γ-丁氨酸对老鼠小脑皮层局部的耗氧量和血流量的调节-溶氧电极

γ-丁氨酸对老鼠小脑皮层局部的耗氧量和血流量的调节-溶氧电极 γ-氨基丁酸对大鼠小脑皮质局部耗氧量和血流量的调节 Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 2008, 28:906-915 IF= 6.555 摘 要:清醒的大脑，氧气消耗总代谢速率基本保持不变，而在持续活动的区域间存在变化。这表明:与活动相关的控制机理即神经信号，可能会重新分配新陈代以支持主动网络。本研究探讨了γ-氨基丁酸(GABA)受体对大鼠小脑中兴奋型、麸胺酸型爬行纤维—蒲肯野细胞突触受刺激所诱发的小脑氧代谢速率(CeMR )局部增长的影响。在这个网络中，尽管GABAO2 能受体有变化，但是突触兴奋产生的突触后去极化得以保存。在对照条件下，爬行纤维刺激引起突触活动和CeMR的频率依赖性增长。局部应用γ-氨基丁酸A受体激动剂蝇蕈醇阻O2 碍了由突触兴奋引起的CeMR增长，并伴随小脑血流量应答的减弱。γ-氨基丁酸A受体拮O2 抗剂荷包牡丹碱可逆转这个效应，也能逆转蝇蕈醇对突触活动和小脑血流量的影响。只应用荷包牡丹碱时，爬行纤维刺激对小脑血流量产生延迟的负脉冲信号，并伴随CeMR的长时O2间上升。结果与假设一致:小脑血流量和CeMR的活动依赖性上升是由普通的前馈途径控O2 制的，并且为GABA对CeMR和小脑血流量的调节提供了证据。 O2 关键词:小脑;神经代谢藕合;突触传递 材料方法 电生理学 我们使用单管的玻璃微电极，充满2M/L的盐溶液(阻抗:2-3欧姆，头部:2微米)。用单个玻璃微电极插入小脑蚓部5或6瓣皮层以下300-600微米深来记录一个单位的活动(脉冲)和蒲肯野细胞胞外局部场电位(LFP)。一个银/氯化银接地电极放到颈部肌肉上。 10)由A/D转换器转换、放大、过滤(脉冲:300-2400Hz带宽;LFP:1-1000Hz放大的信号(× 带宽)，界面记录体统1401+接口与运行2.5型脉冲软件的电脑相连进行数据采样。脉冲数据采样率为20KHz，LFP数据采样绿为5KHz。 图1 记录小脑皮层中脉冲、局部场电位(LPF)、组织氧压和小脑血流量(CBF) 实验计划纲要图展示了激光多普勒血流测定仪探针、刺激和记录电极安置部位。单管电极立体定位于脑部下橄榄体尾部，刺激上行神经纤维，给蒲肯野细胞一个单突触兴奋输入。通过小脑半球LFP应答振幅的手段来优化布置，以便进行连续的低频刺激。玻璃电极记录LFP和单位脉冲活动，另一个微电极以最接近树突/蒲肯野细胞体的水平记录组织氧压。在200-500微米深度定位蒲肯野细胞，通过它们自然激发自然脉冲和复合脉冲的能力来鉴定， 或者由电刺下橄榄体5-8毫秒后产生的一个复合电位来判断。LDF通过将探针定位于脑脊软膜上0.3 -0.5毫米，脑脊软膜的传入和传出神经纤维有一250微米的分支，可以下到1.0毫米的深度记录CBF的变化。 爬行纤维刺激 将喷膜、不锈钢两极电极像上面描述的一样放入下橄榄体尾部。这获得了对CFs的一个额外刺激，这通过自发到复合脉冲的变化可以明显看出，这种变化会抑制藓状纤维受刺激而CFs不受刺激时引发的自发脉冲速率的上升。CFs刺激产生一个局部场电位，得到一个经典的层状剖面图和反相图。用小脑蚓体区域LFP时间最长的应答来优化配置，以便持续进行低频刺激(0.5Hz)。用强度为0.15mA、200µs恒定电流的的脉冲来进行持续15s频率为10Hz的刺激。 药物应用 通过局部灌注向小脑蚓体添加药物。用蝇蕈醇激活GABA受体，用荷包牡丹碱来抑制A GABA受体，每种药物都溶解于人工配置的浓度为0.2mmol/L的CSF溶液中。 A 小脑皮层血流量测量 LDF探针定位于脑脊软膜无大血管处以上3毫米，来持续记录CBF。探针尽可能靠近微电极和氧电极，刺入1000微米深测CeBF。LDF信号需要0.2秒的时间平稳下来。10Hz抽样率，A/D转换器转换，用2.5脉冲软件记录数据。 组织氧压测量 氧电极置于脑叶中，位置与电生理记录电极和激光多普勒探针相同。用Unisense溶氧微电极(OX-10，Unisense A/S，Denmark)来记录局部组织氧压。小的尖端(本研究中为-5μm)确保tpO的测量结果真实可靠，内置的保护阴极清除了电解液槽中的所有氧气。在32 进行氧指标的重复性测量时，每个电极都需要在每次实验前后、分别在饱和氧和无氧盐溶液(37?、0.9%)中进行校正。氧电极与高阻抗的Unisense皮安表相连，用于检测氧电极的电流。信号由A/D转换器转换，以100Hz频率(功率为1401，电压尖峰为2.5)记录。采用0.3Hz低通滤波器进行脱机滤波，以消除心跳和机械通气产生的噪音。 图2 通过增加GABA 能受体来降低小脑皮层耗氧量的诱发上升 (A)实验中，首先添加蝇蕈醇随后添加荷包牡丹碱，记录变量的原始数据(箭头表示开始添加)。上面的图形描绘了蒲肯野细胞的脉冲速率。第二条线阐明了组织氧的变化，第三条线显示了CBF的变化。红色小圆点表示刺激周期(10Hz，15secs)。 (B)上面的图形描述了同一大鼠在对照条件和给药条件下CBF应答的平均值。中间的图形描述了相应的tpO应答值。底部的图形显示了CMRo应答值(根据相应的对照条件和给药条件下的CBF和tpO的值计222算得出)。透明蓝色柱表示刺激周期。 (C)六只大鼠三种条件下的实验数据统计。上面的曲线图显示在对照条件和给药条件下CBF的增长百分率，中间的曲线图显示相应的tpO应答增长百分率，底部曲线图描述了相应的CMRo应答计算值作22为基线百分比。 图3 降低GABA能受体并没有改变小脑皮层耗氧量的诱发上升 (A)实验先添加荷包牡丹碱随后添加蝇蕈醇，记录的变量的原始数据(箭头表示开始添加)。上面的图形描绘了蒲肯野细胞的脉冲速率。第二条线阐明了组织氧的变化，第三条线显示了CBF的变化。红色小圆点 15secs). 表示刺激周期(10Hz， (B)上面的图形描述了同一大鼠对照条件和给药条件下CBF应答的平均值。中间的图形描述了相应的tpO2应答值。底部的图形显示了CMRo应答值(根据相应的对照条件和给药条件下的CBF和tpO的值计算得22出)。透明蓝色柱表示刺激周期。 (C)六只大鼠三种条件下的实验数据统计总结。上面的曲线图显示在对照条件和给药条件下CBF的增长百分率，中间的曲线图显示相应的tpO应答增长百分率，底部曲线图描述了相应的CMRo应答计算值作22为基线百分比。 图4 GABA能受体对局部场电位(LFP)形状和振幅的影响 (A)经典的LFP颜色像图B中图块一样编码色 (B)显示A图中LFP逆时针旋转90度然后绕垂直轴旋转90度图象。曲线图描绘了刺激频率为10Hz的15S期间(=150LFPs)LFP在60MS内的不同应答沿X-轴叠加图形。在Z-平面上，LFP应答振幅对应X-Y平面来进行颜色编码，用绿色描绘基线，红色描绘后超级化。 结果 我们通过局部添加一种独特的GABA激动剂蝇蕈醇，诱导突触抑制水平的变化(n=6)。A 胞外记录不同蒲肯野细胞的脉冲速率证实了这种药物的作用。在控制水平下，添加蝇蕈醇30S内，自发脉冲速率降低了93.1%+2.7%。通过添加一种GABA受体抑制剂荷包牡丹碱检A 验了蝇蕈醇的性质，它能够完全逆转蝇蕈醇对蒲肯野细胞脉冲活动的影响。所有的大鼠，在应用蝇蕈醇的整个期间，CeBF和tpO基础水平仍然保持不变，推测二者不依赖于蒲肯野纤2 维脉冲。 图2A显示了实验中首先添加蝇蕈醇随后添加荷包牡丹碱，蒲肯野细胞脉冲速率、tpO、2CeBF的原始数据。每个条件下氧气和CeBF应答值和计算得到的CeMR应答值一起取平O2均值，呈现在图2B中。图2C总结六只大鼠三种条件下的统计数据。如上所述，控制条件下诱发的CeBF应答达到了19.2%+5.6%(P=0.002，n=6)。应用蝇蕈醇以后，CeBF应答逐 渐回复到控制水平(图2C)。对照条件下诱发的氧气应答是两相的，开始为负相，以后为正相(图2B)。在应用蝇蕈醇期间，活动诱导的tpO应答的负相和正相变化各自下降了2 72.4%+0.2%和69.1%+0.1%(图2C，P=0.037，n=6)。tpO 的下降表明氧气被消耗的同时小2 脑血流量保持不变，并且氧气随之运送到脑皮层。这已经由CeMR的计算结果证实了，结O2 果表明氧气消耗量从基本条件期间的137.4+18.4µmol/100g/min上升到CF刺激期间的192.3+25.7µmol/100g/min(图2B)。应用蝇蕈醇期间，CeMR增加到154.7+19.6 O2 mol/100g/min，表示从控制条件起下降68.4%+0.1%(P=0.018，n=6)。这说明GABA减少µ 了诱发性CeBF和CeMR应答。荷包牡丹碱逆转了CEMR上升到17.2+28.6µmol/100g/minO2O2 效应。单独加入0.2mmol/l荷包牡丹碱(n=9)导致PC发射上升到控制水平的147%+15%，同时刺激应答中tpO的变化成为三相，正相之后显示一个新的负脉冲信号(图3B，P=<0.001，2 n=9)。这在一定程度上可以由CeBF应答中一个相应的负脉冲信号和CeMR的延时增长来O2解释(图3B)。 上行神经纤维投射到最近蒲肯野细胞的树突，并且引出一个大的、全有或全无的兴奋型突触后电位，也像LFP一样被记录了下来(图4A)。CFs突触前活动电位对LFP的振幅没有什么重要影响，因为突触前结构细薄、密度低。所以由CF刺激诱发的LFP应答代表突触后细胞的跨膜离子流动，并且由于通过突触后AMPA受体的钠离子内流，一个表示经钙离子门控的钾离子通道的阳离子外流的更小的超级化，构成了一个大的负电位(图4A)。持续的突触兴奋水平不依赖于GABA能受体，这是上行神经纤维-蒲肯野细(CF-PC)神经网络的一个独特性。持续的突触活动由LFP应答标示，和tpO、CeBF一起被记录了下来。图2 4B显示了60ms内150个LFP应答沿y轴和沿x轴的图形，在Z-平面，LFPs的功率由颜色编码，对应X-Y平面用绿色描绘底线，去极化用蓝色，后超级化用黄色或红色。应用蝇蕈醇期间，LFP应答去极化时期振幅的轻微上升表明突触后树突膜持续兴奋对抗GABA能受体上升。(图4B，P=0.012，n=6)。GABA受体激活时产生的超级化引起的跨膜突触电流驱A 动力的上升，可以解释LFP应答振幅的全面上升。相反，后正波的消失(图4B，P<=0.001，n=6)也如前面所描述。重要的是，后正电位的终止表明，伴随CF-PC突触活动，蒲肯野细胞胞内钙离子上升会触发阳离子的外流，会被突触抑制剂所阻塞。图4B阐明了应用蝇蕈醇期间，由树突AMPA受体引发的蒲肯野细胞突触兴奋性(蓝色)会增强。LFP应答的形状和功率在控制刺激和应用荷包牡丹碱期间保持不变。应用荷包牡丹碱时LFP的形状和振幅不变表明控制条下GABA电流的作用太小，我们的胞外微电极无法记录。 A 结论 研究结果表明:突触兴奋刺激突触后细胞组分消耗氧的能力依赖于小脑皮层中的突触抑制水平。我们显示:利用CF—PC线路的独特性能，固定的兴奋输入诱发的耗氧量上升可被突触抑制降低。我们对小脑研究结果也许不能直接应用于大脑，但是大脑皮层中的类似实验不是抑制突触活性(muscimoll)就是触发癫痫(bicuculline)。我们认为突触抑制可能是空间上重新分配能量代谢的机制之一，例如从大脑皮层血管应答的观察数据可知，随包围中心的组织到达网络的活性中心。这种机制可能还在网络中耗氧量上升的时间局限中起积极作用，原始的突触兴奋之后接着是突触抑制，例如，躯体感觉和胼胝体神经纤维系统。我们猜测大脑灰质体中神经网络信号通过神经细胞中一种前推机制耦合钙离子的方式来控制能量代谢。 参考文献(略)