CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的研究(可编辑)

CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对瘢 痕疙瘩成纤维细胞影响的研究 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对 瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的研究医学 学科门类 外科学整形 学科、专业 瘢痕的基础研究 研究方向 二七级 年 级 赵明权 研究生姓名 张刚教授 汤少明教授 导师姓名 .~ . 起止日期 广东医学院附属医院整形研究所 二?年五月学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果,也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或 证书所使用过的材料。 日期: 作者签名:翅鲥扭 丛&:占。兰 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果,知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师,离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时,署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文,可以公布包括刊登论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注:保密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签名: 日期: 导师签名: 日期:目 录 中文摘要.前言??..?..?. 月吾??..??.?. 第一部分基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达水平的测定材料与方法? 结果?.. 讨论?..: 小结?.. 第二部分.重组质粒的构建?. 材料与方法.. 结果?.. 讨论?.. ,、结?.. 第三部分 表达载体的筛选. 材料与方法.. 结果?。 讨论?.. 小结?.. 第四部分对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物活性的影响 材料与方法。 结果?.. 讨论?.. ,、结?。 全文总结??. 创亲斤点?. 参考文献 文献综述基因的研究进展??. 附录一缩写词中英文对照表按字母顺序? 附录二课题说明? 附录三攻读硕士学位期间发表论文??... 致谢...........?....??.................??.....?.?.??...基因在瘢痕 疙瘩成纤维中的表达其对瘢痕疙 瘩成纤维细胞影响的研究 中文摘要 研究背景 瘢痕疙瘩是整形外科常见疾病之一,也是尚未解决的问题之一,治疗效果多 年来没有显著的提高。瘢痕疙瘩的发生具有明显的个体差异和家族倾向,生物学 特性十分复杂,其根本形成机制迄今尚未清楚,是整形外科重要的基础研究之一。 大量的遗传流行病学研究和分子遗传学研究均表明瘢痕疙瘩的形成与相关遗传 基因的表达异常具有非常密切的关系。既往研究显示,号染色体的短臂木端汇 集了许多与细胞生长,增殖,分化相关的基因,已有大量报道在许多肿瘤中该区 存在缺失,其缺失频率位于%%之间。寻找相关调控基因在瘢痕疙瘩发病 机制中的作用己成为当前瘢痕疙瘩研究的热点之一【。因此深入研究以期从基因 水平阐明瘢痕疙瘩的发病机制,筛选出瘢痕疙瘩形成或抑制的相关调控基因,为 瘢痕疙瘩发病机理研究和指导临床有效的预防与治疗提供线索和依据,具有十分 显著的现实意义。 基因是编码蛋白激酶家族中的一员。蛋白激酶家 族成员众所周知调控真核细胞周期的要素。基因与基因紧密相 邻,在同一染色体相同区域上【捌。这个基因位点包括基因, 基因及金属蛋白酶/,构成一个大的重复基因组两个相同串联连接区域 的一部分。基因和基因在神经母细胞瘤与扩增的基因 表现为很高的缺失率或者变异率。在细胞凋亡中,基因编码的蛋白激 酶能够被切割开和被修饰而发挥作用【.?。基因的几个可选择的 剪接变体已经被。基因在维持细胞的细胞周期控制,凋亡,神经生 理学,分化和转录过程中具有重要的功能,通过抑制基因活性来达到 研究基因在瘢痕疙瘩形成中的作用已成为瘢痕疙瘩基因研究的热剧】。 目前研究认为基因表达种蛋白和,其中最重要的部分是 蛋白,对基因发挥其功能是必不可少的,它也可以作为基因活性抑制剂的天 然靶位【 。靶向常用的方法有干扰、反义核苷 酸技术封闭、锤头状核酶切割等。其中小干扰更是在哺乳动物细胞 中显示了强大的、有效的干扰能力,因而化学合成的.核昔酸的 或质粒表达的小发夹被常规用于基因沉默研究。科研人员利用脂质 体介导的细胞内表达技术,该在体内再被加工为,这种方 式有可能导致有效的、长期的基因沉默。表达的质粒载体正被广泛用于 抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病的研究。 脂质体最常用于体外细胞的转染, 以 后又被用做基因体内导入的载体。脂质体可以与形成复合物,保护 不被核酸酶降解,与细胞膜结合后形成内吞小体,把释放到细胞浆。脂质 体由脂质双分子层组成的封闭囊泡,无毒和无免疫原性,因此成为基因治疗、 ?分子递送的重要工具,广泛受到学者的青睐。 国外研究基因时,所选的对象是肿瘤患者或实验动物,没有发现 在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是,分析,基因芯片检 测技术,分子杂交技术,单链构象多态性分析,比较基因组杂交。国内虽然有 研 究基因在瘢痕疙瘩中的作用,所采用的技术是比较基因组杂交技术 ,变性高效液相色谱法结合测序筛选和鉴定,但由于研究时涉及到多个 基因的作用及相互作用,不能体现其中一个基因在瘢痕疙瘩中的作用。鉴于 上述 原因,本课题选择利用基因治疗策略及方法来研究单个相关基因在 瘢痕疙瘩发病机制所起的作用及其意义。 研究目的 构建重组质粒,利用脂 我们运用// 质体转染来沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞中的基因表达,以观察基因 对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的影响,为研究基因在瘢痕疙瘩中的作用 提供可靠的依据和有效的手段。 研究方法 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达水平的测定 通过.检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞中 基因的表达水平。 重组质粒的构建 穿梭质粒的构建 利用公司的靶序列分析软件设计 靶序列,再根据设计原则,选择针对 的的序列.,.,.位碱基作为特 异性斟靶序列。化学合成寡核苷酸和它的互补链,退火、连接到 / ,构建重组穿梭 线性化的// 质粒.。插入序列采用和酶切和测序的方法来证实。 的阴性和阳性对照寡核营酸被用来构建.,.,,构 建方法同。该质粒也用酶切和测序的方法证实。 筛选有效的干扰质粒 通过检测所构建的重组质粒对基因的抑制效率,从而选择 干扰效果较好的重组质粒为实验的干扰靶点进行下游研究。 》 重组质粒沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因 用重组质粒和对照.,.质粒,脂质体 法测定 转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,同时设立对照。绘制生长曲线、 基因的蛋白变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。 研究结果 通过检测 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达水平明显升高,是人 正常皮肤成纤维细胞中表达水平的.倍。 经酶切和测序鉴定证明 .成功插入到表达质粒中,成功构建了个 表达质粒。 通过.鉴定证明 水 .干扰效率为.%,能够有效降低 平,.和.抑制效率非常低,几乎没有抑制效率,从而 选择.为试验的干扰靶点进行研究。 结果显示 一..质粒组较脂质体组,.对照组和未 转染的空白细胞组生长速度有明显差异,差异有统计学意胙.。 法测定基因的蛋白变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,与 质粒对照组、.质粒对照组、脂质体对照组和空 白对照组相比,...质粒组蛋白表达水平相应 下降较明显,细胞凋亡数目增加有明显的差异,差异有统计学意义.。 结论 以上实验结果表明,基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达 水平明显升高,是人下常皮肤成纤维细胞中表达水平的.倍。 .可以高效、特异地抑制基因表达,抑制瘢痕疙瘩成纤维细 胞基因的活性,体外研究显示基因具有促进瘢痕疙瘩成纤维 细胞生长作用。.重组质粒在瘢痕疙瘩基因治疗方面具有潜在的应用 价值。迄今为止,应用体外连接方法构建重组质粒载体沉默瘢痕疙瘩成纤 维细胞的基因尚未见类似报道。 关键词 人基因;干扰;小干扰;脂质体:瘢痕疙瘩 . , . , . , . .,,? . %~%.,., . . ,,, . /, , .. . . , . , ,, .., , , .,,, , . ,.. , , ., ,? , . . , , . ,, ,, . ,. , ,., , ’ :, ’ . , . // ,, . . . ,, .// 一 .. . . .一,, , , ,, . .. .. , .%,. ? , ,, .. .... . .?? ,,. , ..; ; ;; ;;. 基因在瘢痕疙瘩成纤维中的表达其对 瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的研究 .?‘??。 刖 吾 瘢痕疙瘩是以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的皮肤胶原性疾病,是 整形外科常见的疾病之一,也是最棘手解决的问题之一。瘢痕疙瘩的发生具 有明 显的个体差异和家族倾向。大部分疤痕疙瘩通常发生在局部损伤年内,包括外 科手术、撕裂伤、文身、烧伤、注射、动物咬伤、接种粉刺及异物反应等,许多 患者的原发病史可能被忘记。瘢痕疙瘩的临床表现差异很大,一般表现为高出周 围正常皮肤的,超出原损伤部位的持续性生长的肿块,扪之较硬、弹性差、局部 痒或痛,早期表现呈粉红色或紫红色,晚期多呈苍白色,有时有过度色素沉着, 与周围正常的皮肤有明显的界限。病变范围大小不一,从.厘米丘疹样到大如 手掌的片状。其形态呈多样性,可以是较为平坦,有规则边缘的对称性突起,也 可以是不平坦的,具有不规则突起的高低不平的团块,有时像蟹足样向周围组织 浸润生长又称“蟹足肿’’。其表面为萎缩的表皮,但耳垂内疤痕疙瘩的表皮可 以接近正常皮肤。大多数病例为单发,少数病例呈多发性。瘢痕疙瘩在损伤后几 周内迅速发展,可以持续性连续生长,也可以在相当长一段时期内处于稳定状态。 病变内可因残存的毛囊腺体而产生炎症坏死,或因中央部缺血而导致液性坏 死。 瘢痕疙瘩一般不发生挛缩,除少数关节部位病变引起轻微活动受限外,一般不引 起功能障碍。瘢痕疙瘩一般不能自行退化,偶有报道病变在绝经期后退化,其退 化与病程,部位,病因或症状无关。瘢痕疙瘩有好发部位,多见于有色人种,不 发生退行性变化,单纯手术切除后易复发,必须辅以电子线照射等综合治疗,但 治疗效果在近十年中没有显著的提高。瘢痕疙瘩的恶变曾有报道,但发生率很低, 又有良性真皮肿瘤之称。瘢痕疙瘩发病机制的研究是整形外科最重要的基础研 究,寻找相关调控基因在瘢痕疙瘩发病机制中的作用已成为当前瘢痕疙瘩研究的 热点之一。因此深入研究以期从基因水平阐明瘢痕疙瘩的发病机制,筛选出瘢痕 疙瘩形成或抑制的相关调控基因,为瘢痕疙瘩发病机理研究和指导临床有效的预 防与治疗提供线索和依据,具有十分显著的现实意义。 瘢痕疙瘩的生物学特性十分复杂,尽管国内外学者从组织、细胞和分子水平 上,对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和分化活性异常、细胞外基质过度沉积的病 理机 理不断进行探讨,也了解到瘢痕的过度增生涉及炎症、免疫、生长因子和某些基 因的变化,,但是其根本形成机制迄今尚未清楚,治疗方面尚无突破性进展【】。 大量的遗传流行病学研究和分子遗传学研究均表明,瘢痕疙瘩的形成与遗传具有 非常密切的关系。其中遗传学方面的研究已经成为该学科研究的最新热点【。近 年来通过分子生物学研究表明,病理性瘢痕的形成可能是由于成纤维细胞胶原合 成不成比例增加所致,这种胶原合成的增加并非由于细胞数量的增加,而是因为 单个细胞胶原失控,导致这种失控的原因是由于胶原的转录的增加,而 胶原转录的增加则可能与控制其转录的有关基因缺失、增加或突变有关。许多研 究也显示,瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成的原因可能与基因的结 构异常及功能异常有关】。既往研究显示,号染色体的短臂术端汇集了许参 与细胞生长,增殖,分化相关的基因,已有大量报道在许多肿瘤中该区存在缺失, 其缺失频率位于%%之间。本课题组张刚等【在国际上首次将比较基因组 技术应用于病理性瘢痕研究,构建病理性瘢痕染色体变异频率图谱,显 示.%、号.%、号.%、号.%染色体 拷贝数高频率缺失。蒋军健等根据筛查结果,选取具有代表性的杂合予: 和纯合子样本进行基因序列分析发现例患者的瘢痕组织样本中,有 例发现基因突变,突变率为.%。发现个位点,其 中例患者的第位碱基缺失、例患者的第位碱基的的插入突变。 瘢痕疙瘩组织中基因片断的突变呈多态性,为多位点、多类型 基因突变,经检验确切概率法,.,检验表明两者之间差异显著,可 以认为它与瘢痕疙瘩的发病有关系;有例发现基因:突变, 突变率为.%。发现个位点,为第位碱基的/的颠换突变。瘢痕 疙瘩组织中基因片断的突变呈多态性。经:检验确切概率 法,.,检验表明两者之间差异无统计学意义尸.,可以认为它与 瘢痕疙瘩的发病并无关系。近年来研究发现,几乎所有的肿瘤都有基因水平 的变 异,通常为癌基因的激活或者抑癌基因的失活。等【用聚合酶链反应.单链构 象多态性和测序的方法检测瘢痕疙瘩组织及其培养的成纤 维细胞, 发现例瘢痕疙瘩患者的基因均发生突变。等【】的研究发 现所有瘢痕疙瘩组织中均有表达,与不同主要以细胞膜表面方式分布于 瘢痕疙瘩中央部,认为这种瘢痕疙瘩老化区细胞显形发生的变化可阻止其发 生恶 性变。等【】研究发现在、染色体上存在瘢痕疙瘩的敏感位点, 对其进行微卫星分析并发现侯选基因。等【】的研究还表明,在瘢痕疙瘩 的发病机制中,其分子机制与增生性瘢痕不同。 基因是编码蛋白激酶家族中的一员。蛋白激酶家 族成员众所周知调控真核细胞周期的要素。基因与基因紧密相 邻,在同一染色体相同区域上【】。这个基因位点包括基因, 基因及金属蛋白酶/,构成一个大的重复基因组两个相同串联连接区域 的一部分。基因和基因在神经母细胞瘤与扩增的基因 表现为很高的缺失率或者变异率【】。在细胞凋亡中,基因编码的蛋白激 酶能够被切割开和被修饰而发挥作用【.。基因的几个可选择的 剪接变体已经被报告。基因是在维持细胞的细胞周期控制,凋亡,神经 生理学,分化和转录过程中具有重要的功能,通过抑制基因活性来达 到研究基因在瘢痕疙瘩形成中的作用已成为瘢痕疙瘩基因研究的热点 ,其中最重要的部分 【。目前研究认为基因表达种蛋白和 是蛋白,对基因发挥其功能是必不可少的,它也可以作为 基因活性抑制剂的天然靶位【。目前一种简单的、有效的代替基因敲除. 的技术一干扰. ,技术,正在异军突起,成 为靶向基因的有力武器。靶向常用的方法有干扰、反义 核苷酸技术封闭、锤头状核酶切割等。其中小干扰更是在哺乳动物 细胞中显示了强大的、有效的干扰能力,因而化学合成的.核苷酸的 或质粒表达的小发夹被常规用于基因沉默研究。科研人员利 用脂质体介导的细胞内表达技术,该在体内再被加工为, 这种方式有可能导致有效的、长期的基因沉默。表达的脂质体载体正被 脂质体最常用于体外细胞的 广泛用于抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病的研究。 转染,以后又被用做基因体内导入的载体。脂质体可以与形成复合物,保 护不被核酸酶降解,与细胞膜结合后形成内吞小体,把释放到细胞 浆。脂质体由脂质双分子层组成的封闭囊泡,无毒和无免疫原性,因此成为基 因 治疗、分子递送的重要工具,广泛受到学者的青睐。 和美国科学促进会将 技术列为年度最重大的十大科 学成就之首,杂志也将该项技术评为年度最重要的科技发现之一, 并在一连续四年列入十大科技进步成果之一【。首次在上 也因此而获得年的诺贝尔生理学 报道该现象的的 和 或医学奖【。是保留在植物和哺乳动物细胞中的古老而天然的转录后基因 ,机制。干涉的确切机制并 沉默 未完全明了 是通过一段导致同源降解从而使目的基因失表 达。目前的研究表明过程分步进行,其具体过程如下:通过 细胞膜进入细胞内,在胞浆内的作用下,加入的小分子被切割为. 核苷酸,长的小分子干扰片段 ,瓷 至双链与一个核酶复合物结合形成所谓的诱导的沉默复合 体. ,,复合体分子量大约为,一般 认为它可能包括核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶和同源搜索酶等;?在 供能的情况下,与结合的解链成单链,引导寻找靶 的同源区进行特异性结合,并在距离’端个碱基的位置切割,之 从而有效地沉默了靶基因、抑靶基因蛋白或多肽的合成【五。致基因 沉默具有特异性一个单点突变可以使沉默效果消失殆尽、通用性能靶向 任何基因和高效性每个细胞只需要几个分子就能引起强烈的效 应,大部分研究中,基因沉默效率超过%。尽管它的作用机制仍不清楚,但 这项技术正不断完善,并被广泛的应用在基因功能研究、微生物学研究、基 因治 疗等研究领域。 目前,取得了令人鼓舞的成就。多家药品公司已经启动了他们研发的 产品的后期临床床研究】。这些公司是:美国默克公司:、 制药公司、公司、瑞士的诺华:和美国的以及 已进入期临床研 公司。总部在美国迈阿密公司的 究,也是截止到目前唯一进入期临床的?药物。适应症是老龄视力丧失,这是 发达国家致盲的最常见原因。是经化学修饰的。靶向血管 表皮生长因子受体.,减少与老年黄斑变性 ,的类药物。相关的病理性血管的生长最新临 床报告表明。能够减缓患者眼睛中血管的生长并改善视力,持续效果 达数月,且没有明显的不良反应。制药公司研制的,就是一种作用 于内皮血管生长因子 ,的,已经 于年月获准开展人体临床试验,从而成为首个进入临床研究阶段、用于 治疗的类药物。美国的公司的.正在进行期 临床研究,该药是利用技术治疗呼吸道合胞病毒 ,感染。.作用于衣壳的基因,该药成为首个申请 临床实验的、病毒靶向的治疗药物。美国默克的 进入期临床 研究.适应症同样是老龄视力丧失。公司则紧随其后,该公司研制的 同样也是作用于的,也于年启动了期临床试验。 大量在体外和体内应用的研究证实了的潜在基因治疗效果,如 艾滋病、 流感、病毒性肝炎、帕金森、肌萎缩性脊髓侧索硬化、癌症、风 湿 性关节炎、型糖尿病等都取得了令人鼓舞的成果。等发现 可以特异性地沉默基因,从而抑制肺癌细胞的增殖。.在乳 腺癌的研究中起很重要的作用,通过降低.细胞中.蛋白的表 达水平,可以抑制肿瘤细胞体内体外的增长,暗示了通过抑制过表达基因 如.而达到治疗乳腺癌的可能性?。 用于疾病基因治疗取得了令人瞩目的成果,我们也希望利用该项技术, 沉默基因,以达到抑制基因活性、检测在瘢痕疙 瘩成纤维细胞中、蛋白表达,探讨在瘢痕疙瘩发生、发展及预 后中的可能作用。通过我们的研究,以期为瘢痕疙瘩的临床治疗提供一个新 靶点 和新思路。 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中 第一部分 表达水平的测定 基因表达水平的检测方法主要有二方面:核酸水平:可以运用 方法检测目的基因是否转录,转录量是否减少。蛋白水平:检测目的基因基 因的蛋白产物是否减少,可以运用 或者细胞免疫化学法,也可以在 目的基因前后连接一个标记蛋白如,运用蛋白的荧光强度间接测出目 的基因的表达量。为反转录 和实时 共同的缩写。反转录是将反转录 和结合起来建立的一种技术。首先进行反转录,然后进行常规 的反应。?是目前灵敏度最高的检测方法。目『常用的 检测方法有原位杂交、点杂交印迹杂交及核酸酶保护试验等,这些方法 的普遍缺点是难以检测低丰度的,且操作繁琐。将反转录和 结合起来的则可克服上述诸多困难。运用可检测单个细胞少于 个拷贝的特异的。实时属于定量的一种,以一定时间内 的增幅量为基础进行的定量分析。实时就是在反应过程中 对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。实时的定量使用萤光。 色素。实时与反转录相结合,能用微量的来找出特定时间、 细胞、组织内的特别表达的遗传基因,该法精确度高,结果明确,能进行 高通量检测,操作容易。这两种的组合又被称之为“定量 。 也称免疫印迹它是根据抗原抗体结 合的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白。“印迹”是指蛋白质从凝胶转 移到膜 上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白, 并能对蛋白进行定性和半定量分析。免疫印迹的主要操作过程分为三个步骤:. 蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离.将分离的蛋白转印印迹到印 记膜通常是硝酸纤维素膜或膜.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫 学检测。化学发光检测法是最灵敏的检测法,底物在酶的催化下被氧化,释放的 光子通过胶片曝光。无论使用那种底物,信号的强度与印迹膜上抗原的丰度 成正比。鉴于是目前灵敏度最高的检测方法,且特异性强,操作简单等特点,具有其它方法不可替代的特点,因此我们在实验时选择其作为检测 基因表达水平的方法。 材料与方法 实验材料 .主要试剂百奥迈科生物技术有限公司 试剂盒 试剂盒 百奥迈科生物技术有限公司 . 公司 转染试剂 公司 培养基 公司 胎牛血清 百奥迈科生物技术有限公司 胰蛋白酶 公司产品 其它:孔培养板、孔培养板、培养皿、细胞培养瓶、细 胞培养瓶和离心管均为公司产品。 .细胞 人瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞由本研究所保存。 .试剂的配制 ..细胞培养所需试剂的配制 配制: ., .,‘ ., ., 加三蒸水溶解后,调节值至.,加三蒸水定容至。用前 倍稀释,高压灭菌, 保存。于中,定容至,用直径.滤 膜过滤后分装,.?保存; .%胰酶消化液.取胰酶干粉,.,溶于中,定 容至,用直径.滤膜过滤后分装,.。保存。其使用浓度为 ./。 .. 所需试剂的配制 ,加入超纯水,剧烈震荡至 .%处理水:取 完全与水互溶,定容至,高压次以灭活,。保存; 水,混匀,.?保存。 %无乙醇:取无水乙醇,加 .仪器 ? 扩增仪 公司 公司 二氧化碳孵箱 型计 公司 公司 倒置荧光显微镜系统 磁力搅拌器 其林贝尔仪器制造公司公司 漩涡混合器 上海医科大学仪器厂 实验方法 构建过程主要分为步:瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常成纤维细胞培养; 提取和用进行检测。 . 引物的设计 利用网站上的引物设计软件设计基因引物序列,由百奥迈科 生物技术有限公司合成,经纯化。引物设计如表一: 表一引物信息 .瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常成纤维细胞培养 ..细胞复苏 从液氮中取出细胞,快速于 的水浴中水浴左右,使其融化; 向细胞培养瓶内加含%的培养基; 在超净台内将冻存管中的细胞吸入培养瓶中; 将瓶盖旋松/圈,,%恒温培养箱中培养。 .。细胞换液 当细胞生长一段时间,培养基内成分减少时,离心除去上清,另加适量含% 的培养基; 将瓶盖旋松/圈, ,%恒温培养箱中培养。 ..细胞传代 贴壁细胞采用胰蛋白酶的方法传代:?倒去上清?少许润洗次?加 入适量胰蛋白酶,浸润瓶底全部细胞后倒出,放入培养箱消化.分 钟,至所有细胞变圆,露出细胞间隙为止?加入少量培养基中止反应,将 消化下来的细胞用滴管吹打均匀至单个?将消化下来的细胞分瓶后补足培 养基。 将瓶盖旋松/圈, ,%恒温培养箱中培养。 . 检测 ..细胞培养 取倍增期的两细胞,消化后同时铺板,以./,种细胞于孔培 养板中,每孔。 %培养箱中培养,每隔更换含%的 培养液一次。 ..抽提总 细胞密度达%时,提取总。 用冷的洗涤细胞数次,离心去上清后,加入 试剂进行裂解。 室温下放置 ,使得核酸蛋白复合物完全分离。 离心 ,然后小心吸取上清液,移入新的离心管中。 , 向上述步骤得到的匀浆液中加入. 氯仿每使用 加.,得浑浊液,无分层现象, 室温静置 氯仿,盖紧管盖,用手上下振荡 ? 。 。离心后,样品分为三层:无色上清水相、中间蛋 ,。离心 白层及下层有机相,水相的体积约为所用试剂的%。小心吸取无色 上清液至另一离心管。 加. 加入. 异丙醇每使用 异丙醇,轻轻混匀,室温 。 静置离心 。弃去上清,加 %乙醇每使用 , 试剂至少加 %醇,涡旋振荡混匀。 。弃尽上清,超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥不 ,离心 可太干,否则将会难以溶解,加入适量.溶解沉淀可 在.促溶 。 .. ... .按表二反应体系进行 表二.反应体系 .斗 .肛 ’: . ’:... 按表三反应程序进行 表三.反应程序 结 果 .检测结果 首先,分别求出个重复样品基因和基因平均值后, 应用参照基因对组样品和组样品进行校正:组维 基因.?.., ?..。然后, 基因. 对组样品和组样品的?进行归一化:。组,.。组, 一.....。??‘。‘。?鼬..。因此,组样品的表达水平是 组样品的.倍。此结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基 因相对于校准样本,用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样品组织量 的差 异。为了更直观的表示样品间的表达差异,最后我们将计算得到的相对量用 图表 来表示,如图所示: 图 与的比较表四结果 。 通过检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞中 基因的表达水平,基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达 水平明显升高,是人正常皮肤成纤维细胞中表达水平的.倍。荧光 定量实验,基因的熔解峰和熔解曲线如图,所示,的 熔解峰和熔解曲线如图,所示: 图 的熔解峰 图 的熔解曲线 一响。一岫,????,?? :??吧 妥 越 》 ’:、? 心.. 。:一 ~》 .、 邂 ’~~、 ’.、? 心 ,. ‘驽 ? 、 .彩 ;纩 畦 ???? ???一 图的熔解峰 图 的熔解曲线 ?一蚋???”哪? 缓 惑 盟 、 、、\一 蕊 蠢 譬? 、 & 鞋 岛 醪 一 一?一 ‖寥笋 矿 矽 讨论 瘢痕疙瘩是整形外科常见的病之一,其根本形成机制迄今尚未清楚。目前的 研究表明瘢痕疙瘩的形成与相关基因的表达异常有关。基因是一种真核 生物细胞中普遍存在的、多功能的一种信使依赖性精氨酸/丝氨酸结构域蛋 白, 在前剪接中起作用,在维持细胞的细胞周期控制,凋亡,神经生理学, 分化和转录过程中具有重要的功能。基因在不同的组织细胞中具有不同 的表达水平,如在非霍奇金淋巴瘤,小孩窦房结,成神经细胞瘤和淋巴瘤,黑 色 素瘤,子宫内膜癌,乳腺导管内癌,恶心黑色素瘤发生缺失;在乳腺癌,淋巴 瘤, 成神经细胞瘤和黑色素瘤的水平表达减少;在心肺分流术和心脏停博手 术前后的比例为;。鉴于基因在不同的组织细胞中的表达 水平不同和目前的研究未阐明基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情 况,因此设计此实验来检验基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况。 基因表达水平的检测方法主要有二方面:核酸水平,可以运用. 方法检测目的基因或者病毒全长是否转录,转录量是否减少。蛋白水平,检 测目的基因基因的蛋白产物是否减少,可以运用 或者细胞免疫化学 法,也可以在目的基因前后连接一个标记蛋白如,运用蛋白的荧光强 度间接测出目的基因的表达量。鉴于是目前灵敏度最高的检测方 法,且特异性强,操作简单等特点,具有其它方法不可替代的特点,因此我们 在 实验时选择其作为检测基因的方法。 通过检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞中 基因的表达水平,基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达 水平明显升高,是人正常皮肤成纤维细胞中表达水平的.倍。 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达水平升高,产生的蛋白就会增高,表明 基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的活性增强,可能是促进瘢痕疙瘩形成的 原因之一。 小 结 本研究采用实时荧光定量.的方法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正 常皮肤成纤维细胞中基因的表达水平,基因在瘢痕疙 瘩成纤维细胞中的表达水平明显升高,是人正常皮肤成纤维细胞中 表达水平的.倍。第二部分.重组质粒的构建 的制备方法主要有五种:直接化学合成,根据设计好的序 列进行化学合成】;以 为模版,通过体外转录合成 利用或消化长片段制备前种方法主要都是 体外制备,并且需要专门的转染试剂将转到细胞内。 启动子如人源和鼠源 表达载体,多数的表达载体依赖 的和人源,操纵一段小的发夹 ,在哺乳动 物细胞中的表达,在细胞内再被切割发夹部位,形成。之 所以采用 启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 ,而且它是通过添加一串.个来终止转录的。要使用这类载体,需要 合成段编码短发夹序列的单链,经退火后克隆到质粒或病毒载体 启动子下游。质粒由于在转染试剂的作用下,具有高效率转染细胞和转 的 染效果较稳定等优势,更频繁地被用于基因沉默的研究。表达框架法, 通过介导的表达试剂盒获取。基于的表达框架, 启动子,一段发 它是一种由得到的表达模版,包括一个 终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需 夹结构,一个 事前克隆到载体中【?。 对的质粒载体来说,由于导入的退火链只有几十个碱基,因此 克隆容量不再是选择载体的限制因素,而对细胞的亲嗜性、或载体整合或不 整合 系统是一 的特性成为选择的关键因素。// 个特别高效的表达系统,其宿主范围广包括以前认为难于感染的淋巴细胞、对 人致病性低不整合入宿主基因组、在增殖和非增殖细胞中均能较高效转染,可 以使用荧光标记来优化转染条件,用流式细胞仪或者荧光共聚焦显 微镜即可检测标记的等优点,广泛受到学者的青睐,成为基因治疗的重 要工具。脂质体己被常规用于介导的合成。表达盒由和 组成,中间由相连,可以克服内源性依赖的干扰素 途径的非特异抑制作用.质粒的基因组成有多种,最简单的组成形式是 /启动子驱动的合成。我们用的是// 系统,该系统是在 .转录单位上游增加报告基因表达盒,可 以有效追踪质粒转染的宿主细胞是否发生基因沉默现象。该系统应用是在靶向 的表达盒的上游插入 驱动的表达,共表达绿色 荧光蛋白和。 材料与方法 实验材料 .主要试剂 .. 试剂盒// ..提供 / ,阴性 未线性化的// 对照// ,阳性对照// ,退火缓冲液;其中,穿梭质粒// 图大小为,含驱动转录的启动子 和卡那霉素抗性基因,并具有和酶切位点,该质粒还具有新霉素 抗性,还包含 酶切位点,以及两个反向末端重复序歹, 。 ..其它 公司 公司 公司 连接酶公司 / 公司 离心管 公司产品 琼脂糖 公司 卡那霉素 公司上海闪晶分子生物研究所公司 公司公司 公司 胰蛋白胨 酵母提取物 公司 .菌株和载体 大肠杆菌由司秀文同学赠送。 .试剂的配制 ..细菌培养所需试剂的配制 选择性液体培养基:取胰蛋白胨.,酵母提取物., .,加 三蒸水搅拌溶解,定容至。?高压灭菌,冷却到? 左右加入卡那霉素至终浓度/,保存。 卡那霉素贮存液/:取卡那霉素,加超纯水,用直径. 滤膜过滤后分装,.?保存。 选择性固体培养基:取胰蛋白胨.,酵母提取物., .,琼 脂粉.,加三蒸水搅拌溶解,定容至。?高压灭菌, 冷却至?左右加入至终浓度/,摇匀后铺板,室温放置凝固, 倒置。保存。 加超纯水定容至,用直径为 溶液./:称取. .的滤膜过滤后,。保存。 液体培养基:取胰蛋白胨,酵母提取物., ,加三蒸 水搅拌溶解,用/的调至.,定容至,?高压蒸 汽灭菌,保存。 ..其它所需试剂的配制 ./的 电泳缓冲液:取.碱,.冰醋酸,.,加超纯水,完全溶解后定容至。。保存,使用 前: 稀释。 .仪器 上海医科大学仪器厂 漩涡混合器 . ... 凝胶成像系统 . ... 电泳仪 微量加样器 公司 低温离心机 . ... 台式恒温水浴摇床 微量台式离心机 . 扩增仪 . 电子分析天平 梅特勒.托利公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 振荡培养箱 电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司 微波炉 广东格兰仕企业集团公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 洁净工作台 数显电热培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 试验原理 干扰现象是由与靶基因序列同源的双链引发的广泛存在生物体内 的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核酸酶家族成员之一的 特异性的核酸酶将裂解成由.个核苷酸组成的小干扰 ,随后?作为介导子引起特异性地降解相同序列的,从而阻断 相应基因表达的转录基因沉默机,如图。 图载体图谱 洲胼肿? 图 斟原理示意图 ? ;奄蓄‖ 唧? 舢岫咖 一 掣 帅.? 窟后 。、,../蚤施;? ?黜 紫色为正义段,蓝色为反义段,绿色为目标信使对峪, 触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶水平,达到干扰目的实验方法 构建过程主要分为步:构建靶向的穿梭质粒; 将退火成双链的的寡核苷酸与/线性化的// 连接;构建的重组质粒的酶切和 测序鉴定。 . 重组质粒一的构建 .. 寡核苷酸的设计 利用 公司靶序列分析软件设计靶序列,再根据 设计原则,选择针对 的的序列 .,.,.位碱基作为特异性靶 序列。模板中的结构选用了以避免形成终止信号, 的转录终止序列采用结构。正义链模板的’端添加了,与 酶切后形成的粘端互补;反义链模板的’端添加了,与酶切后形 成的粘端互补;如果的第一个碱基不是,则在后补加一个。 斟序列由上海生物工程公司合成,经纯化。 . .一 .岍. :. 盯玎 . :.:气 . .. .. :. 几. :. . . .. . 一 :.’ :. . : ’. ’ .’ : ’.不 .’ .: ’. 几 .’ : ’. .’ ..核苷酸链的退火 缓冲液重悬合成的寡核营酸单链,终浓度为?,即的引物加灭 菌双蒸水; 按:比例将互补的寡核营酸单链混合,上、下游链各取置于新的管 中,退火后形成的寡核昔酸双链终浓度为 假设%退火互补,退 火反应体系见表四; 将管放到仪中, : :然 后将管置于冰上。 已退火的寡核昔酸双链可直接连接至/线性化的 上,剩下的的寡核普酸双链可以保存在 // 中备用。 表五退火反应体系 ? ? .. //载体的线性化 取 //载体,按照表五体系进行酶切处理: 表六酶切反应体系仃// 嵋。酶切小时,琼脂糖电泳,使用 回收,紫外分光光度计检测其浓度,稀释浓度至 /。 琼脂糖凝胶电泳主要步骤如下: 取.琼脂糖粉末,放到一锥形瓶中,加入×能电泳缓冲液至。 然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液; 取有机玻璃制胶板槽,有透明胶带沿胶槽四周封严,并滴加少量的胶液封好 胶带与胶槽之间的缝隙; 水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至?左右的胶液, 使之形成均匀水平的胶面; 待胶凝固后,小心拔起梳子,撕下透明胶带,使加样孔端置阴极段放进电泳 槽内; 在槽内加入电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面; 把待检测的样品和 ?,按以下量在洁净载 玻片上小心混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中:加样缓冲液 待测样品/ ..液 / 接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节稳压输出,以/的电压进行 电泳,点样端放阴极端; 观察溴酚兰的带蓝色的移动,当其移动至距胶板前沿约处停止电泳; 染色:把胶槽取出,小心滑出胶块,水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上, 放进溶液中进行染色,完全浸泡 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把已染 色的凝胶放在上面。关上样品室夕,打不紫外灯,通过观察孔进行观察。 从琼脂糖凝胶中回收片段主要步骤如下: 柱平衡步骤:向吸附柱中吸附柱放入收集管中加入平衡液 ,离心分钟,倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管中; 将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中,称取重 量为.总重.管空重:....; 向胶块中加入 溶液,?水浴放置分钟左右,其问不断温和地 上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解; 将上一步所得溶液加入一个吸附柱中吸附柱放入收集管中, 离心分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中; 向吸附柱中加入 漂洗液使用前已加入无水乙醇,, 离心分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中; 向吸附柱中加入 离心分钟,倒掉收集 漂洗液,,管中的废液; 将吸附柱放入收集管中,, 离心分钟,尽量除去漂洗液。将 吸附柱置于室温放置分钟,彻底晾干; 将吸附柱放入一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加洗 脱缓冲液,洗脱缓冲液应置于。水浴预热,室温放置分钟, , 离心分钟,收集溶液; 重复步骤。 线性化质粒样品的浓度测定主要步骤如下: 彻底清洗石英比色杯; 将线性化质粒样品加入浓度为三蒸水,混匀后加入比色杯; 用浓度为三蒸水作空白对照; 把样品和三蒸水分别放入分光光度计比色槽中,用三蒸水在处调零, 然后读取样品的相应数值,即; 将波长调至处,先用三蒸水调,然后读取样品的相应数值,即; 样品值的比值/。 纯净的的值的比值为... 样品浓度样品稀释倍数/单位/ 含量二浓度溶解体积单位 .. //?载体的构建 ; 取上述退火的寡核普酸双链?,加水至 ,使终浓度为 专用管,依次加入各种连接反应试剂,反应体系如表六; 取. 表七连接反应体系 // / 将上述试剂充分混合后室温孵育,如果不能立即转化应把连接产物 保存于.。 ..大肠杆菌感受态细胞的制备 感受态细胞的制备参照《分子克隆》的法进行,主要步骤如下: 将大肠杆菌从甘油保种管接种至不含抗生素的平板上,?过夜, 以复苏细菌; 挑取单菌落,接种于 培养液中,振荡培养过夜,取.菌 转种于 培养液中,?剧烈振荡培养.; , 将菌液冰浴 ,分装于离心管中,转/分,离心 弃上清液,控干,每管加预冷的./.重悬细菌沉淀; 再次冰浴, ,离心 弃去上清液,控干,每管加预冷的:.重悬细菌沉淀,充分混匀, 保存或立即用于转化。 .. //.重组质粒的转化 接产物转化感受态细胞,主要步骤如下: 取连接产物和感受态细胞 管中,同时 放置于灭菌的. 放置于另一管中作为转化实验的阴性对照; 只取 将各管置于冰上 ,每隔几分钟轻弹一次混匀; ?水浴; 冰上放置: ?, ; 振摇 取 /卡那霉素,用棒将其均匀涂布于含/ 转化细菌和 卡那霉素的平板,置。孵箱培养过夜。将靶向的阳性重组质粒命名为 .。