血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网膜新生血管.doc

血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网膜新生血管.doc 血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网 膜新生血管 【摘要】 目的:探讨血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)和血管内 皮生长因子(vascular endothelial groent of retinal neovascularization.METHODS: It control experimental study. Forty seven day old C57BL/6J mice ly including normal control group and hyperoxia model group. Hyperoxia model group odel of oxygen induced retinopathy. Fluorescent angiography the retina into the vitreous in cross sections. Ang II and VEGF protein levels in retinas easured by al control group. The number of endothelial cells of ne retina to vitreous odel group (43.23?2.57) as pared al control group (1.37? 0.93) (P=0.00). The expression of Ang II protein in retinas odel group (0.365?0.004) pared al control group (0.035?0.003) (P=0.00). The expression of VEGF protein in retinas odel group (0.372?0.004) pared al control group (0.049?0.007) (P=0.00). CONCLUSION: There is specific relation betoting effect. Ang II participate in the occurrence and development of retinal neovascularization via the upregulation the expression of VEGF. KEY;angiotensin II;vascular endothelial growth factor 0引言 视网膜新生血管是糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等增 生性视网膜病理改变的主要特征[1]。在这些增生性视网膜病变中， 视网膜新生血管形成导致视网膜水肿、出血、脱离等严重影响视力 的并发症[1]。尽管刺激视网膜新生血管生长的因素还未完全明确， 但有证据显示参与此过程的不仅有血管源性的细胞因子如血管内皮 细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，还包括血 管活性激素如血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)[2]。在增生性视 网膜病变的发生、发展过程中，肾素 血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)中主要效应介质Ang II可能与特异性生长 因子特别是VEGF相互作用来影响视网膜的发育和功能，最终共同 导致视网膜新生血管形成。本研究的目的在于探讨视网膜新生血管 发生发展过程中，Ang II和VEGF影响视网膜新生血管形成的机 制。 1和方法 1.1材料 实验动物:鼠龄7d的健康C57BL/6J清洁级新生小鼠 (中国医科大学动物部)40只，体质量4.0,5.0g，性别不限，与哺乳 母鼠共同饲养。药品试剂:卡托普利(美国Bristol Myers Squibb 公司)、缬沙坦(瑞士Novartis公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国 Pierce公司)、ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)、异硫氰酸葡聚糖荧光素(美国Sigma公司)、兔抗小鼠Ang II多克隆抗体(美国Sigma公司)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(美国Sigma公司)、羊抗小鼠IgG HRP(美国Sigma公司)。 1.2方法 动物分组和模型建立:将40只7d龄C57BL/6J清洁级新生小鼠随机分为两组:正常对照组和高氧模型组，每组20只。参照Smith等[3]的方法建立氧诱导视网膜病变模型，高氧模型组小鼠及哺乳母鼠置于密闭氧箱中，控制氧浓度为(75?2)%，5 d(鼠龄12 d)后回到正常空气环境中，正常对照组一直置于正常空气环境中。所有动物保持温度(21?1)?C，光照 黑暗循环/12h。荧光素血管灌注视网膜铺片:两组鼠龄17d的小鼠各取2只，将异硫氰酸葡聚糖荧光素(分子量:2×106)溶于1mL的40g/L多聚甲醛中，经左心室灌注(30mL/kg)，摘取眼球，于40g/L多聚甲醛中固定1h，游离视网膜，以视盘为中心呈放射状对称切开，用抗荧光衰退封片剂将视网膜封片，采用荧光显微镜(日本Olympus公司)观察视网膜血管形态的变化。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数:两组鼠龄17d的小鼠各取3只，摘除眼球后，于40g/L多聚甲醛中固定24h，常规脱水，石蜡包埋，平行于角膜至视盘的矢状位连续6μm切片，苏木素 伊红染色。每只眼球取10张切片，每组30张，由同一操采用随机、盲法在光学显微镜(日本Olympus公司)下对切片样本计数每张切片突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。选取切片时注意避开视盘周围，计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核，不包括玻璃体腔内其它与内界膜无联系的血管内皮细胞核。Western blot检测Ang II及VEGF蛋白达:两组鼠龄17d的小鼠各取15只，每组取5只新生鼠双眼完整的视网膜，提取视网膜组织蛋白质，用BCA蛋白定量试剂盒定量视网膜组织蛋白质含量，每个样品上样含量50μg，以100g/L SDS PAGE电泳(4?，120V，2h)分离蛋白质，电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上，用40g/L脂奶粉，于4?下过夜封闭硝酸纤维素滤膜的非特异性蛋白质结合位点，将滤膜于兔抗小鼠Ang II多克隆抗体(1?400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(1?400)在37?下孵育2h，TBS T缓冲液冲洗滤膜3次后，将滤膜转移至二抗羊抗小鼠IgG HRP(1?1000)，37?下孵育1h，TBS T缓冲液再次冲洗滤膜后，ECL化学发光显影。采用β actin(1?400)作为内参照。每组样品重复检测3次。应用Quantity One 4.2软件，分别比较各组Ang II，VEGF条带灰度值与β actin条带灰度值的比值，表示各组蛋白相对表达水平。 统计学分析:所有数据应用SPSS 16.0 for Windoe，ACE) 和丝氨酸蛋白酶的作用下转化生成，通过血管紧张素II 1型受体(angiotensin II type 1 receptor，AT1R)和血管紧张素II 2型受体(angiotensin II type 2 receptor，AT2R)发挥作用[2]。Ang II不仅是一种血管活性物质，而且还是一种生长因子，可以促进多种血管细胞的扩散、转移以及合成，从而引起血管生成和重建;同时，Ang II也参与细胞生长、分化、凋亡和细胞外基质沉积等各种细胞性活动;另外，Ang II也在调节血压、交感神经活动和维持水、电解质平衡等许多生理活动中起着关键的作用;最后，Ang II也参与许多病理过程，例如:心肌肥厚、心肌梗死、动脉粥样硬化、肾病以及肿瘤[5 10]。 VEGF是一种具有良好血管通透性、促进血管生成的活性因子，在缺血缺氧性视网膜病变中，VEGF表达上调并参与血 视网膜屏障的破坏，于疾病的早期出现，并持续存在于整个疾病过程中[11,12]。在视网膜周细胞和血管内皮细胞中，Ang II通过AT1R介导VEGF表达，刺激VEGF产生，两者共同存在于视网膜神经节细胞层、Müller细胞层、外核层和视网膜色素上皮层中，影响视网膜微血管系统的发育[13 15]。因此，在视网膜微血管系统中，Ang II直接或通过上调其他特异性生长因子特别是VEGF来影响视网膜血管周细胞的功能、发挥促新生血管形成等作用。所以，通过阻滞RAS对以视网膜新生血管为特征的增生性视网膜病变的防治和转归有重要意义。对RAS的阻滞，主要通过ACEI和ARB来抑制Ang II，从而发挥抑制新生血管形成的作用，但两者作用机制有所不同。ACEI是通过阻断ACE，减少Ang II生成来发挥其作用;而ARB则是通过选择性阻断AT1R和Ang II结合而发挥拮抗作用。 实验结果表明，Ang II在视网膜新生血管的发生发展中成为一个关键性的因子，RAS在增生性视网膜病变视网膜新生血管形成中起关键作用，其促血管生成的作用与VEGF存在明确的联系。然而，RAS相对较为复杂，与激肽释放酶 激肽系统、血管活性介质等都有交叉相互作用，因此，在增生性视网膜病变的视网膜血管渗漏和新生血管形成的临床前研究有望揭示它们之间的相互作用，特别是RAS阻滞剂抑制视网膜新生血管形成的实验和临床研究可能将会成为预防和治疗视网膜新生血管一个潜在的临床方法。 【