异丙肾上腺素诱导心肌细胞表达β半乳糖苷酶及重要作用

异丙肾上腺素诱导心肌细胞达β半乳糖苷酶及重要作用 南开大学硕士学位论文异丙肾上腺素诱导心肌细胞表达β-半乳糖苷酶及重要作用姓名张万毅申请学位级别硕士专业内科学指导教师唐向东李静20090501摘要摘要目的本实验为了证明心肌细胞是儿茶酚胺诱导产生的半乳糖苷酶的一个重要来源从而为抗炎以及抗心肌纤维化提供新的药物靶点。方法用逆转录检测在成年大鼠心室肌细胞新生鼠心肌成纤维细胞及巨噬细胞系中半乳糖苷酶的表达。用和鼠试剂盒检测异丙肾上腺素刺激后的不同细胞血清和心脏组织匀浆物中半乳糖苷酶的表达。用异丙肾上腺素诱导造心肌炎症和心肌纤维化模型。苏木精伊红染色和天狼星红染色观察组织学变化同时用观察组织学半乳糖苷酶的表达。结果以淋巴细胞系做阳性对照用技术在成年大鼠心肌细胞心肌成纤维细胞以及巨噬细胞系中测得一半乳糖苷酶的表达。用异丙肾上腺素处理大鼠心肌细胞中半乳糖苷酶的活性增强而新生鼠心肌成纤维细胞和巨噬细胞则表达不明显。异丙肾处理后染色并未检测到半乳糖苷酶的变化。皮下注射异丙肾上腺素成功诱导大鼠体内炎症和纤维化模型这被染色和天狼星红染色分别证实。染色也证实异丙肾处理的心肌组织中半乳糖苷酶的表达在心肌细胞中明显看到蓝色沉积物。与以上结果一致异丙肾上腺素处理动物后其心脏匀浆物和血清中的半乳糖苷酶都显著升高。结论异丙肾上腺素能诱导动物和分离的心肌细胞的半乳糖苷酶表达但不能诱导其在心肌成纤维细胞和巨噬细胞中的表达。因此异丙肾上腺素不仅可以诱导唾液酸酶的表达本文中还证实了它能诱导心肌细胞中半乳糖苷酶的表达。因为这两种酶在将蛋白转化为巨噬细胞活化因子过程中发挥重要作用所以本文的实验结果证实了在一些心脏疾病中唾液酸酶和半乳糖苷酶都能作为抗炎和抗纤维化新的药物靶点。关键词半乳糖苷酶异丙肾上腺素心肌纤维化巨噬细胞活化因子—一伊 ——— 嬲缩略词虹—硎吖英汉缩略名词对照表英文全称鹊锄一????’中文全称异丙肾上腺素半乳糖苷酶唾液酸酶逆转录多聚酶链式反应二甲基亚砜单核巨噬细胞趋化性细胞因子蛋白心肌成纤维细胞磷酸盐缓冲液巨噬细胞活化因子。肾素血管紧张素醛同酮系统钙离子通道阻滞剂’平衡盐溶液血管紧张素转换酶抑制剂心肌纤维化转化生长因子一干扰素吖维生素乙酰半乳糖苷酶巨噬细胞集落刺激因子血小板源性生长因子南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名强石狐砷年了月多日南开大学学位论文版权使用授权书本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定同意如下各项内容按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本学校有权保存学位论文的印刷本和电子版并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版在不以赢利为目的的前提下学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名友否教如哆年月邴日经指导教师同意本学位论文属于保密在年解密后适用本授权书。指导教师签名学位论文作者签名解密时间年月日各密级的最长保密年限及书写格式规定如下第一章前言第一章前言心肌纤维化与心脏重构心肌纤维 化是指在心肌的组织结构中胶原纤维过量积聚、其胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著增加。近年来大量研究表明心肌纤维化可发生于高血压、心肌梗死及心力衰竭等许多心血管疾病。它是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变是心脏重构的主要表现之一可致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、冠状动脉储备下降甚至引起猝死引。心肌纤维化表现为心肌胶原浓度显著升高或胶原容积分数高于正常值。根据心肌胶原的组织学特征心肌纤维化可分为型间质纤维化胶原纤维增粗出现在原先没有胶原的肌间隙血管周围纤维化胶原沉积在心肌内冠状动脉的外膜修复性纤维化出现心肌细胞坏死和纤维疤痕灶。为方便起见又根据有无心肌细胞坏死和纤维疤痕出现将心肌纤维化分为反应性纤维化和修复性纤维化前者又包括间质纤维化和血管周围纤维化【。心肌纤维化的发生在细胞和分子水平可分三个环节胞外刺激信号、胞内信号转导及核内基因转录的活化最终诱发心脏成纤维细胞增殖肌样化合成与分泌胶原。在心肌纤维化的过程中最为常见的胞外刺激信号是的效应分子它可经旁分泌、自分泌和胞内分泌等方式作用于胞膜受体【细胞内信号传导通路主要是磷酯酰肌醇激酶蛋白激酶糖元合成激酶系统简称—系统、钙调神经磷酸酶活化细胞内核因子系统简称为系统和蛋白激酶嬲丝裂素活化蛋白激酶系统简称系统后两条通路可相互交叉。心肌纤维化发生机制的研究与防治现状血管紧张素转换酶抑制剂是目第一章前言前治疗心肌纤维化的药物中研究最多结果也较为肯定的一类药物。动物实验及体外培养的成纤维细胞研究表明经治疗或处理后能减少胶原合成预防和逆转一纤维化【。赖诺普利或氯沙坦能够减少自发性高血压大鼠心肌这一结果提示通过减少血管紧张素的生成或阻断其作用可有效逆转心肌纤维化【刀。受体主要有型和型两种。其受体几乎介导全部—的生理功能与绝大部分病理功能因此阻断受体是逆转心肌纤维化的一个重要策略。洛沙坦是选择性非肽类受体拮抗剂中最早进入临床研究的药物它直接作用型受体在高血压心、肾纤维化的动物实验或临床研究中发现它不仅能够控制高血压减少蛋白尿而且能够控制心肾组织局部多种细胞因子的表达如血小板源性生长因子—。等从而延缓心、肾纤维化的进展。醛固酮促进心脏细胞的型和型胶原基因表达使胶原合成增多【】。醛固酮拮抗剂螺内酯除利尿降压外兼有强力的阻抑肾素一血管紧张素醛固酮系统的作用降低心肌间质胶原分泌减缓细胞间质胶原堆积和纤维化进程。还有发现某些钙通道阻滞剂有抗纤维化作用等【猫发现可使由或导致增高的心肌胶原浓度下降抑制的形成。其具体机制可能为细胞内钙离子作为第二信使有促进增殖的作用。另外钙离子还参与某些生长因子的信号传导而这些生长因子又促进的形成。因而可抑的形成抑制心肌间质中胶原的聚积最终防止和减轻。炎症与心肌纤维化目前资料显示许多心血管疾病的发生都与炎症密切相关冠心病的常见危险因素如吸烟、高血压、致动脉粥样硬化脂蛋白、高脂血症都能引起炎症过程。在高血压性心脏病、冠心病心肌梗塞和病毒性心脏病中炎症反应与心肌纤维化并存于病变部位提示炎症与心肌纤维化密切相关。】发现巨噬细胞、细胞、细胞和表达细胞与成纤维细胞共存炎性细胞在高血压大鼠中分布密度高于对照组表达细胞集中在微瘢痕中。巨噬细胞密度与血浆肾素活性和纤维化程度及收缩压相关淋巴细胞密度也与收缩压第一章前言相关。认为血压升高和或肾素血管紧张素活性增强参与炎性细胞的启动信号炎性细胞通过释放生长因子细胞因子作用于成纤维细胞从而促成心肌纤维化。在柯萨奇病毒感染所致的心肌炎模型中【】急性期胶原已经增生其作用是修复坏死的心肌恢复期存在修复性纤维化和反应性纤维化两 种胶原增生状态慢性期胶原蛋白增生为单纯的反应性纤维化感染后通过直接作用和或免疫介导引起心肌细胞损伤和心肌纤维化免疫系统主要是淋巴细胞在其中表现出复杂的作用。在感染所致的病毒性心肌炎早期淋巴细胞首先充当病毒攻击的靶细胞其后将病毒扩布到其他组织器官淋巴细胞既可以抗病毒复制又可以通过释放穿孔素导致严重而广泛的炎症反应引起心肌组织瘢痕形成而淋巴细胞则表现出抗心肌纤维化的作用。巨噬细胞与心血管系统的炎症反应等【早就发现巨噬细胞在炎症反应中发挥重要的作用。巨噬细胞表面具有单核巨噬细胞趋化性细胞因子蛋白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和丫干扰素—等细胞因子的受体故此巨噬细胞能与感染部位组织细胞产生的、、、等细胞因子结合而被募集到感染部位并被活化使其吞噬杀菌能力显著增加。与此同时活化巨噬细胞又可通过以下途径参与并促进炎症反应分泌巨噬细胞炎症蛋白、和等趋化性细胞因子募集、活化更多的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞发挥抗感染免疫作用分泌多种促炎细胞因子如和一和其他低分子量炎性介质如前列腺素、白三烯、血小板活化因子和多种补体成分等参与和促进炎症反应分泌【和一系列胞外酶如溶菌酶、胶原酶、尿激酶、弹性蛋白酶等增强集体抗感染免疫作用和使机体组织细胞免于发生损伤。实验研究表明裸鼠胸腺缺乏在感染诱导的肺部炎症程度强于鼠炎症浸润以单核细胞为主这一结果证实了巨噬细胞可直接引发炎症。自发性高血压大鼠心肌纤维化和巨噬细胞关系的研究将大鼠心肌中巨噬细胞数目分别与、含量作相关发现大鼠心肌中巨噬细胞数目分别与、第一章前言呈『相关相关系数分别为、提示巨噬细胞可能在自发性高血压太鼠心肌心肌纤维化发生发展中具有重要作用。巨噬细胞激活因子与巨噬细胞的激活巨噬细胞引起炎症反应之前必须被激活其中是强的激活物称为巨噬细胞激活因子。早期研究显示给小鼠注射峙的溶血卵磷脂—可有效地激活巨噬细胞这种激活需有淋巴细胞、淋巴细胞和】结合蛋白蛋白又称蛋白的参与。循环于血液中的蛋白在其??末端通过一个乙酰半乳糖残基分别连接一个半乳糖和唾液酸图后来研究发现首先刺激细胞产生一半乳糖苷酶该酶在去除半乳糖后使蛋白变成种前激活因子后者又在细胞产生的唾液酸酶的作用下变成巨噬细胞激活因子在晚期癌症病人癌细胞能释放一乙酰半乳糖苷酶—后者则因去除??乙酰半乳糖而使失活从而不能激活巨噬细胞由此导致免疫抑制与肿瘤进展和转移阻”。国蛋白檄活成尽管细胞和细胞分别被认为是唾液酸酶与半乳糖苷酶的来源但在敲除、细胞的小鼠其心肌炎症反应与纤维化并不受到明显影响提示这两种酶另有来源。在心肌组织中能产生这些酶的细胞可能包括心肌细胞成纤维细第一章前言胞和巨噬细胞已有文献报道用异丙肾上腺素刺激原代培养大鼠心肌细胞及心肌细胞系均使唾液酸酶含量升耐。在本实验中我们将对半乳糖苷酶的来源进行追踪我们的结果显示半乳糖苷酶在心肌细胞成纤维细胞和巨噬细胞均可测出在使用后心肌细胞的半乳糖苷酶活性增高。在体实验显示诱发心脏组织炎症与纤维化伴随半乳糖苷酶活性增高。结果提示心肌半乳糖苷酶可以成为潜在的抗炎抗纤维化新药靶点。第二章实验与方法第二章实验材料与方法实验材料实验动物和细胞本实验选用体重—的健康大鼠雌性级。购自中国医学科学院核医学研究所实验动物中心。乳鼠天购自中国人民解放军军事医学科学院实.