毕业设计（论文）_烟梗脱氯有机肥发酵

毕业设计（论文）_烟梗脱氯有机肥发酵 摘要 本文以烟梗为原料，运用了正交试验进行脱氯得出:温度25、浸泡时间12h、溶剂量1:15以上 、烟梗粗细度过16目筛是烟梗脱氯的最佳条件。运用生物发酵的原理，采用自制发酵装置发酵有机肥，并结合物理、化学、生物学分析法检测分析发酵中物料理化性质和细菌动态变化。通过实验得出添加发酵菌剂可以缩短发酵周期，有利物料腐熟。发酵温度经历了升温期、高温期、降温期和稳定期，高温期和稳定期持续时间长;含水率呈整体下降趋势;PH成整体上升趋势;细菌数量先升后降。用BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪和药敏实验来鉴定细菌种属，得出主要优势菌为枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、产碱菌属某种。 关键词:烟梗;脱氯;发酵菌剂;有机肥 Abstract In this paper, tobacco stems as raw material, using the orthogonal experiment method to take off chlorine analysis, what this paper concludes as the best dechloridtion conditions is that when the temperature was 25, soaking time was 12h, solvent quantity was above 1/15 and the tobacco stems demand of rough was by sieve of 16 meshes. Using home-made fermentation device, the changes of physical and chemical properties, and bio-related properties were detected and analysis by physical, chemical, biological analysis methods in the fermentation process, based on the fermentation principle. We find that adding fermenting agent decreased the fermentation period which is beneficial to decomposition of organic materials according to the experiment. The fermentation temperature experienced four phase, that is heating phase , high temperature persist cooling phases and stationary phase, among the four phase the second and forth phase last long. Water rates were downward trend in the overall, and PH was upward trend in the overall. The amounts of bacteria were increased first and then decreased. The BD PHOENIX 100 automatic microbial analyzer and Antimicrobial susceptibility test says that the main advantage bacterium is Bacillus subtilis , Bacillus thuringiensis and Alcaligenes spp. words: Tobacco stem; Dechloridation; Fermentation inoculum ; Organic fertilizer Key II 目录 1.引言 ........................................................................................................................................... 1 1.1烟梗及其利用现状的综述 ............................................................................................... 1 1.2发酵菌剂在废料发酵有机肥过程中的研究现状 ........................................................... 2 1.3研究的目的与意义 ........................................................................................................... 3 1.4研究的内容与方法 ........................................................................................................... 4 2.烟梗脱氯有机肥发酵........................................................................................................... 5 2.1试验材料 ........................................................................................................................... 5 2.2试验内容 ........................................................................................................................... 5 2.2.1烟梗脱氯预处理.......................................................................................................... 5 2.2.2发酵步骤 .................................................................................................................... 7 2.2.3数据处理与分析方法................................................................................................... 83.结果与分析 ............................................................................................................................. 9 3.1发酵过程中物料的感官变化 ........................................................................................... 9 3.2发酵过程温度的变化 ....................................................................................................... 9 3.3发酵过程中含水率的变化与控制 ..................................................................................11 3.4发酵过程中PH变化 ...................................................................................................... 12 3.5烟梗发酵有机肥中细菌数量的动态变化 ..................................................................... 13 3.5.1细菌数量的变化........................................................................................................ 13 3.5.2细菌的分离与鉴定 .................................................................................................... 14 4(结论 ...................................................................................................................................... 19 5.展望 ......................................................................................................................................... 20 参考文献 ................................................................................................................................... 22 致谢 ............................................................................................................................................. 24 III 1.引言 烟草是我国主要的经济作物之一，种植面积以及产量均居世界首位。而烟梗是卷烟企业的重要的废弃物之一，占烟叶总量的30%左右。从2000年开始全国烟草的生产量在不断地增加，在2007年达到1.48百万吨，这就导致烟梗的数量从2000年的9000吨增加到 ,1,2007年的23000吨。由于不能及时有效的合理利用而成为废弃物，不但造成环境污染，而且也会造成资源的浪费。有机废弃物通过高温好氧堆肥处理可以形成性质稳定、对农作 [2-3]。这不但能够实现大批量有机废弃物的转化，物无害，可以作为土壤改良剂的堆肥产品 而且不产生二次污染，并且可以促进工业和农业的良性循环。 近年来烟梗发酵的有机肥主要用来改善烟区土壤的理化性质，保持土壤的活力，增强烟叶的产量，提高烟叶的品质。研究明:适量的氯能促进烟叶生长，增强细胞膨压，从而提高抗旱能力和烟叶产量;增加烟叶的弹性和油润性，降低烟叶破碎率，提高烟叶的内、外品质。氯含量偏低会影响烟叶产量，使物理特性变差;氯含量过高，烟叶糖代谢受阻， [4]淀粉积累，最终导致叶片厚而脆，无弹性，燃烧性下降，香气减少，品质变劣。研究表明随着烟叶氯含量增加,烤烟的香气质、香气量、余味、杂气、燃烧性、灰色分值和评吸 [5]总分均表现出先增加后降低的趋势。即氯元素是烟草必需而又要限量的元素。根据去年郭灵燕师兄烟梗发酵有机肥大田试验的结果，发现不经处理的烟梗直接发酵的有机肥，发现其中氯元素含量较高。综上所述烟梗发酵有机肥脱氯实验成为了研究的必要。 在烟梗的发酵过程中细菌起了很大的作用，对细菌的动态变化和种属的研究成为了有待于解决的问题。就课题研究的相关内容，本文对烟梗及其综合利用现状、发酵菌剂在废弃物发酵有机肥中的研究现状、固体废弃物发酵有机肥的生物学机理进行简要综述。 本文的宗旨在于研究实现脱氯发酵的方法，观察和检测发酵过程中物料的理化性质的变化，用平板记数法观察细菌菌群的动态变化和筛选出不同的细菌进行种属的鉴定。 1. 1烟梗及其利用现状的综述 [6-7]烟草是茄科烟草属植物，烟梗即是烟叶之粗硬叶脉，约占烟叶重量的25,,30 ， 1 直径为1.5,5.0mm,长度为0.2,5.0cm，目前多作弃置处理。我国是烟草大国 ,每年有数十万吨烟梗资源被废弃。由于近年来人们对废弃物资源的再利用意识的不断增强，人们越来越重视对烟梗废弃物的综合利用，并做了大量的科学研究。 烟梗中含有的成分种类与烟叶成分基本一致 。烟梗的主要化学成分是总研究表明 , 糖，还原糖，总氮，果胶，烟碱，纤维素，木质素，多酚，茄尼醇，钾等。但烟梗主要的化学成分的含量并不是恒定的，不同地区、不同等级烟梗，不同等级的卷烟配方的梗丝以及膨胀前后梗丝的化学组成具有一定的差异。与烟叶相比，烟梗或梗丝化学组成的特征是 [8]总糖、总氮和烟碱的含量一般较低，细胞壁物质含量较高。 由于烟梗与烟叶的成分相当，而且烟碱的含量明显的较烟叶低，可以以烟梗作为卷烟填充原料。可以改善烟丝的结构，明显降低卷烟焦油量。烟梗通过微波膨胀制粒技术制成的颗粒以适当的比例用以卷烟加工，能有效地提高卷烟产品的装填体积和燃烧性能，降低 [9]木质素气味和焦油，不会引起感官质量、吸食风格的明显变化。但这种方法只能应用烟梗的一小部分，远远不能解决烟梗废料的堆积问题。 烟梗中含有大量的烟碱、果胶、烟酸茄呢醇、烟蛋白质、多种有机酸、有机碱、香精油、植物多酚类物质等具有较高的提取价值和在各领域具有较高的应用价值的物质。从烟梗中提取这些天然成分,是变废为宝、利用资源的有效方法,也是烟梗资源综合利用的重要途径,具有极其重大的意义。但提取之后的残渣如果不好好利用会对环境产生二次污染，这也是需要解决的问题。而烟梗废料发酵有机肥为此类废料的解决提供了方法。 1.2发酵菌剂在废料发酵有机肥过程中的研究现状 发酵有机肥的过程就是依靠自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，在一定的人工条件下，有控制地促进可被微生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程;也是微生物分解有机物质释放出能量的过程，这是发酵过程中温度上升的热源，它决定着有机物降解速率，Miller认为发酵物料温度的上升过程是发酵起始温度、微生物新陈代谢产热过程及堆体保温效应综合作用的结果,堆体一般要经历升温过程,高温持续过 [10]程和降温过程。有机固体废弃物是一类数量可观的可通过生物降解再利用的生物资源，通过堆肥化处理可成为一种很好的肥料和土壤改良剂。这是主要因为:(1)供给植物养分;(2)改善土壤理化性质;(3)改善土壤生物活性;(4)抑制一些土壤中病原菌的生长繁殖。但如果土壤中施用未腐熟的有机肥,会使微生物的活动剧烈，大量消耗氧气而形成厌 2 氧环境,从而产生大量中间代谢产物, 如有机氮、 NH3、 H2S 等有害物质, 这些物质会严 [11-12]重毒害植物的根系,影响植株正常生长。同时,如果施用未成熟的有机肥会使肥效延迟，不利于作物的生长，对作物的品质产生不利的影响。加快有机肥的腐熟成为了近几年研究的热点。 在2010年，尹永强等人做生物菌剂对烟用有机肥堆制腐熟的作用效果实验，结果表 [12]明得到添加生物菌剂能明显缩短堆肥腐熟时间,提高堆肥腐熟质量。在2006年，陈活虎等人在做腐熟堆肥接种对蔬菜废物中高温好氧降解过程的影响实验中发现利用腐熟堆肥接种进行高温好氧降解, 接种率愈高, 愈有利于好氧降解反应的启动, 提高有机物降解率; 腐熟堆肥接种率对有机物中总糖和纤维素降解的影响显著, 其降解率的差别是不同腐熟堆肥接种比例时有机物降解率差距的主要缘由;初始接种对堆肥生物相的影响明显, 且可在堆肥过程中保持较长时间，但接种率达到一定水平后, 接种对生物相的影响会随堆肥过程而逐步弱化;微生物相的演变与生物质的降解相互关联, 可采用按堆肥过程中生物 [13]质分类的降解状况,分段接种微生物。2007年李少明等又分析了不同微生物菌剂对烟末堆肥腐熟度的影响和堆肥过程氮素的变化，结果表明微生物腐熟剂福贝的堆肥化效果最 [14-15]佳，添加腐熟剂能促进氮素分解，加快铵态氮向硝态氮的转化。2009年，李放等将废弃烤烟茎杆与鸡粪混合堆肥，结果表明堆肥过程中温度保持在50?以上的时间为10d， [16]堆肥50d后，种子的发芽率可达100%，有机质和其它养分均达有机肥质量标准。 1.3研究的目的与意义 堆肥法是有机固体废物处理的重要方法之一。有机废弃物转化为有机肥料的方法是符合生态原理的处理方法，它能较好的克服有机废物燃烧和直接填埋而带来严重的二次污染弊端。本研究利用卷烟工业的副产物烟梗为原料，利用正交实验找到了烟梗脱氯的最佳条件和通过生物学方法研究发酵过程中细菌动态变化及筛选出优势菌种并进行了鉴定。 本研究意义很大，既能实现废料的再利用，又可以改善土壤的环境，还可以对环境保护产生深远的影响。 (1) 可以通过此实验达到烟梗脱氯的目地，为河南烟区提供有效的肥源，保护耕地的肥 力，提高烟叶的品质 (2) 通过对发酵过程中细菌的动态变化的研究，可以在一定程度上判断有机肥是否腐熟 及其发酵的进程，通过对细菌的鉴定，可以确定发酵过程中细菌的优势种，可以为 3 以后菌剂的选择提供参考 (3) 实现了废弃物资源化利用，解决烟梗堆积问题，保护环境。 1.4研究的内容与方法 通过正交试验确定最佳的脱氯条件。根据脱氯的最佳条件和生产实际对烟梗进行预处理，然后按一定的比例把发酵剂和预处理后的烟梗进行混合，并采用自制有机肥发酵装置进行生物发酵，用不加菌剂的发酵做对照组。发酵过程中，对物料物理参数--感官变化、温度、含水率进行监测和控制;对物料的化学参数PH的动态变化进行检测;采用生物学方法对物料微生物数量进行检测分析，采用BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪进行菌种鉴定。 4 2.烟梗脱氯有机肥发酵 2.1试验材料 烟梗:由天昌国际烟草有限公司提供，直径为0.15,0.50 cm，长度为0.2,5.0 cm。发酵菌剂:由郑州大学烟草生物技术研究室提供，为微生物复合菌剂，颗粒状，主要包括细菌、放线菌和真菌，该菌剂含有较多嗜热微生物，能促进有机质的分解，缩短废料腐熟时间。 仪器:烟梗有机肥反应装置: 由本实验室研制, 容积为300 L。苏州净化生产的超净工作台，上海恒科技有限公司生产的隔水恒温培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司生产的电热鼓风干燥箱等。烟梗的主要成分见下表1: 表1 烟梗的主要化学成分含量 化学成分 总糖 总氮 钾 烟碱 氯 果胶 含量/% 20.4 1.73 2.53 0.84 2.03 11.59 2.2试验内容 2.2.1烟梗脱氯预处理 设计正交实验，对时间、温度、溶剂量、粗细度四个因素分别设计3个水平，选用 4L(3)表得到正交表见下表2: 9 表2 时间、温度、溶剂量、粗细度4因素3水平正交脱氯设计表 试验因素 水平 时间/h 温度/? 溶剂量 粗细度 1 12 25 1:5 原梗 2 24 50 1:10 原梗一半 3 36 75 1:15 过16目 5 通过对9个实验样品的成分分析，得出脱氯量的实验结果见表3: 表3.时间、温度、溶剂量、粗细度4因素3水平正交脱氯结果表 因素 时间 温度 溶剂量 粗细度 脱氯结果 实验1 12 25 1:5 原梗 0.8546 实验2 12 50 1:10 原梗一半 1.2012 实验3 12 75 1:15 过16目 1.5960 实验4 24 25 1:5 原梗 1.4511 实验5 24 50 1:10 原梗一半 1.1130 实验6 24 75 1:15 过16目 0.3402 实验7 36 25 1:5 原梗 1.1298 实验8 36 50 1:10 原梗一半 1.0836 实验9 36 75 1:15 过16目 0.7098 利用正交软件进行直观分析表见下表4: 表.4时间、温度、溶剂量、粗细度4因素3水平正交脱氯直观分析表 因素 时间 温度 溶剂量 粗细度 实验结果 实验1 12 25 1:5 原梗 0.8546 实验2 12 50 1:10 原梗一半 1.2012 实验3 12 75 1:15 过16目 1.5960 实验4 24 25 1:10 过16目 1.4511 实验5 24 50 1:15 原梗 1.1130 实验6 24 75 1:5 原梗一半 0.3402 实验7 36 25 1:15 原梗一半 1.1298 实验8 36 50 1:5 过16目 1.0836 实验9 36 75 1:10 原梗 0.7098 均值1 1.217 1.145 0.759 0.892 均值2 0.968 1.133 1.121 0.890 均值3 0.974 0.882 1.280 1.377 极差 0.249 0.263 0.521 0.487 效应曲线图，见下图1: 6 图1. 时间、温度、溶剂量、粗细度4因素3水平正交脱氯效应曲线图 从实验直观分析表可以看出:极差的大小为:溶剂量>粗细度>温度>时间，所以影响脱氯效果的最大的因素是浸泡的溶剂量，其次是烟梗的粗细度和浸泡温度，浸泡时间的影响效果最不明显;从效应曲线图大致推断烟梗预处理降氯的最佳条件为:时间 12h，温度25?，溶剂量为1:15以上，粗细度 过16目筛或者更细的筛子。考虑到生产实际及生产成本，烟梗浸泡温度设定为25?，时间为12h, 溶剂量为1:15,粗细度为过16目筛。过16目筛后的烟梗细度已经很细，更细的筛子筛出来的烟梗浸泡后不易生产操作，故设定粗细度为过16目筛。在此基础上，做本次实验，自然发酵做对照。 2.2.2发酵步骤 2.2.2.1物料的配方 物料为经过脱氯处理的烟梗，处理组加入发酵菌剂，含水率约为65%,菌剂接种量为烟梗含量的5‰，土加入量为10%。CK组不加入菌剂，其他条件与处理组相同。 发酵过程中通过检测温度变化来控制通风、翻料和补水。发酵周期为35d。 2.2.2.2采样与分析 2.2.2.2.1采样方法 采用发酵罐中四角和中间5个位置的发酵样品进行中层取样混合，每五天取一次样，每次取样500g,置于-20?冰箱冷藏备用。 2.2.2.2.2物料感官变化的检测 7 通过视觉、触觉、嗅觉等感官来分辨烟梗发酵过程中气味、色泽、质感的变化。 2.2.2.2.3温度的测定 在发酵中设置温度计，早晚八点各测一次，取平均值为当天的灌体物料的温度。 2.2.2.2.4含水率和PH的测定 [17] 采用NY /T798- 2004规定的方法测定含水率和pH 。 2.2.2.2.5细菌数量的测定及菌种鉴定 [18] 细菌数量的测定采用微生物平板计数法。采用BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪和药敏实验来鉴定细菌种属。 2.2.3数据处理与分析方法 相关数据分析和作图采用Excel软件进行。 8 3.结果与分析 3.1发酵过程中物料的感官变化 发酵开始时, 烟梗物料呈黄褐色, 有刺鼻的烟味。发酵初期, 物料颜色开始转深, 呈灰褐色, 表面有少量霉菌出现, 略带有霉味和发酵香味，手感粘稠。发酵中期, 物料略呈黑褐色, 白色菌体大量繁殖，有明显氨味。发酵后期, 物料呈黑褐色, 氨味减少, 略带有土腥味。发酵末期,物料呈黑褐色, 臭味消失, 土腥味增加，在上面飞行的昆虫的数量减少，手感松散。与处理组相比, 对照组在发酵前期, 物料出现霉菌较多, 霉味较浓; 发酵中期, 物料恶臭味和氨味较重, 白色菌体较少; 发酵后期, 物料略带臭味, 并带有霉菌菌丝, 土腥味不明显。发酵末期，物料的体积较处理组大，土腥味不明显，物料带略臭味。通过对比发现发酵菌剂对烟梗有机肥发酵有显著促进作用, 并可改善有机肥的感官品质。 发酵前烟梗 发酵后的烟梗 3.2发酵过程温度的变化 发酵温度是发酵过程中最重要的参数之一，在图2中，根据处理组和对照组以及室温的变化情况，可以看出处理组和对照组的发酵温度都经历了升温期、高温期、降温期和稳定期。处理组从发酵的第2d就进入快速的升温阶段，在发酵的第4d温度达到最高72?。 9 随后发酵温度下降，到发酵的第10d达到36?，此时我们进行了一次翻堆处理。由于翻 堆处理能给微生物提供充足的氧气，翻堆后好氧微生物又继续剧烈的活动，分解有机物释放能量，发酵温度又迅速上升，在发酵的第15d回升温度达到最高64?。随着发酵的继续进行温度缓慢下降，在发酵24d以后温度维持在21?左右，发酵进入了稳定期。从图上可以看出处理组的高温阶段(?50)在翻堆前维持7d，再翻堆后，又出现了4d。。而对照组CK升温阶段较处理组推迟了1天，最高温度推迟了2d而且只有65?，相对于处理组低了7?。高温阶段(?50?)仅仅维持了5d,最高温度只有67.5?，经翻料后，温度回升不高仅仅只有42.5?，在随后的发酵时间内，温度降低，在发酵的第25d时发酵温度达到22?，随后发酵温度缓慢上升，在发酵末期温度趋于30?，表明物料中还有微生物在活动，发酵产物还没有充分腐熟。 从处理组和CK组的对照可以看出，处理组的发酵时温度上升的很快，说明微生物的活动剧烈，数量多，酶活性较高，有利于发酵的腐熟。高温阶段是发酵的最重要阶段，研究表明堆体温度在55?条件下保持3 d以上(或50?以上保持5,7 d)是杀灭堆料中所含 [19]的致病微生物,保证堆肥的卫生指标合格和堆肥腐熟的重要条件，而且很多难降解的有机物质在此阶段被降解。处理组的高温阶段的时间是13d而且处理组的只有5d,说明处理组具有较强杀害病原微生物的能力很强和分解难降解有机物的能力。 在发酵趋于稳定的阶段，处理组的温度在发酵的第23d开始趋于室温20?，Mosher [20]当堆肥物料的温度低于20?,堆肥过程将显著变慢甚至停止等研究认为,。虽然CK组在此时也有趋向于室温的趋势，但之后温度有上升在发酵末期温度趋于30?。这说明处理组有可能在第24d有机肥已经腐熟，而CK组中物料中仍有微生物的活动，即物料中的营养物质没有消耗尽，有机肥还没有腐熟，发酵周期还没结束。可以得出加入菌剂的发酵物料有利于杀死病原微生物，缩短发酵的时间。 10 温度曲线 80 处理70CK60室温 50 40 温度/?30 20 10 0 05101520253035 发酵时间/d 图2发酵35d中的温度变化 3.3发酵过程中含水率的变化与控制 水分是影响发酵的重要因素，水分过少，发酵罐内的空气流通，好氧微生物活动剧烈，易造成有机质和氮素大量损失，材料不能吸收软化，水分过少时，微生物活动受阻， [21]腐解缓慢;水分过多，发酵罐内的空气少，通气不良，有机物分解解缓慢，所以合适的含水率是发酵过程所必需的。 见图3发酵罐内物料的含水率整体呈下降趋势，发酵开始时烟梗的含水率是65%，发酵到最后，处理组的含水率为40.7%，CK组含水率为51.2%。在同一发酵时间处理组的含水率明显低于CK组。发酵的前10天处理组的含水率下降的较快。在发酵的第20d适量的补充水分，含水率有所增加，随着发酵时间的进行又继续下降，处理组下降的较快，最后维持在40?左右，而对照组在其后的含水率下降的较慢，含水率基本上维持在51?。含水率降低的因素主要是因为(I)由于微生物的急剧繁殖和生长，要消耗一定的水分。(2)烟梗中含水率高的部分(见表3)被大量降解，生成的水和游离出来水一部分被蒸发，一部分从烟梗堆体中沥出，成为渗沥液。(3)在有机肥发酵过程中，烟梗堆体的温度通常在50?以上，最高可达70?左右，远远高于气温，因此水分的蒸发十分显著。与CK组相比，处理组发酵结束时的含水率低10.2%，表明处理组微生物活性较强并且经历的高温时间也较长。根据相关研究发现当含水率下降到40?左右，就不利于微生物生长，在发酵的末期，处理组的含水率下降到了40?左右，而对照组还维持在50?左右，这表明对照组在发酵结束时还有微生物的活动，而处理组可能已经腐熟，可见从含水率的角度得出，可以增加 11 含水率的下降速度，从而反映了添加发酵菌剂，可以增加物料中微生物的活动强度，缩短发酵周期。 烟梗发酵有机肥过程含水率变化 70 处理65 CK60 55 50 45含水率/% 40 35 30 05101520253035 发酵时间/d 图3发酵35d中的含水率的变化 3.4发酵过程中PH变化 pH值是微生物生长的重要条件, pH值太高太低都会影响堆肥效率。特别是发酵初期,控制pH值能极大地加快反应速率,这样可避免由于反应停滞引起的臭味污染。见图4发酵过程中物料PH整体经历了下降、上升和下降三个阶段。发酵开始时PH为5.3，发酵结束时CK组PH为7.4，处理组为7.3.发酵初期处理组PH提前5d降到最低。可能是在发酵开始时,由于利用的能量物质糖类、蛋白质和纤维素较多,微生物繁殖的速度很快,其活动产生的有机酸使pH下降。发酵到第20d处理组的PH达到最高8.1，发酵第30d下降到7.3，并趋于稳定，说明随着堆肥的继续进行,温度的升高使堆体中的乙酸、丁酸挥发,含N的有 [22]机物质分解产生的氨,是使pH上升的原因。CK组发酵第20 d PH为8.5，并随以后的发酵时间而缓慢降低，而且都高于处理组。表明CK组仍有一部分有机氮尚未转化成无机氮，发酵过程还没有完成，发酵周期较长，而处理组在发酵末期有机氮基本转化成无机氮，从氮转化的角度看缩短了发酵的周期。 12 烟梗发酵有机肥过程pH变化 9 处理8CK 7 6pH值 5 4 3 05101520253035 发酵时间/d 图4发酵35d的PH的变化 3.5烟梗发酵有机肥中细菌数量的动态变化 3.5.1细菌数量的变化 从图5得出处理组的细菌在发酵罐中的数量整体呈先上升后下降的趋势，在发酵的 12前5d细菌数量迅速上升，第5d细菌的数量达到最大为3.3×10 CFU.g-1 。在发酵的第10d对物料进行翻堆处理后，细菌的数量明显的降低，随着发酵的进行，细菌的数量又有所增加，但没能达到最大值。随后细菌的数量随着发酵的进行而缓慢的降低，最后稳定 1011在2.3×10 CFU.g-1 。而对照组细菌的数量是在发酵的第15d达到最大为1.3×10 CFU.g-1 。随这发酵进行，细菌的数量缓慢下降，在发酵到30d时细菌数量有缓慢增加。处理组与CK组相比，发酵开始时，细菌数量增加的较快，仅仅5d细菌的数量就达到了最高，这说明细菌数量的增加与温度呈正比例关系。由于处理组添加了发酵的菌剂，而且升温较快，说明发酵剂中含有嗜温细菌，嗜温细菌在发酵初期能分解易分解有机物产生热量，以提高物料的温度。随着温度的升高，嗜温细菌或者休眠或者死亡，这时嗜热细菌大量，其后随着有机质的消耗殆尽，细菌的数量逐渐降低。而对照组细菌在发酵开始时数量增加较慢。而且到发酵的末期细菌有增加的趋势，说明有机物质还没有消耗殆尽。进而表明加入发酵菌剂可以加快发酵的进程，缩短发酵的时间。 13 细菌数量变化 13 处理 CK11.5 10 8.5数量对数/1gCFU.g-1 7 0510152025303540 发酵时间/d 图5发酵40d细菌数量的变化 3.5.2细菌的分离与鉴定 先利用稀释涂布平板法，从发酵的物料中分离细菌，经过培养。取出不同的单菌落进行平板划线分离法再次培养。整个实验经过九次分离纯化最后筛选出了三株菌。分别标号1号菌，2号菌，3号菌。1号菌的菌落颜色是白色、形状圆形、表面凹陷、边缘光滑、干燥、不透明;2号菌的菌落颜色是白色、形状圆形、表面凸起、边缘光滑、湿润、不透明;3的菌落颜色是黄色、形状圆形、表面凸起、边缘光滑、湿润、不透明。号 利用革兰氏示试剂盒对以上三种菌进行染色然后在油镜下观察细胞的形态形态并照相。图6是是1号菌的细胞形态，图7是2号菌的细胞形态，图8是3号菌的细胞形态;从革兰氏染色的颜色可以看出3号菌的颜色是红色说明此菌是革兰氏阴性菌，它性状为球形;1号菌和2号菌的颜色是蓝紫色说明它们是革兰氏阳性菌，它们的形状是杆状，1号菌比2号菌的直径长，在100倍油精下目测长度相差不大。 14 图6.1号菌细胞形态 图7.2号菌细胞形态 图8.3号菌的细胞形态 15 在河南省人民医院用BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪来鉴定分离出的细菌种类。 表5是3号菌的测定结果 生化试剂 实际 预测 R- BETA-阿洛糖 — — R-BETA-龙胆糖 — — — — R-DEDXTROSE R-D-半乳糖 — — R-D-果糖 — — R-D-葡糖酸 — — R-D-蜜二糖 — — R-L-阿拉伯糖 — — R-甲基-β-葡糖苷 — — R-N-乙酰-氨基半乳糖 — — R-N-乙酰-葡糖胺 — — R-山梨醇 — — R-蔗糖 — — R-半乳糖醛酸 — — R-麦芽酮糖 — — R- L-鼠李糖 — — C-多粘菌素E — — C-D-甘露糖 — + C-柠檬酸盐 — V C-多黏菌素B — — A-L-色氨酸-AMC — — A-L-焦谷氨酸-AMC — — A-L-脯氨酸-AMC — — A-L-精氨酸-AMC — V A-L-苯丙氨酸-AMC — + M-U-N-乙酰-BD氨基葡糖 — — A- L-谷氨酸-AMC — V N-L-脯氨酸-NA + V N-GAMMA-1-谷氨酰-NA — V T-七叶酸 — — C-乙酸 — V C-福寿草醇 — — C-丙二酸 — — C-ALPHA-酮戊二酸 + + C-顺芷酸 — V A-赖氨酸-丙氨酸-AMC — — A-戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC — — A-甘氨酸-脯氨酸-AMC — — A- 甘氨酸-AMC — V A- 精氨酸-精氨酸-AMC — — A-L-亮氨酸-AMC — V 16 S-尿素 — — P-BIS(PNP)磷酸盐 + V P-PNP-BP-葡糖苷 — + 标明:+、代表阳性 —、代表阴性 V、代表可变性、不确定性 表6药敏结果:产碱菌某种(ACHRSPE) 抗生素 敏感度 MIC 阿米卡星 ?8 敏感 庆大霉素 ?2 敏感 亚胺培南 敏感 2 美罗霉素 ?1 敏感 头孢他啶 敏感 4 头孢噻 中介 32 头孢吡 敏感 4 氨曲南 ,16 耐药 哌拉西林 ?4 敏感 阿莫西林/克拉胃酸 ,16/8 耐药 哌拉西林/他唑巴坦 ?4/4 敏感 多粘菌素 ?0.5 敏感 复方磺胺 敏感 2/38 氯霉素 ,16 耐药 环丙沙星 ?0.5 敏感 左旋氧氟沙星 ?1 敏感 四环素 敏感 4 根据BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪分析的结果可知此菌是表5显示的结果是 3号菌对大多说实验药品呈现阴性，此菌不在BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪鉴定 的细菌种类内，所以BD PHOENIX 100全自动微生物分析仪进行药敏实验，检验结果见表 6，结果显示此菌为产碱属某种。由于鉴定条件的局限性，只要鉴定到属不能鉴定到种。 表7是1号菌和2号菌的测定结果 生化试剂 1号 2号 实际 预测 实际 预测 R-BETA-龙胆二糖 — — — — R-蔗糖 — — V + C-D-葡萄糖 + + + + C-3-甲基戊二酸 + + + + C-D-果糖 + + + + C-亚氨基二乙酸 + + + V C-多粘菌素E — — + + C-多黏菌素B — — + V C-ALPHA-酮戊二酸 + + + + C-D-甘露糖 + + + + 17 C-3-甲基-己二酸 + + + + C-胸苷 + + + + M-PNP-AD-葡糖苷 — + V V P-PNP-磷酸盐 — + V V N-缬氨酸-丙氨酸-PNA — — — V N-L-脯氨酸-NA V V + V R-麦芽丙糖 — — + + R--N-乙酰-葡糖胺 — — + + R-D-海藻糖 — — + + M-4MU-BD-纤维二糖糖苷 + V + V A-L-丙氨酸-AMC — — — — M-PNP-BD-葡萄苷 + V + + A-L-脯氨酸-AMC — — — — A-L-焦谷氨酸-AMC — — — V A-L-苯丙氨酸-AMC — — + V A-L-色氨酸-AMC — — — — M-4MU-磷酸盐 — + + V A-蛋氨酸-AMC — — + + P-4MU-AD-葡糖苷 + + + V N-丙氨酸-丙氨酸-PNA — V V V T--七叶酸 + V + + R-D-塔格糖 — — — — R-麦芽糖 — — + + R-DEDXTROSE + + + V A-精氨酸-精氨酸-AMC — — — — A-甘氨酸-脯氨酸-AMC — — + V M-4MU-BD-葡萄苷酸 — — — — A-L-亮氨酸-AMC — — + + M-U-N-乙酰-BD氨基葡糖苷 — — — — A-L-精氨酸-AMC — — — — M-4MU-磷酸盐(with海藻糖) + + + + A-L-组氨酸-AMC — — — — A-L-异亮氨酸-AMC — — — — M-4MU-BD-半乳糖苷 — — — — S-尿素 — — — — 标明:+、代表阳性 —、代表阴性 V、代表可变性、不确定性 表7显示的结果:1号菌是苏云金芽孢杆菌，2号菌是枯草芽孢杆菌。 苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是嗜热菌，产碱菌是嗜温菌，表明此菌剂中包含有这 三种菌，它们在升温和高温阶段扮演着重要的角色。 18 4(结论 本研究通过正交实验得出烟梗脱氯预处理的最佳条件是浸泡时间12h，浸泡温度25?、溶剂量1:15以上、烟梗粗细度16目筛，为以后的有机肥脱氯研究提供了一定的参考。 烟梗发酵过程中其色泽经历了黄褐色-灰褐色-深褐色-黑褐色的变化，气味经历了从烟草香味-氨臭味-土腥味过程的变化。处理组与对照组相比，升温开始于发酵的2d，比CK组提前了一天，最高温度比处理组提前两天达到最高温度，且最高温度比CK组高了6.5?，通风后处理组的温度回升的快且高，而对照组回升较慢且低，而在发酵末期，处理组的温度稳定在室温，而对照组有上升的趋势。从温度的角度看，添加发酵菌剂，可以加快升温的时间，增加高温阶段，提高产品的安全性和缩短发酵时间。而发酵过程中的含水率呈整体下降趋势，在发酵的前10d含水率处理组下降的较快，第10天到15天CK组下降的较快，但在整个发酵过程中处理组的含水率低于CK组，在发酵的末期处理组的含水率为40.7%而对照组为51.6%。从含水率的变化得出添加发酵菌剂，可以使含水率迅速下降，从而反应发了发酵罐中微生物降解有机物的能力强，有利于缩短发酵周期。 发酵过程中的PH值呈现下降上升下降的趋势，处理组在发酵进行的第5d下降到最低点4.6，而对照组推迟了5d且比处理组低0.4个点，大约到达发酵的第20d，的CK组高于处理组;这些表明在发酵的前5d，处理组微生物比CK组活动剧烈，而发酵进行到第 20d之后，处理组的有机氮基本上转化成了无机氮而CK组还有一部分没转化，可见添加发酵菌剂加快有机物的分解，加快实验进程。 12 处理组与对CK组相比细菌的数量在发酵到第5d达到最大值3.30×10 CFU.g-1，相对于CK组提前了10d，而且在通风后处理组有小幅度的上升，而对CK组确下降，在发酵 12末期处理组的细菌数维持在2.32×10 CFU.g-1左右，而CK组有上升的趋势。这表明增加的发酵菌剂含有较多的嗜温菌和嗜热菌，有利于加快物料中有机物的分解，缩短发酵的周期。 此实验分离和鉴定的优势细菌是苏云金芽孢杆杆菌、枯草芽孢杆菌、产碱菌某种。 19 5.展望 本研究一方面针对烟梗有机肥发酵脱氯方法，对烟梗的脱氯取得了一定阶段性成果，为以后的脱氯研究提供了一定的参考。另一方面针对烟梗发酵过程中细菌的动态变化、含水率、PH值、温度的问题的研究，得出了发酵物料中细菌、含水率、PH值、温度的变化规律。此实验为研究发酵过程中放线菌和真菌的动态变化提供方法。由于此实验只是对细菌研究，不能反映整个发酵过程中微生物的动态变化情况，在本实验研究的基础上，应该尽最大可能的研究发酵中的所有微生物的动态变化，提高生物指标的精确度和准确度。由于实验条件和时间等原因我们只对发酵中的含水率、温度、PH值进行了测定，对发酵有机肥中的碳/氮比、耗氧量、光学性质、有机肥的变化、发芽实验等没有进行分析，在本研究的基础上应该加大各个方面的研究，使发酵参数更加的优化，提高烟梗有机肥的实用性，能使烟梗有机肥很好的应用于烟区，提高烟叶的产量和质量。 此发酵过程的处理组和CK组相比添加了发酵菌剂，处理组的发酵时间明显的比CK组缩短，发酵过程明显优于CK组。这说明生物菌剂具有明显的促熟作用，可以在在除了烟梗发酵以外其他的发酵物料中得到应用，提高发酵产物的腐熟度。因此加大生物菌剂的研究是必然的趋势。 烟梗发酵有机肥是有机废料烟梗通过生物技术处理而变成可利用的农田有机肥料，这不仅可以将烟梗污染达到最低程度,还可以变废为宝，在避免环境污染的同时，而且土壤使用有机肥还可以避免长期地使用化肥特别是大量施用铵肥，使土壤逐渐酸化这不仅破坏土壤性质，而且会促进土壤中一些有毒有害污染物的释放迁移或使之毒性增强，使微生物和蚯蚓等土壤生物减少，还加速了土壤一些营养元素的流失和造成土壤颗粒分散，从而破坏了土壤团粒结构，使土壤的物理化学特性发生了变化，导致土壤板结，肥力下降。同时，大量施用氮肥，给土壤引入了大量非主要营养成分或有毒物质，如硫铵中的硫酸根离子和氯铵中氯离子，它们对土壤微生物的正常活动有抑制或毒害作用。 烟区使用烟梗有机肥可以避免大量使用化肥，这不仅可以避免烟梗大量堆积对环境造成危害，还可以利用有机物-烟梗进行发酵有机肥，使烟梗变废为宝，可以给人们带来经济效益，还可使改善土壤的理化性质，实现烟草农业的可持续发展。由于烟梗有机肥除了 20 具有普通有机肥的性质外，还具有一部分农药的性质，农田使用此有机肥可以减少农药的使用量，使农作物更加的安全，而且还具有特殊的养料成分，可以用于特种作物的种植。总的来说烟梗有机肥的应用前景非常广阔，我们应该加大对它研究。 21 参考文献 [1]Agnieszka Piotrowska-Cyplik, Anna Olejnik, Pawe? Cyplik, et al. The kinetics of nicotine degradation, enzyme activities and genotoxic potential in the characterization of tobacco waste composting. Bioresource Technology , 2009, 100:5037,5044 [2]Svend Tage Jakobsen. Aerobic decomposition of organic wastes 2. Value of compost as a fertilizer. Resources ,Conservation and Recycling ,1995, 13 :57,71 [3]E. Iglesias2Jimezez ,C. E. Alvarez. Apparent availability of nitrogen in composting municipal refuse .Biol Fertil Soils,1993, 16 :313,318 [4]吕春伟.云南烤烟40级钾氯元素含量及规律[J].安徽烟草科技，1999(4):12-18 [5]许自成,李丹丹,毕庆文,等. 烤烟氯含量与挥发性香气物质及感官质量的关系研究[J].中 国烟草学报，2008,14(5):27,32 [6]周国华，万端极，张艳.废烟梗制备纤维素黄原酸酯及其吸附Cu2+研究[J].化学工程师， 2007，146(11):54,58 [7]罗鹏涛，李佛琳，烤烟栽培与烘烤[M].成都:西南财经大学出版社，2007 [8]王月侠，葛善礼，烟梗化学组成分析.烟草科技?烟草化学，1996 [9]王慧, 曾晓鹰, 杨涛, 等. 微波膨胀烟梗制备颗粒应用于卷烟的效果评价[ J]. 烟草科技, 2008( 10) :5-8 [10]Campbell C D, Darbyshire J F. The composting of tree-bark in small reactors adiabatic and fixed temperature experiments [J]. Biological Wastes, 1990, 31(3): 175-185. 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