力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区谷氨酸含量及其受体nmdar活性的变化

力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区谷氨酸含量及其受体nmdar活性的变化 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区谷氨酸含量 及其受体nmdar活性的变化 南京体育学院 硕士学位论文 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区谷氨酸含量及其受体 NMDAR活性的变化 姓名:白宝丰 申请学位级别:硕士 专业:运动人体科学 指导教师:张蕴琨 20030610 南京体育学院硕士学位论文 摘 要 观察力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区递质性氨基酸 Glu Asp GABA Gly 含量 Glu/GABA 和Glu+Asp/GABA+Gly 比值 NR2A 蛋白含量 以 及自身酪氨酸磷酸化水平的动态变化 分析Glu Asp GABA Gly 之间以及与 中枢兴奋与抑制状态的关系 分析NR2A 蛋白含量与Glu Gly 含量及自身酪氨 酸磷酸化之间的相关性 从而为研究运动中兴奋信号的传递及探索运动性疲 劳的 中枢机制提供一些实验依据 方法 建立SD 大鼠一次性力竭跑台运动模型 用高效液相色谱法检测Glu Asp GABA 和Gly 含量 用抗NR2A 抗体和抗磷酸酪氨酸单抗以免疫沉淀法和 免疫印迹法检测皮质运动区NR2A 蛋白含量和酪氨酸磷酸化水平 结果 力竭运动后即刻 与安静值相比Glu 含量 NR2A 蛋白含量有所下降 但不明显 GABA Gly 含量明显升高 Asp 含量 Gly/GABA 和 Glu+Asp/GABA+Gly 比值显著性降低 恢复0.5 小时 Glu Asp Gly 含量有所 升高且显著性的高于安静值 且Glu Gly 含量达到最高点 GABA 含量有所下 降 NR2A 蛋白含量有所上升 恢复 1 小时 Glu 含量开始下降 Asp 含量和NR2A 蛋白含量在恢复 1 小时上升至最高点 GABA 含量略有上升 恢复3 小时 Glu Asp GABA 和Gly 含量和NR2A 蛋白含量下降到安静值水平 恢复 24 小时 NR2A 蛋白含量 Glu Asp GABA 和 Gly 含量都低于安静组 仅NR2A 蛋白 含量有显著性差异 Gly/GABA 和Glu+Asp/GABA+Gly 比值在恢复期逐渐上升 后者的变化较为平缓 各时相值都低于前者同时也低于安静值 NR2A 酪氨酸磷 在整个过程都高于安静值但无显著性 酸化水平在力竭运动后即刻上升至最高点 变化 结论 1 大鼠脑皮质运动区 Glu含量下降和GABA含量增高与运 动性疲劳 的中枢抑制过程有关 2 大鼠脑中Glu+Asp/GABA+Gly比值 的变化 反映运动 性疲劳时脑的机能状态 较Glu/GABA比值更有意义 3 大鼠在力竭即刻及恢 复期过程中 NR2A蛋白含量变化表现为 下降-上升-再下降 对Glu与Gly的 调 节反应具有滞后性 NR2A蛋白含量的下降是中枢抑制产生的一个因素 4 力 竭运动导致NR2A酪氨酸磷酸化发生了变化 有利于维持中枢的兴奋性 但是 第 4 页 南京体育学院硕士学位论文 NR2A酪氨酸磷酸化水平与Glu和NR2A蛋白含量的变化无显著性相关 提示 运 动过程中NR活性的调节可能是多方面原因造成的 5 力竭运动前后及恢复期 NR2A蛋白含量显著性的变化 但与酪氨酸磷酸化水平无显著性相关 且变化 不 同步 表明NR2A蛋白含量的变化具有较为敏感的可调控性 其变化的高低可 能 不足以反映NR的活性 关键词 力竭运动 递质性氨基酸 谷氨酸受体 第 5 页 南京体育学院硕士学位论文 Changes of Glutamic Acid Concentration and NMDA Receptor Activity in Motor Area of Rats Cortex Induced by Acute Exhausting Treadmill Running ABSTRACT center sports fatigue,high- acute exhaustion treadmill running. ,Asp lever, y, GABA lever after exhaustion, Glu lever , decreased. 1 hour after exhaust increased. 3 hour after exhaustion,Glu Gly . 24 hour after exhausion, ratio increased gradually after exhaustion and was low thancontrol. exhaustion, but had no signific course. atio , have a delay activity of NR. Bai Bao Feng Human Sports Science Key wordsExhausting running,Amino acid transmitter, 第 6 页 南京体育学院硕士学位论文 前言 人们对运动性疲劳的研究已有100多年的历史 众多专家学者对其做了大量 的工作 但是至今运动性疲劳产生的机制仍不清楚 根据疲劳产生的部位可将其 分为 中枢疲劳与外周疲劳 近年来随着脑科学的发展 中枢疲劳机制的研究也 随之成为一个热点 中枢兴奋与抑制的转换影响运动能力 与神经递质的变化直 接相关 其中氨基酸类 单胺类有着重要的作用 它们大致可分为兴奋性与抑制 谷氨酸 Glu与天冬氨酸 ASP等 后者包括 -氨基丁 性两种,前者包括 酸 GABA甘氨酸 Gly5-羟色胺 5-HT等 李人等人 1985研究发现 大鼠游泳9小时至疲劳时脑中GluGABA含量显著性增加 而GABA增加的幅度 认为长时间运动时脑中GABA变化与中枢抑制过程有关 Glu/GABA比 大于Glu 值变化是反映中枢疲劳的指标之一 张蕴琨等人 1999观察了长期游泳训练后 提出 训练对脑组织递质性氨基 小鼠脑组织递质性氨基酸和5-HT水平的变化 酸有重要影响 可一定程度提高脑组织神经活动的稳定性和对运动的适应性 5-HT可能是运动性中枢疲劳较为敏感的神经介质 张东明等人 2002用激光 诱导荧光检测的高效毛细管电泳结合微透析技术测定急性力竭运动前后大鼠下 丘脑区细胞外液中的递质性氨基酸的含量 实验结果表明 急性力竭运动后 4 小时 72小时大鼠下丘脑区的细胞外液中的GluGABAGly有统计意义的增加, 他们认为下丘脑递质性氨基酸在应激过程中很可能起着重要的作用 从以往的研究中发现脑中 Glu含量变化与运动性中枢疲劳产生有着密切的 联系 Glu是中枢神经系统中含量最高的兴奋性神经递质 它主要通过受体 活 化方式起兴奋介质的作用 其受体 GluRs分为两类 一类为离子型受体 包 括 N-甲基-D-天冬氨酸受体 NMDAR海人藻酸受体 KAR -氨基-3羟基-5 AMPAR它们与离子通道偶联 形成受体通道复合物 介 甲基-4异恶唑受体 导快信号传递 另一类属于代谢型受体 mGluRs 它与膜内 G-蛋白偶联 这些 脑内第二信使等组成的信号转导系统起作用 受体被激活后通过G-蛋白效应酶 产生较缓慢的生理反应 NMDAR NR 是一类离子型谷氨酸受体 由 NR 1 和 NR2 A-D 两类亚 基组成 其中NR 1 是NR 的功能亚基 NR2 是调节亚基 后者具有调节受体通 道动力学的作用 目前认为NR 被激活时可使受体上的离子通道迅速开启 主要 第 7 页 南京体育学院硕士学位论文 + 2+ + 是导致Na Ca 内流 K 外流 使突触后膜产生一个快速的兴奋性突触后电位 EPSP 这种效应对机体保持运动的连续和质量起着重要的作用 然而目前对 于NR 的研究多集中在脑疾病机制方面 张枕等人 2001 证明了NR 的持续过 度激活是缺血性脑损伤病理过程中的重要环节 张光毅等人 2002 发现NR 参 与介导脑缺血再灌注诱导大鼠海马P53 蛋白的丝氨酸磷酸化激活 提出 NMDA 受体P53 丝氨酸磷酸化激活信号通路可能参与脑缺血再灌注神经元损伤 NR 作为中枢神经系统中一类重要的兴奋性神经递质受体 其活性的改变影响机体中 枢的兴奋性 因此NR 活性的变化与运动能力的保持和运动性疲劳的产生有着密 目前国内外尚未发现相关研究报道 切的联系 为了从一个崭新的角度阐述运动性疲劳的中枢机制 我们利用先进的分子生 物学技术 免疫印迹法和免疫沉淀法 对力竭跑台运动前后及恢复期0.5h 1h 3h和24h大鼠脑皮质运动区NR 的调节亚基NR2A 蛋白含量和酪氨酸磷酸化水 平进行测定 同时利用高效液相色谱法 HPLC 测定相关氨基酸递质Glu Gly Asp 和 GABA 的含量 分析中枢兴奋性和抑制性转换时 NR 活性的变化 探讨 Glu 和NR 的协同激动剂Gly 含量与NR 活性变化的关系 本研究的创新之处是在国内外首次研究运动过程中 NR2A蛋白含量及其酪氨 酸磷酸化水平动态变化 并同时观察Glu 及相关递质含量变化 分析与NR 活性 的关系 这一视角弥补了以往仅靠分析神经递质含量变化而推测中枢机能状态的 为进一步探索运动性中枢疲劳机制提供了新思路 本研究采用免疫印 研究不足 迹法和免疫沉淀法 从分子亚基水平研究NR 的调节亚基NR2A 蛋白含量和酪氨 酸磷酸化水平的变化突破了以往运动人体科学领域宏观了解受体变化的局限性 将为以后受体研究打开了一个新的局面 深入地研究力竭运动及恢复期不同时相大鼠脑皮质运动区 本研究较为系统 中递质性氨基酸Glu 含量及其受体NR 的变化 旨在为进一步探索运动性疲 劳的 中枢机制和中枢机能评定提供一些新的实验依据和方法 也是探索运动疲劳时中 枢机能变化的一次有价值的尝试 以推动运动性疲劳机制研究的深入和发展 第 8 页 南京体育学院硕士学位论文 研究方法学介绍 1研究对象 1.1实验分组 30只雄性 SD大鼠随机均分为 6组 安静组 S 共 5只 适应动物跑台环境 不施加运动 力竭运动后即刻组 AE1 共 5只 处死前进行一次性力竭跑台运动 AE2 共 5只 处死前进行一次性力竭 力竭运动后恢复 0.5小时组 跑台运动后恢复 0.5小时 AE3 共 5只 处死前进行一次性力竭跑 力竭运动后恢复 1小时组 台运动后恢复 1小时 力竭运动后恢复 3小时组 AE4 共 5只 处死前进行一次性力竭跑 台运动后恢复 3小时 AE5 共 5只 处死前进行一次性力竭 力竭运动后恢复 24小时组 跑台运动后恢复 24小时 0 饲养条件为室内 自然光照 通风条件良好 温度 18~25C 自 由饮水 进食 1.2实验各组大鼠体重 表 1 表 1实验各组大鼠体重 X SD 单 位 克 S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 3.96 3.96 4.44 5.72 9.18 3.63 经 SPSS10.0软件作单因素方差分析 各组间没有显著性差异 第 9 页 南京体育学院硕士学位论文 2研究方法 2.1大鼠一次性力竭跑台运动速度的确定 分别从SAE1AE2组中随机取大鼠1只 体重分别为 270g250g273g 逐级递增负荷运动 在每级强度后 取大鼠尾血测定乳酸 HL含量 观察逐级 递增负荷运动时血乳酸变化 表2 图1 表2运动速度 时间及对应的血乳酸表 X SD 运动时间 运动速度 恢复时间 血乳酸浓度 min m/min min mM/L 0 0 3 20 8.8400 1.4476 6 25 9 30 12 35 6.2720 13.3050 5 10 15 9.2133 5.1625 第 10 页 南京体育学院硕士学位论文 图1运动及恢复时间对应的血乳酸含量 其中一只大鼠在运动时间为12 恢复时间为17的数值丢失 一只大鼠在恢 复时间为22的数值丢失 根据以上图表数据分析 我们采用30m/min作为力竭性运动的速度 2.2一次性力竭跑台运动 力竭运动及恢复组大鼠在PT-98型动物跑台上进行运动 速度为30m/min 以动物不能坚持负荷跑速 滞跑道后1/3处达3次以上 电 声 人为驱赶无效 10min 为力竭标准 2.3样品制备 受体粗提物制备 大鼠断头后快速取脑 分离皮质运动区 置液氮中冻存备用 以下操作 均在 冰水浴中进行 从液氮中取出脑皮质 加1ml的匀浆缓冲液 表12,用高速匀 浆器匀浆17800rpm10s2次 9000rpm离心10分钟 取上清液用Bradford 0 置-80C冰箱待用 法测蛋白后分装 第 11 页 南京体育学院硕士学位论文 皮质氨基酸组织制备 匀浆速度 将以上操作所得的部分皮质加入 10%的磺柳酸并匀浆 0 17800rpm时间 20秒 离心 4000rpm 5分钟 取上清 置-80C冰 箱待用 2.4指标检测 测定蛋白含量 Bradford法 .1材料 BSA0.15mmol/L NaCl考马斯亮蓝染料 0.5mg/mL牛血清白蛋白 溶液 .2步骤 分别在两组微量离心管中各加入 0.5mg/mL牛血清白蛋白 510 1520uL 以 0.15mmol/L NaCl补足至 100uL 同时以两管 100uL 的 0.15mmol/L NaCl作空白对照 每管各加入 1mL考马斯亮蓝染料溶液 振荡混匀 室温放置 2min 用 1cm光径的微量比色杯测 A 取 A 吸光值对标准蛋白浓度 595 595 作图 画出标准曲线 并测量待测样品的 A 从 BSA标准曲线中确 595 定待测样品的浓度 丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE .1材料 分离胶及浓缩胶溶液 表 3 表 4 电泳电极缓冲液 表 5 电泳装置 带平嘴针头的 25ul注射器 电泳仪 .2步骤 组装电泳装置 并放置在水平的桌面上 第 12 页 南京体育学院硕士学位论文 用巴斯德吸管立即将配好的分离胶液体沿夹层中一条垫片的边 至凝胶 11cm高为止 缘缓缓的加入到玻璃平板夹层中 用另一根巴斯德吸管立即加双蒸水于凝胶面 让凝胶在室 温 0 23C 聚合 30min左右 倾去顶层的水 并用电泳缓冲液冲洗凝胶顶部表面 后加入浓缩 胶直至离夹层顶部 1cm为止 将梳子插入夹层中的浓缩胶中 必要时 再补加浓缩胶液 让胶液在室温聚合 30~45min 待胶液完全凝后 去掉梳子 用电泳缓冲液冲洗加样孔 后用带平嘴针 头 往电泳槽中加入电泳缓冲液至淹没加样空为止 的 25ul注射器加待测蛋白于加样孔中 如果加样孔未能完全使用 必须将剩余孔加入蛋白 可以是废样 以防止样品蛋白向空孔扩散 连接电源 100V电泳 蛋白进入分离胶后 改 200V电泳直至指 示剂到达凝胶底部 电泳结束后 取出凝胶 分离所需部分 进行蛋白质的测定 AR2A蛋白含量的测定方法 免疫印迹法 Western blotting .1材料 预染色待测样品 预染色蛋白质分子量 转移缓冲液 表 6 无粉尘手套 海 绵垫 Whatman 3MM滤纸 0.45um硝酸纤维素膜 电转仪 软性铅笔 注 在整个方案中均使用重蒸去离子水 当进行接触滤纸 凝胶和膜的操作 时 应带手套 因为手上的油脂会阻断转印 .2步骤 SDS-PAGE电泳 电泳结束后 拆卸凝胶夹层 去除浓缩胶 以适量的转移缓冲液室温平 衡 凝胶30min 将转移盒放入一个较大的托盘中 加入能盖没整个转移盒的转移缓冲液 在塑料转移盒的底边 依次将下面物品组装至转印夹层中 海棉垫 预先 第 13 页 南京体育学院硕士学位论文 以转移缓冲液湿润如凝胶大小的滤纸 预先以转移缓冲液湿润的凝胶 凝胶朝向 用一玻璃棒在凝胶表面缓慢移动 以排去 滤纸的一面绝对应是凝胶的阴极面 凝胶和滤纸间的气泡 o 准备转印膜 按凝胶大小但各边都比凝胶大约1mm剪膜 成45的慢慢将凝 胶放入蒸馏水中 水将会渗进膜中并润湿整个表面 然后在转移缓冲液中平衡 10~15min 用转移缓冲液湿润凝胶表面 直接将已湿润的膜放在凝胶顶部 即阳极面 排去气泡 并置于膜的阳极面 排去所有气泡 在滤 湿润另一张 Whatman 3MM滤纸 纸的顶部放另一张海棉垫 将转移盒顶部的半面放置适当 扣紧 完成组装 往转移槽中加入转移缓冲液 按正确的极性方向将转移盒与电转 仪相连 连接电源 在冷却条件下100V电转3h 关电源 拆卸转移印装置 取出转印膜 并在膜上剪一小角标记定位 BSA封闭后加入1 3000稀释的抗NR2A抗体,4C过夜 用洗涤液洗膜 加入相应二抗 羊抗兔IgG-AP,37C反应2h洗膜 以NBT/BCIP显色 结果以图像处理仪处理 AR2A酪氨酸磷酸化的测定方法 免疫沉淀法 .1材料 免疫沉淀缓冲液 表7 Protein A Sepharose CL-4B抗NR2A抗体 抗磷酸 酪氨酸单抗 .2步骤 取蛋白样品200ug 加入SDS和DTT至终浓度分别为0.5%和1mmol/l 沸水 浴5min 加入400ul免疫沉淀缓冲液和适量抗NR2A抗体 4C旋转混匀 过夜 加入25ul Protein A Sepharose CL-4B, 4C旋转混匀2h 第 14 页 南京体育学院硕士学位论文 10000g离心 2min沉淀用免疫沉淀缓冲液洗3遍 混匀 沸水浴10 所得沉淀中加入5倍浓度的SDS-PAGE样品处理液 10ul min 7.5% SDS-PAGE分离 用抗磷酸酪氨酸单抗作免疫印迹分析 离心取上清 AspGABA和Gly测定 高效液相色谱法 HPLC .1原理: 样品去除蛋白后,稀释至合适的浓度,用邻苯二甲醛,巯基丙酸,氯甲酸芴甲 酯进行柱前衍生化,然后用 C18反相色谱柱进行分离 用已知浓度的氨基酸混 合标样定性及外标法定量测定样品中氨基酸的种类及其浓度 .2样品的前处理 脑样 3%NaOH 11 .3标准品 各氨基酸的混合对照品 HP公司提供 浓度为100pmol/l .4测试参数 色谱柱 hypevsil BDS 150*4.6mm,5m卡套柱 流动相 A相 20mM NaAc+0.3% THF 四氢呋喃 +0.02%三乙胺 PH 7.2 相 100mM NaAc,pH 7.2 :B 乙腈 甲醇 200350450 梯度 0--25minB 6--60% --28min26 B --100% 流速 1.0ml/min 40% 柱温 检测器 荧光检测器 EX 340nm, Em 450nm 进样量 1 L .5空白 标准品及样品色谱图 图2 图3 第 15 页 南京体育学院硕士学位论文 图2标准品和空白过柱色谱图 第 16 页 南京体育学院硕士学位论 文 图3标准品和样品色谱图 测定 乳酸自动分析仪 第 17 页 南京体育学院硕士学位论文 2.5主要试剂 溶液配制 .1主要试剂 第一抗体 抗NR2A: Anti-Glutamate-Receptor NMDAR2A Monoclonal 抗磷酸酪氨酸单抗: Anti-Phosphotyrosine Clone PT-66 第二抗体 Goat-anti-Rabbit IgG-AP 羊抗兔 羊抗鼠 Goat-anti-Mouse IgG-AP 抗体纯化剂:Protein A sepharose CL-4B 染色剂 NBT/BCIP 硝酸纤维素薄膜 .2主要溶液及配制 表3分离胶 分离胶 mL Tris1.5M PH8.9Acr+Bis30%SDS10% HO AP10% TEMED 2 8 8 0.32 0.016 表4浓缩胶 浓缩胶 mL Tris1.5M PH6.8Acr+BisSDS SucroseHO AP TEMED 2 3 1.59 0.12 3.6 3.69 表5电泳缓冲液 Electropherosis 400ml Gly 250mM 7.5g Tris 25mM 1.2g SDS 0.1% 0.4g 第 18 页 南京体育学院硕士学位论文 表6电转缓冲液 Transfer buffer 800ml Gly 190mM 11.5g Tris 25mM 2.4g SDS 0.05% 0.4g CHOH 20% 160ml 3 表7免疫沉淀缓冲液 Hepes羟乙基哌嗪乙磺酸 50mM 1.19g Nacl氯化钠 150 0.88 NaF氟化钠 50 0.21 Nappi 20 0.89 磷酸甘油 20 0.432 EDTA 1 1ml EGTA 1 1 Mgcl 1.5 1.5 2 Zncl 1 1 2 NaVO 1 1 3 4 Glycerot 10% 10 蛋白酶抑制剂100x 1 NP-40 0.5% TritonX-100 1% 第 19 页 南京体育学院硕士学位论文 表8染色底物缓冲液 Tris 100mM 1.21g Nacl 150mM 0.877g Mgcl 1mM 100ul 2 表9封闭缓冲液 Blocking buffer 100ml PH 7.5 BSA 3g Washing buffer 80ml 封闭用半血清 10ml 2% NaN 1ml 3 表10磷酸盐缓冲液 PBS 0.01M PH 7.4 1000ml 1X Nacl 137mM 8.006g Kcl 2.68mM 0.200g KHPO 1.47mM 0.200g 2 4 NaHPO12HO 8.1mM 2.901g 2 4 2 表11清洗缓冲液 Washing buffer 1000ml PH 7.5 1x Tris 10mM 1.21g Nacl 100mM 5.84g Tween-20 0.1% 1ml 第 20 页 南京体育学院硕士学位论文 表12匀浆缓冲液 MOPS 50mM 1.05g Kcl 100 0.75 NaF 50 0.21 Nappi 20 0.89 磷酸甘油 20 0.432 蔗糖 320 10.95 DTT 0.2 1 EDTA 1 1 EGTA 1 1 Mgcl 0.5 0.5 2 NaVO 1 1 3 4 蛋白酶抑制剂100x 1ml 剂及厂家 表13 表13主要试剂及厂家 试剂 公司 Monoclonal Anti-PhosphotyrosineSigma Clone PT-66 Anti-Glutamate-Receptor NMDAR2ASigma NaVO Sigma 3 4 Nappi Sigma 2-磷酸甘油 Sigma MOPS Amresco Sucrose Amresco DTT Amresco EDTA Amresco 第 21 页 南京体育学院硕士学位论文 EGTA Amresco PNPP Amresco PMSF Amresco Pepstatin A Amresco Leupeptin Amresco Aprotinin Amresco Benzamidine Amresco HEPES Amresco Glycerol Amresco NP-40 Amresco TritonX-100 Amresco BSA Amresco NaN Amresco 3 Tween-20 Amresco 考马斯亮蓝R-250 Amresco Protein A-agarose Santa Cruz Biotechnology Goat-anti-Rabbit IgG-AP Santa Cruz Biotechnology Goat-anti-Mouse IgG-AP Santa Cruz Biotechnology NC膜 NBT/BCIP promega 第 22 页 南京体育学院硕士学位论文 2.6主要仪器 表14 表14主要仪器及厂家 仪器 厂家 垂直式电泳槽 DYY3 北京六一仪器厂 电泳转移槽 77-1010-TB 美国 CLP公司 转移电泳仪 DYY-3-7B 北京六一仪器厂 高速匀浆器 Art-Miccro D-8 德国 Micrra-Art公司 凝胶图像分析系统 SYNGENE 英国Synoptics LTP TM 高效液相色谱仪 Water 600E高效液 美国Water公司 相色谱仪及电化学检测器 乳酸测试仪 YSI-1500美国黄石公司 TGL-16G冷冻高速离心机 上海安亭仪器厂 动物跑台 PT-66 杭州段氏制造 第 23 页 南京体育学院硕士学位论文 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区中递质性氨基酸含量 动态变化的研究 摘要 目的 研究力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区兴奋性神经递质 Glu Asp 抑制性神经递质GABA Gly 含量 Glu/GABA 和Glu+Asp/GABA+Gly 比值的动态变化 分析Glu Asp GABA Gly 之间以及 与中枢状态的关系 为 进一步探索运动性疲劳的中枢机制提供一些实验依据 方法 SD 大鼠进行一 次 性力竭跑台运动 高效液相色谱法检测Glu Asp GABA 和Gly 含量 结果 力竭运动后即刻 大鼠脑皮质运动区中Glu Asp 含量低于安静值 Asp 含量有 明显的变化 GABA 与 Gly 含量显著高于安静值 Gly/GABA 和 Glu+Asp/GABA+Gly 比值显著性降低 恢复 0.5 小时 Glu Asp 含量显著性的 高于安静值 在之后的恢复期 Glu 含量一直处于下降状态 Asp 含量在恢复 1 小时达到最高点 之后也逐渐下降 GABA 含量在恢复期一直处于下降状态 而 Gly 含量在恢复期 0.5 小时达到最高 之后逐渐下降 Glu/GABA 和 Glu+Asp/GABA+Gly 比值在恢复期逐渐上升 后者的变化较为平缓 各时相值都 低于前者同时也低于安静值 恢复 24 小时 以上各值与安静值相比无显著性差 异 结论 1 大鼠脑皮质运动区 Glu 含量的下降和GABA 含量的增高与运动 性疲劳的中枢抑制过程有关 2 大鼠脑皮质运动区 Gly 在力竭运动后即刻和运 动后0.5 1 小时保持较高的含量 同GABA 含量变化相比具有时相差异性 提 示 Gly 对中枢机能的调控存在复杂的机制 3观察大鼠脑中Glu+Asp/GABA+Gly 比值 反映运动性疲劳时脑的机能状态 较Glu/GABA 比值更有意义 关键词 力竭运动 递质性氨基酸 运动性疲劳 脑皮质尤其皮质运动区对人类和高等动物运动起着主要调控作 [1] 目前认为 长时间运动后 脑组织递质性氨基酸可发生改变 用 影响中枢的兴奋与抑制过程 是导致运动性中枢疲劳的可能机制之一 [3][4] 这些递质性氨基酸大致可分为兴奋性与抑制性两种,前者包括 谷氨酸 Glu 与天冬氨酸 ASP 等 后者包括 ?-氨基丁 酸 GABA 甘氨酸 Gly 等[ 1 ] [ 2 ] 因此研究脑皮质运动区中递质性氨基 酸的变 第 24 页 南京体育学院硕士学位论文 化有着重要的意义 力竭是运动性疲劳的一种外在表现 本研究旨在 观察力竭运动后大鼠脑皮质运动区兴奋性神经递质Glu Asp 抑制性神经递质 GABA Gly 含量的动态变化 分析Glu/GABA 与Glu+Asp/GABA+Gly 比值的变 为进一步揭示运动性疲劳的中枢机制提供实验依据 化 1材料与方法 1.1实验动物与分组 纯种SD 大鼠30 只 由南京安立默科技有限公司提供 随机分成6 组 S 安静对照组 N 5 AE1 力竭运动后即刻组 N 5 AE2 力竭运动后恢复0.5 小时组 N 5 AE3 力竭运动后恢复 1 小时组 N 5 AE4 力竭运动后恢复3 小时组 N 5 AE5 力竭运动后恢复24 小时组 N 5 0 饲养条件为室内 自然光照 通风条件良好 温度 18~25 C 所 有组大鼠自由饮水 进食 1.2实验方法 动即刻组与力竭运动后恢复各组大鼠在处死前进行一次 性力竭跑台运动 强度为 30 米/分钟 安静组大鼠不运动 仅适应跑台 环境 测定组织处理方法 断头处死大鼠 在冰面上快速分离脑皮质运动区 所取的皮质加 入 10%的冰磺柳酸并匀浆 匀浆速度 17800rpm 时间 20 秒 离心 0 4000rpm 5 分钟 取上清 置-80C 冰箱待用 GluAspGABA和 Gly浓度测定 高效液相法 HPLC 1.3数据处理 X SD 全部数据以平均数 标准差表示 用 SPSS10.0 软件做 第 25 页 南京体育学院硕士学位论文 单因素方差分析 2结果 2.1力竭运动前后大鼠脑皮质运动区GluAspGABA和Gly含量 的变化 表1 表 1 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu Asp GABA 和Gly 含量变化 X SD 单位 pmol/ul S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 10900.26 9714.64 12662.72 11981.65 11618.49 9256.82 Glu 1481.12 906.1492 1882.90* 1883.09 655.54 572.06 2935.44 2326.34 3767.64 3974.24 3326.61 2655.01 Asp 369.49 265.79* 332.67** 707.58** 227.84 378.19 1429.91 1815.35 1616.84 1649.56 1584.47 1138.68 GABA 301.62 305.66* 224.72 333.87 148.65 176.00 1287.26 1839.79 1974.32 1879.60 1646.52 1163.41 Gly 681.23 386.42* 260.31** 276.38* 174.67 128.02 *与S 组比较 * 0.05 ** P 0.01 与AE1 比较 0.05 P 0.0 1 P 0.001 与AE2 比较 P 0.01 P 0.001 与AE3 比较 P 0.05 P 0.01 P 0.001 与AE4 比较 P 0.05 第 26 页 南京体育学院硕士学位论文 图 1 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu 含量的变化 从表 1 可看出 力竭运动后即刻皮质运动区内 Glu 含量有所下降 恢复 0.5 小时 Glu 含量上升至最高 随着恢复时间的延长 Glu 含量逐 渐下降 但是依然显著性高于运动后即刻 恢复至 24 小时 Glu 含 量低于运动后即刻 与安静值相比无显著性差异 图2 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Asp 含量的变化 从表 1 可看出 力竭运动后即刻皮质运动区内 Asp 含量显著性的 第 27 页 南京体育学院硕士学位论文 下降 恢复 1 小时 Asp 含量上升至最高 随着恢复时间的延长 Asp 24 小时与安静值相比无显著性差异 含量快速下降 图3 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区GABA 含量的变化 从表 1 可看出 力竭运动后即刻皮质运动区内 GABA 含量显著性上升至最 高 随后逐渐下降 至24 小时 低于安静值 但无显著性差异 图4 力竭运动后大鼠脑皮质运动区Gly 含量的变化 第 28 页 南京体育学院硕士学位论文 从表 1 可看出 力竭运动后Gly 含量逐渐上升 恢复至0.5 小时达到最高 随后逐渐下降 24 小时 Gly 含量与安静值相比无显著性差异 2.2力竭运动前后大鼠脑皮质运动区 Glu/GABA和 Glu+Asp/ GABA+Gly比值的变化 表2 表2 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu/GABA 和 Glu+Asp / GABA+Gly 比值的变化 X SD 单位 pmol/ul S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 7.80 1.26 5.43 7.94 7.34 7.36 8.23 Glu/GABA 0.78** 1.43 0.63 0.52 0.86 Glu+Asp / 5.65 2.11 3.34 4.60 4.52 4.65 5.22 GABA+Gly 0.45** 0.55 0.10 0.39 0.49 *与S 组比较 **P 0.01 与AE1 组比较 P 0.05 P 0.01 P 0.001 图5 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu/GABA 比值的变化 第 29 页 南京体育学院硕士学位论文 从表2 可看出 皮质运动区中Glu/GABA 比值在力竭运动后即刻明显 降低 说明中枢处于抑制状态 在恢复期 比值显著性升高 24 小时达到最高 与 安 静值相比无显著差异 图6 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区 Glu+Asp / GABA+Gly 比值的变化 从表2 可看出 力竭运动后即刻Glu+Asp / GABA+Gly 比值显著性的降 低 在恢复期 比值逐渐升高至安静状态 3讨论 AspGABAGly含量动态 3.1力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu 变化 目前认为 运动性疲劳的产生 可根据部位的不同划分为中枢疲劳与外 周疲 劳 而运动性疲劳的特点及运动性疲劳产生的机理 与运动项目的类型及运动负 荷等因素有关 长时间中等强度运动产生的疲劳 往往与中枢神经系统出现保护 [3][4][5] 性抑制有关 即中枢性疲劳的产生是大脑皮层保护性抑制发展的结果 根 据巴蒲洛夫学派的观点 这种保护性抑制与脑组织中某些氨基酸类神经递质的含 量变化有关 第 30 页 南京体育学院硕士学位论文 脑组织递质性氨基酸可分为两类 一类为兴奋性氨基酸递质 包括 Glu 和 Asp 对神经元起兴奋作用 另一类为抑制性氨基酸递质 包括 GABA Gly 等 [2] 对神经元起抑制作用 运动性疲劳 时这种平衡 以上两类递质在正常生理情况下代谢处于相对平衡 将被打破 因此通过分析以上递质的变化可以了解中枢的机能状态 动前后大鼠脑皮质运动区GluAsp含量动态变化 Glu 和Asp 是中枢神经系统中最为重要的两种内源性氨基酸 尤其是 Glu 是哺乳动物脑内含量最高的一种氨基酸 Glu 广泛分布于中枢神经系统中 以大脑皮层含量最高 其次为小脑 纹状 体 延髓和脑桥 脊髓中 Glu 含量虽明显低于脑内 但是有特异分布 背根浓 度比腹根高 背根灰质含量比腹根灰质高 因此认为 Glu 是初级传入纤维的兴 奋性递质 Asp 在中枢的分布也很广泛 以小脑 丘脑和下丘脑含量较高 大脑皮层 纹状体含量较低 脊髓含量低于脑内 但分布与Glu 不同 背根浓度与腹根浓度 大致相等 腹部灰质含量比背部灰质高 因而认为 Asp 是中间神经元的兴奋性 递质 Glu 和Asp 都属非必需氨基酸 且都不能透过血脑屏障 因此 不能通过血 液由周围组织供给脑 而是由葡萄糖和其他一些前体物质在脑中合成 这两种氨 基酸可来自葡萄糖经三羧酸循环产生a-酮戊二酸和草酰乙酸 a-酮戊二酸可通过 转氨酶作用或经谷氨酸脱氢酶作用的逆反应 还原加氨基生成Glu 草酰乙酸可 通过转氨酶作用产生Asp 终止内源性Glu 和Asp 兴奋作用的主要机制是重新摄 取 本实验发现 力竭运动后即刻 大鼠脑皮质运动区中Glu Asp 含量低于安 静值 Glu 和Asp 是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质 它们含量的下降说 明中枢兴奋性降低 原因可能是机体在过度疲劳状态下产生的抑制性保护 这种 [6][7] 保护措施可以弱化兴奋性神经递质大量增高对神经元产生的毒害作用 而且 可以防止运动过程中机体代谢产物对中枢正常机能的影响 研究发现 血乳酸升 高 直接刺激毛细血管壁 一旦毛细血管壁通透性发生改变 其周围理化环境的 第 31 页 南京体育学院硕士学位论文 平衡将被破坏 直接影响其周围神经胶质细胞的转运功能 进而影响神经元的兴 [8] 氨干扰脑的能量代谢 脑组织解氨毒需消耗过多的还原型辅酶 NADH 奋性 ATP 被大量消耗 进一步影响中枢能量供应 从而使得中枢神经系统不能维持正 力竭运动使大鼠脑组织自由基代谢加强 自由基可影响神经细胞膜 常兴奋活动 [9] 正常活动 导致神经元功能失调 李人观察了未训练大鼠游泳 1 小时 2 小时 5 小时 9 小时后大脑皮层中Glu 含量的变化 发现运动后以上各组Glu 含量都 [3] 高于安静组 且运动 1 9 小时后 Glu 含量显著性高于安静组 本研究结果与 前者不符 可能是大鼠承受的运动负荷有差异 从而造成到达力竭时间不同的原 长时间力竭运动可使大鼠脑皮质中的毛细血管和其周围的神经细胞 神经胶 因 [8] 质细胞超微结构发生明显的变化 从而导致Glu 的大量释放 曹健民等人发现 大鼠缺血期海马Glu 和Asp 骤然增高 50 倍和 30 倍[10] 我们采用的运动强度使 大鼠在短时间 大鼠力竭时间 21.80 11.69 达到了力竭 这种应激可能并没 有造成大鼠脑组织的损伤 因此Glu Asp 含量低于安静值 可见力竭运动时间 的长短与Glu Asp 含量高低的变化呈一定的正变关系 在恢复期 Glu Asp 含 量出现双反向的变化 恢复0.5 小时 Glu Asp 含量显著性的高于安静值 P 0.05 P 0.01 和力竭运动后即刻值 P 0.05 原因可能是大鼠中枢神经系统为了尽 快恢复正常的兴奋状态而大量的释放Glu 和Asp Glu 含量在此时达到最高点 而Asp 含量继续上升 1 小时后达到最高点 可能是由于Glu 是初级传入纤维 [2] 的兴奋性递质 而Asp 是中间神经元的兴奋性递质 它们对信号的传导有时间 和空间的先后 从而造成两者含量变化具有时相差异性 恢复3 小时 由于神经 元对Glu 和Asp 的再摄取速度的加快 它们的含量与安静值相比无显著性差异 此时中枢神经系统处于兴奋和抑制平衡 恢复24 小时 Glu 和Asp 含量虽有进 说明此时大鼠中枢兴奋性已恢复到安 一步的下降但是与安静值相比无明显差异 静状态 动前后大鼠脑皮质运动区GABA和Gly含量动态变化 GABA 和Gly 是脑内两个最重要的抑制性氨基酸递质 中枢神经中的抑制活 动50%是由GABA 与Gly 类神经递质传递的 因而抑制性氨基酸递质在调节运 动员的兴奋状态 协调运动中枢的功能活动发挥极大的作用 第 32 页 南京体育学院硕士学位论文 GABA 主要分布于中枢神经系统中 周围神经和其他组织中很少 GABA 但是脑内各部位含量差别很大 在黑质和苍白球含量最高 下 在脑内含量很高 丘脑次之 GABA 由Glu 经谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧而成 目前认为 GABA - + 对脑的抑制性作用主要是引起突触后抑制 通过改变神经细胞膜对 Cl K 的通 - + 透性 造成Cl 内流 K 外流 而形成突触后膜超极化 实现抑制效应 Gly 是结构最简单的氨基酸 广泛存在于体内各组织中 Gly 在神经 系统中 [2][11] 以脊髓含量最高 是脊髓和脑干中的抑制性神经递质 中枢神经系统中的 Gly 可在线粒体内合成 合成的途径很多 其中之一为 丝氨酸经丝氨酸羟甲 基 转移酶催化生成 Gly Gly 的主要功能是 对感觉和运动进行抑制性调控 对 NMDAR 起调节作用[2] 本实验发现 GABA 与 Gly 含量在力竭运动后即刻显著高于安静值 而 GABA 含量达到最高点 原因可能是运动时 ATP 浓度下降 氧化酶活性受到 抑制 GABA 清除过程减弱 在脑细胞中浓度升高 很多学者发现训练可以防止 一次性运动后 GABA 含量的升高[3][12] 从而有利于维持中枢兴奋状态 恢复期 0.5 小时 GABA 含量处于下降状态 与安静值相比无显著性差异 而Gly 含量 达到最高 且显著的高于安静值 两者含量变化出现了时相差异性 原因可能 在 于 Gly 的功能不仅体现在对感觉和运动进行抑制性调控 而且对中枢兴奋性受 体NMDAR 起调节作用[2] NMDAR 的激活需要 Gly 和 Glu 的协同激动 在本 研究中发现 Glu 含量在恢复期0.5 小时也达到最高 Gly 含量在运动后0.5 小时 达到最高 有利于维持中枢的兴奋性 恢复 1 小时 GABA 有略微的升高 Gly 含量虽有所下降 但是依然显著的高于安静值 从实验数据中可以看出 Gly 在 运动后即刻和恢复期0.5 1 小时都保持高含量 说明 Gly 保持高浓度对中枢 的调控可能发挥重要作用 大鼠恢复3 24 小时 GABA 和Gly 含量都低于安静 但无显著性差异 可能是由于机体中枢神经系统趋于稳定性的表现 但是 值 Dongming zhang 等人发现急性力竭运动后4 小时大鼠视下丘中Gly GABA 含量 显著性升高 运动后 72 小时 Gly GABA 含量依然显著性升高[13] 也许 Gly GABA 的释放由多种因素调节 或者说Gly GABA 的释放具有延迟性 具体原 因有待于进一步的研究 第 33 页 南京体育学院硕士学位论文 3.2力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu/GABA和 比值变化 目前认为 脑中 GABA 的含量与中枢疲劳有着密切的联系 而 GABA 由 Glu 经谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧而成 因此 测定脑组织中Glu GABA 含量 比较Glu/GABA 比值 是评定脑神经元兴奋或抑制的指标之一[3][4][12] 而中枢的 兴奋性和抑制性氨基酸递质还分别包括 Asp 和 Gly 因此我们同时观察了 Glu/GABA 和Glu+Asp/GABA+Gly 比值的变化 本研究发现在整个的运动及恢复过程中 Glu+Asp/GABA+Gly 比值变化 趋势 与 Glu/GABA 比值有较高的相似性 力竭运动后即刻两比值都显著性的低 于安 静值 P 0.01 共同说明了此时中枢处于抑制状态 恢复0.5 1 3 24 小时 两者都保持上升的趋势 与安静值相比无明显差异 但是两比值表现出一定的差 异性 Glu+Asp/GABA+Gly 比值变化较为平缓 各个时相的比值都低于 Glu/GABA Glu/GABA 比值在恢复期0.5 小时 24 小时两个时相点高于安静值 说明中枢在恢复过程中积极的调整应激状态 而恢复期各时相 Glu+Asp/GABA+Gly 比值都低于安静值 说明在恢复期大鼠中枢可能一直处于抑 制状态 中枢兴奋性和抑制性调节是通过众多神经递质共同完成的 因此观察 Glu+Asp/GABA+Gly 比值 反映运动性疲劳时脑的机能状态有更大的意义 4结论 4.1大鼠脑皮质运动区 Glu 含量的下降和GABA 含量的增高与运动性疲劳 的中枢抑制过程有关 4.2大鼠脑皮质运动区Gly 在力竭运动即刻和运动后0.5 1 小时保持较高 的含量 而且与 GABA 含量变化出现了时相差异性 提示 Gly 对中枢机 能调控存在复杂的机制 4.3观察大鼠脑中Glu+Asp/GABA+Gly 比值 反映运动性疲劳时脑的机能 状态 较Glu/GABA 比值更有意义 第 34 页 南京体育学院硕士学位论文 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区谷氨酸受体 NMDAR2A 的变化 摘要 目的 研究力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区 NR2A 蛋白含量和 Glu Gly 含量的变化 以及酪氨酸磷酸化水平变化 分析NR2A 蛋白含量与Glu Gly 含量及自身酪氨酸磷酸化之间的相关性 从而为研究兴奋信号在运动中的传 递机理以及运动性疲劳的中枢机制供一些实验依据 方法 SD 大鼠进行一次性 力竭跑台运动 用抗 NR2A 抗体和抗磷酸酪氨酸单抗以免疫沉淀法和免疫印迹 法检测皮质运动区 NR2A 蛋白含量和酪氨酸磷酸化水平 用高效液相色谱法检 测Glu 和Gly 含量 结果表明 完成力竭运动后即刻Glu 含量有所下降 而Gly 含量显著性的升高 NR2A 蛋白含量下降不明显 恢复0.5 小时 Glu 与Gly 含 量显著性的升高 两者协同调节受体NR NR2A 在此过程中也保持了上升的趋 势 恢复到 1 小时 机体加快了对Glu 与Gly 重摄取的速度 Glu 和Gly 的含量 出现下降的趋势 Glu 含量略高于安静值 而Gly 含量却依然显著的高于安静值 NR2A 蛋白含量达到最高点 恢复3 小时 NR2A 蛋白含量 Glu 和Gly 含量下 降到安静值水平 说明中枢系统的兴奋性恢复到安静状态 恢复到24 小时 NR2A 蛋白含量 Gly 和 Glu 含量都低于安静组 仅 NR2A 蛋白含量有显著性差异 NR2A 酪氨酸磷酸化水平在整个过程中无显著性变化 结论 1 力竭运动前后 及恢复期 NR2A 蛋白含量有显著性的变化 但与酪氨酸磷酸化水平无显著性相 关 且变化不同步 表明 NR2A 蛋白含量的变化具有较为敏感的可调控性 其 变化的高低可能不足以反映NR 的活性 2 大鼠在力竭即刻及恢复期过程中 NR2A 蛋白含量变化表现为 下降-上升-再下降 对Glu 与Gly 的调节反应具有 滞后性 NR2A 蛋白含量的下降是中枢抑制产生的一个因素 3 力竭运动导致 NR2A 酪氨酸磷酸化发生了变化 有利于维持中枢的兴奋性 但是NR2A 酪氨酸 磷酸化水平与 Glu 和 NR2A 蛋白含量的变化无显著性相关 提示 运动过程中 NR 活性的调节可能是多方面原因造成的 关键词 力竭运动 酪氨酸磷酸化 兴奋性信号 N-甲基-D-天冬氨酸受体 NMDAR 即NR 是神经系统中重要的兴奋性神经 递质谷氨酸 Glu 受体 它在机体的学习 记忆 神经元发育可塑性等方面起 第 35 页 南京体育学院硕士学位论文 着重要的作用 作为NR 的调节亚基 NR2A 可以通过自身可逆磷酸化改变受 体 [1] 的活性 从而在神经元活动中扮演着重要的角色 目前运动过程中NR 活性如 何变化还未见相关报道 而中枢兴奋性的变化对运动能力有着重要的影响 因此 研究运动时NR 活性的变化对改善和提高运动能力有着重要的意义 本研究旨在观察大鼠力竭运动后及恢复期脑皮质运动区 Glu Gly 含量 以 及NR 调节亚基NR2A 蛋白含量和自身酪氨酸磷酸化水平的变化 间接反映NR 活性为探索兴奋信号在运动中的传递机理以及运动性中枢疲劳的分子机制提供 一些实验依据 1材料与方法 1.1实验动物与分组 纯种SD 大鼠30 只 由南京安立默科技有限公司提供 随机分成6 组 S 安静对照组 N 5 AE1 力竭运动后即刻组 N 5 AE2 力竭运动后恢复0.5 小时组 N 5 AE3 力竭运动后恢复 1 小时组 N 5 AE4 力竭运动后恢复3 小时组 N 5 AE5 力竭运动后恢复24 小时组 N 5 0 饲养条件为室内 自然光照 通风条件良好 温度 18~25 C 所 有组大鼠自由饮水 进食 1.2实验方法 型建立 力竭运动即刻组与力竭运动后恢复各组大鼠在处死前进行一次 性力竭跑台运动 强度为 30 米/分钟 安静组大鼠不运动 仅适应跑台 环境 第 36 页 南京体育学院硕士学位论文 皮质氨基酸样品制备 在冰面上快速分离脑皮质运动区 所取的皮质加 断头处死大鼠 入 10%的冰磺柳酸并匀浆 匀浆速度 17800rpm 时间 20 秒 离心 0 4000rpm 5 分钟 取上清 置-80C 冰箱待用 受体粗提物制备 各组大鼠完成运动后 按照分组情况分别处死 安静组大鼠处死 大鼠断头后快速取脑 分离皮质运动区置液氮中冻存备用 以下 时间无限制 操作均在冰水浴中进行 从液氮中取出脑皮质 加1ml的匀浆缓冲液,用 高速匀 0 浆器匀浆 10s2次 9000rpm离心10分钟 取上清液测蛋白后分装 置-80C 冰箱待用 测 .1 Glu Gly含量测定 高效液相法 HPLC .2NMDAR2A蛋白含量的测定方法 免疫印迹法 Western blotting 等量蛋白样品经 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 分离后 以 湿转法电转移至NC 膜上 转移后的NC 膜经3%BSA 封闭后加入1 3000 稀释 的抗NR2A 抗体,4oC 过夜 用洗涤液洗膜 加入相应二抗 羊抗兔IgG-AP ,37oC 反应2h 洗膜 以NBT/BCIP 显色 结果以全自动凝胶图像处理仪处理 .3NMDAR2A酪氨酸磷酸化的测定方法 免疫沉淀法 取等量蛋白样品 加入SDS 和DTT 至终浓度分别为0.5%和 1mmol/l 沸水 浴5min 加入400ul 免疫沉淀缓冲液 4oC 过夜 加入适量抗NR2A 抗体 4oC 过夜 再加入25ul Protein A Sepharose CL-4B, 4oC 轻轻摇动2h 10000g 离心 2min 沉淀用免疫沉淀缓冲液洗3 遍 加入2.5 SDS-PAGE 样品处理液 沸水浴 10 min 离心取上清 7.5% SDS-PAGE 分离 用抗磷酸酪氨酸单抗作免疫印迹分 析 第 37 页 南京体育学院硕士学位论文 理 标准差表示 各组间的显著性检验用 全部数据以平均数 SPSS10.0 软件做单因素方差分析 2结果 2.1力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区GluGly含量的变化 表 1 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区Glu Gly 含量的变化 X SD 单位 pmol/ul S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 10900.26 9714.64 12662.72 11981.65 11618.49 9256.82 1481.12 906.1492 1882.90* 1883.09 655.54 572.06 Glu 1287.26 1839.79 1974.32 1879.60 1646.52 1163.41 Gly 681.23 386.42* 260.31** 276.38* 174.67 128.02 *与S 比较 *P 0.05 与AE1 比较 P 0.05 P 0.0 1 P 0.001 与AE2 比较 P 0.01 与AE3 比较 P 0.001 与AE4 比较 P 0.05 第 38 页 南京体育学院硕士学位论文 图 1 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Glu 含量的变化 从表 1 图 1 可看出 力竭运动后即刻皮质运动区内 Glu 含量有 所下降 恢复 0.5 小时 Glu 含量上升至最高 随着恢复时间的延长 Glu 含量逐渐下降 但是依然显著性高于运动后即刻 恢复至 24 小 时 Glu 含量低于运动后即刻 与安静值相比无显著性差异 图2 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区Gly 含量的变化 第 39 页 南京体育学院硕士学位论文 从表 1 图2 可看出 力竭运动后Gly 含量逐渐上升 恢复至0.5 小时达到 最高 随后逐渐下降 24 小时 Gly 含量与安静值相比无显著性差异 2.2力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区NMDAR2A蛋白含量变化 表2 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区NMDAR2A 蛋白含量的变化 X SD S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 100.00 89.22 112.20 144.84 97.52 27.85 49.37 0.00 16.83 15.09 52.67* 20.16** *与S 组比较 *P 0.05 ** P 0.01 与AE1 组比较 P 0.05 P 0.0 1 与AE2 比较 P 0.01 与AE3 组比较 P 0.05 P 0.001 与AE4 组比较 P 0.05 NMDAR2A 蛋白含量变化免疫印迹电转图谱 从左至右依次为AE5 AE4 AE3 AE2 AE1 S 第 40 页 南京体育学院硕士学位论文 图3 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区NMDAR2A 蛋白含量的变化 从表2 图3 可看出 与安静组相比运动后即刻大鼠脑皮质中NR2A 蛋白含 量有所下降 但是没有显著性变化 在恢复期 NR2A 蛋白含量有所升高 运动 后恢复1小时大鼠脑皮质中NR2A 蛋白含量显著性升高 与安静组比较 P 0.05 与运动后即刻组相比 P 0.01 大鼠恢复 1 小时之后NR2A 蛋白含量开始下降 运动后恢复24 小时大鼠脑皮质中NR2A 蛋白含量显著性低于安静组和运动 后即 刻组 P 0.01 2.3力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区NMDAR2A酪氨磷酸化的 变化 表 3 力竭运动前后及恢复期大鼠脑皮质运动区 NMDAR2A 酪氨磷酸化 水平 的变化 X SD S AE1 AE2 AE3 AE4 AE5 100.00 214.00 141.80 121.87 138.08 178.37 0.00 21.86 63.99 60.32 50.03 62.18 第 41 页 南京体育学院硕士学位论文 NMDAR2A 酪氨磷