淡奶香，没有刺鼻 k1 5.236 5.5913 5.1051 5.3295 k2 6.1523 5.9466 5.984 5.7783 k3 5.5539 5.236 5.6848 5.6661 0.9163 0.7106 0.8789 0.4488 极差R A >C >B >D 主次顺序 A2 B2 C2 D2 优水平 A2 B2 C2 D2 优组合 根据正交设计的特性，对A1、A2、A3来说，三组试验的试验条件是完全一样的(综合可比性)，可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3应该相等，但由上面的计算可见，kA1、kA2、kA3实际上不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3的大小可以判断A1、A2、A3对试验指标的影响大小。由于试验指标为液化率，而kA2>kA3>kA1，所以可断定A2为A因素的优水平。 同理，可以计算并确定B2、C2、D2分别为B、C、D因素的优水平。 四个因素的优水平组合A2B2C2D2为本试验的最优水平组合，即RO酶酶解稀奶油的最佳工艺条件为:E/S 0.20%、反应时间4h、反应温度40?、pH为6.75。 3.4 正交结果的验证 将反应条件设置为:E/S 0.20%、反应时间4h、反应温度40?、pH为6.75。测定反应后上层酶解物的AV值，并对其作出感官评分。结果如表3-9所示: 表3-9 正交结果的验证 E/S pH 反应时间 反应温度 AV值 感官评分 0.20% 4h 6.75 40? 3.5 本章小结 在单因素实验的基础上，通过正交实验确定脂肪酶RO酶解稀奶油的最佳条件:E/S 0.20%、反应时间4h、反应温度40?、pH为6.75。在此优化工艺条件下，稀奶油的酶解反应较充分，脂肪酶RO的酶解产物风味较好。 第四章 结论 实验研究了3种不同来源的脂肪酶，分析了稀奶油上层酶解物的酸度及其他性质及对其风味进行评定。 研究发现，C4-C12的脂肪酸对香气的贡献爱你较大，而C16以上的饱和长链脂肪酸则会带来皂臭味等不良气味，从而影响产品的香气质量，应尽量减少其生成。不同来源的脂肪酶由于酶活性中心结构的差异，水解相同的甘油三酯所表现出的脂肪酸特异性也不相同。因此，筛选出合适的酶是获得纯正、浓郁奶味香基的前提。 由表2-5中可以看出，3种脂肪酶酶解物中脂肪酶RO的感官评价最好，其次是AN。这表明脂肪酶RO对乳脂肪的酶解能力较强，而且该酶酶解物各脂肪酶之间的比例协调，风味纯正浓郁。因此选择脂肪酶RO作为实验用酶进行后续实验。 在单因素实验的基础上，通过正交实验确定脂肪酶RO酶解稀奶油的最佳条件:E/S 0.20%、反应时间4h、反应温度40?、pH为6.75。在此优化工艺条件下，稀奶油的酶解反应较充分，脂肪酶RO的酶解产物风味较好。 参考文献 致谢