奥卡西平对戊四氮致痫幼鼠神经保护作用研究（可编辑）

奥卡西平对戊四氮致痫幼鼠神经保护作用研究（可编辑） 福建医科大学 硕士学位论文 奥卡西平对戊四氮致痫幼鼠神经保护作用的研究 姓名:周俊香 申请学位级别:硕士 专业:儿科学 指导教师:陈琅 2011-05 奥卡西平对戊四氮致痫幼鼠神经保护作用的研究 中文摘要 目的研究戊四氮慢性点燃癫痫幼鼠海马 NSE、GFAP、NCAM 的达变化,及奥 卡西平(oxcarbazepine,OXC)对其表达的影响,探讨癫痫引起的神经损伤机 制, 和 OXC的神经保护作用及其机制。 方法 50 只 21日龄 SD幼年雄性大鼠随机分为 5组,各 10只, A组(阴性对照 组)、 B组(阳性对照组)、C 组(OXC 低剂量组)、D 组(OXC中剂量组)、E 组(OXC 高剂量组)。 A组每日腹腔注射等量生理盐水; B组每日腹腔注射戊四氮 40mg/kg; C~E组每日腹腔注射戊四氮 40mg/Kg后分别予 OXC100mg/Kg、 OXC200mg/Kg、 OXC300mg/Kg 灌胃。连续用药 21 日,观察幼鼠体重、行为学表现;采用免疫 组织化学方法检测各组幼鼠海马区 NSE、GFAP、NCAM 阳性细胞的表达;应用 Real Time PCR方法检测各组幼鼠海马组织中 GFAPmRNA、NCAMmRNA 的表 达。 结果1.行为学观察:戊四氮腹腔注射幼鼠均出现不同程度的痫性发作,造模 成功。 C~E组幼鼠较 B组癫痫发作潜伏时间延长,发作级别低,点燃率低,死亡率低 (P<0.01) ; 2.体重观察: E组幼鼠较其他各组体重增长缓慢(P<0.05); 3.免疫组化结果:A组幼鼠海马组织 NSE、GFAP、NCAM表达很少。 B组 表达均呈强阳性(P<0.01,P<0.01,P<0.05),C~E组 NSE、GFAP、NCAM 阳性细胞数量减少,胞浆淡染,免疫原性减弱(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。 但 D、E组 NSE、GFAP、NCAM 表达均无统计学差异(P?0.05)。相关: NSE、GFAP、NCAM 的表达与 OXC的剂量分别呈负相关(P<0.05,P<0.05, P<0.05)。 4. Real Time PCR结果:A组幼鼠海马组织 GFAPmRNA、NCAMmRNA表 4达甚微。B 组均表达增加(P<0.01, P<0.05)。C~E 组表达均降低(P<0.05, P<0.01)。D、E组表达量均无统计学差异(P?0.05)。相关分析:GFAPmRNA、 NCAMmRNA的表达与 OXC的剂量分别呈负相关(P<0.05, P<0.05)。 结论 1.戊四氮化学点燃慢性癫痫动物模型是研究癫痫活动的理想模型。 2. 神经元坏死、星形胶质细胞的活性、突触可塑性与癫痫活动密切相关。 3.奥卡西平可能通过抑制 NSE、GFAP、NCAM 的表达,抑制神经元坏死、 星形胶质细胞的活化及突触重建,从而有效地保护癫痫引起的脑损伤。 4.奥卡西平的神经保护作用具有剂量依赖性,但超过一定剂量,这种作用并 不再增强,且大剂量奥卡西平可能影响幼鼠生长。 关键词 癫痫;奥卡西平;神经元特异性烯醇化酶;胶质纤维酸性蛋白;神 经细胞粘附分子;神经元坏死;星形胶质细胞;突触重建5Neuroprotective Effects of Oxcarbazapin on Young Rats with Chronic Epilepsy Induced by Pentylenetetrazole Abstract Objective By exploring the changes of NSE、GFAP、NCAM in hippocampus of young epilepsy rats induced by pentylenetetrazolePTZ,and the effects of oxcarbazepineOXC on there expression, in order to investigate the nerve damage mechanism caused by epilepsy, and neuroprotective effects and its mechanism of OXC Methods 50 male SD rats around 21 days of age were randomly divided into 5 groups: group Anegative control group、group Bpositive control group 、group C low-dose OXC group 、group D medium-dose OXC group 、group Ehigh-dose OXC group , and each group had 10 rats. Group A were intraperitoneal injectedIP. the equal amount of normal saline everyday; Group B were IP PTZ 40mg/kg day, Group C~E were irrigate into stoach successively with OXC100mg/Kg、 200mg/Kg、300mg/Kg before injected PTZ 40mg/kg?day. After twenty-one days, changes of body weight, behavioral performance were recorded, and the level of NSE、 GFAP、NCAM and GFAPmRNA 、 GFAPmRNA in hippocampus were examined by immunohistochemisty and Real Time PCRResults1.All epileptic rats had epileptic attacks in higher or lower degree,proving that the method to make rats epileptic model is successful. Compared with group B, latent time and degree of epileptic seizures induced by PTZ were respectively prolonged and alleviated in groups C~EP<0.012. The growing of body weight of young rats in group E was slowly compared to each other groupP<0.013. Immunocytochemistry showed that there was nothing much immunopositive cells with NSE、GFAP and NCAM in hippocampus of young rats in group A,and the 6expression of them in hippocampus increased dramatically in group B(P<0.01,P <0.01, P<0.05) , the expression of them were depressed in groups C~E P<0.05,P <0.05,P<0.05. But there was no statistically significant differences in group D and E(P?0.05).The correlation analysis showed negative correlation between the expression of NSE、GFAP、NCAM and the dose of OXC(P<0.05,P<0.05,P <0.05)4. Real Time PCR indicated that the expression both of GFAPmRNA and NCAMmRNA in hippocampus of young rats in group A was much lower,and adramatically increased was found in group B(P<0.01,P<0.05), the expression of them were depressed in groups C~E P<0.05,P<0.05. But there was no statistically significant differences in group D and E(P?0.05). The correlation analysis showed negative correlation between the expression of GFAPmRNA 、 NCAMmRNA and the dose of OXC(P<0.05,P<0.05,P<0.05)Conclusion 1. The modle of young rats of epilepsy induced by PTZ was a ideal model to explore Epilepsy activities 2. Neurons necrosis、the activity of astrocytes and synaptic reconstruction may play a important role in epilepsy 3. OXC could lessen the expression of NSE、GFAP and NCAM, inhibit neurons necrosis、 astrogliosis and synaptic reconstruction,may have neuroprotective effcts against brain damage caused by PTZ kinding epilepsy in young rats4. The neuroprotective effcts of OXC may relate to the dose of OXC. High dose of OXC may restrain the growing of young rats Key words: epilepsy; oxcarbazapine; NSE; GFAP; NCAM; neurons necrosis ; astrocytes;synaptic reconstruction7英文缩略词表 英文缩写英文全称 中文对照 AEDsanti-epileptic drugs抗癫痫药物 Ast astrocyte 星形胶质细胞 CNScentral neverous system中枢神经系统 DAB diaminobenzidine 二氨基联苯胺 DEPC diethyl pyrocarbonate 二乙焦炭酸盐 DG dentate gyrus 齿状回 GFAP glialfibrillaryacidic 胶质纤维酸性蛋白 protein IOD intensity optial density 光密度 IP intraperitoncalinjection 腹腔注射 MFS mossy fiber sprouting 苔藓纤维出芽 NCAMnerve cell adhesion 神经细胞黏附分子 moleculer NSE neuron specific enorlase 神经元特异性烯醇化酶 OXCoxcarbazepine奥卡西平 Real Time PCR Real Time polymerase 实时荧光定量聚合酶链 chain reaction 式反应 PBS phosphate buffered saline 磷酸缓冲液 PTZ pentylenetetrazole 戊四氮 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 SD Sprague Dawley 斯泼累格?多雷远交群 SP streptavidin peroxydase 链亲和素-过氧化物酶 SRS spontaneous recurrent 自发性反复发作性癫痫 seizures 3学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究 工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名(手写):__________ 导师签名(手写): ___________ ____________年____月____日 ____________年____月____日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借 阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 作者签名(手写):__________ 导师签名(手写): ___________ ____________年____月____日 ____________年____月____日 1引言 癫痫是一种常见的慢性临床综合症,主要起病儿童时期,其发病机制至今尚 未完全明了。理想的抗癫痫药不仅应具有强大的抗癫痫作用,同时较小的副作用, 也应具有神经保护作用,提高患者的生活质量。目前对奥卡西平oxcarbazepine, [1-2] OXC的研究很多,有人对肿瘤相关性癫痫患者做了回顾性研究发现 ,新型抗 癫痫药 OXC不仅治疗作用上优于传统抗癫痫药,副作用明显减少,且对于症状 性癫痫的治疗效果优于隐源性癫痫。但这种评价仅限于症状学,尚不能证明有组 织上差异,本文试图从组织、分子水平探讨 OXC的神经保护作用。 神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enorlase,NSE )是烯醇酶的 γγ同工 酶,在中枢神经系统中,特异性存在神经元胞浆中。在癫痫持续状态和癫痫反复 发作后,血中 NSE 明显升高,提示癫痫发作后有神经元损害。神经胶质细胞是 神经系统数量最多的细胞,维系着正常的神经功能,占主要成分的星形胶质细胞 (astrocyte,Ast)在其中发挥了重要的作用。当中枢神经损伤时,Ast 被激活, 表现为胞体肥大、突起增多延长、胶质纤维酸性蛋白 glial fibrillary acidic protein, GFAP表达增强,很多研究发现 Ast 参与了癫痫的发病机制,但对于 Ast 的具体 作用,尚不清楚。神经细胞黏附分子(nerve cell adhesion moleculer, NCAM) 免 疫球蛋白家族成员,介导神经细胞识别、黏附和迁移的细胞表面糖蛋白,对于轴 突生长、突触重建和神经元环路形成起到重要作用。在众多脑损伤、脑缺血、神 经系统退行性病变的研究中发现,NCAM 与神经元发生有密切联系,且 NCAM [3] 表达上调提示了疾病的严重程度 NCAM 的表达变化对脑损伤早期的敏感性。 本实验采用戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)腹腔注射幼鼠建立慢性点燃癫 痫模型,应用免疫组织化学的方法研究癫痫的易损伤区海马组织 GFAP、NCAM 蛋白的表达,并运用 Real Time PCRReal Time polymerase chain reaction , 实时荧 光定量聚合酶链反应 相对定量检测 GFAPmRNA、NCAMmRNA 蛋白的表达变 化,来探讨慢性点燃癫痫形成过程中神经损伤的程度和机制,及 OXC的神经保 护作用及其机制,为进一步癫痫的临床治疗提供理论依据。 8第一节 材料与方法 1.材料 1.1.实验动物 清洁级斯泼累格?多雷远交群(Sprague Dawley ,SD)大鼠 50只,21日龄, 体重 50~60g, 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证编号: 2007000500533 1.2.药品及试剂 戊四氮(Sigma,the U.S.A.,lot:028K0735,每次实验前用灭菌注射用水配置 成 5mg/ml 浓度) 奥卡西平(口服混悬液)(Novartis,Switzerland,lot:H5367) 羊抗鼠 GFAP蛋白免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号: PV9001) 羊抗鼠 NSE 蛋白免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司,货号: bs-1027p) 鼠单克隆抗体 NCAM 免疫组化试剂盒(福州迈新生物科技有限公司,货号: SC-101349) Real Time PCR试剂盒(TaKaRa,Japan,code:DRR063A) Trizol(invitrogen,厦门泰京生物技术有限公司,lot:1392923) 二乙焦炭酸盐(diethyl pyrocarbonate ,DEPC) (BIOSHARP,lot:201108) Easy Dilution(TaKaRa,code:D9160) TM TM Vision (KIT-5004 Vision HRP-Polymer anti- rabbit IHC Kit) 三氯甲烷(即氯仿,上海试一化学试剂有限公司,货号:84002) 异丙醇(广东西陇化工厂,货号:0110262) 10%水合氯醛福建省立医院药剂科 10%甲醛(分析纯,上海试剂一厂) 去离子水(福建省立医院心血管研究所) 多聚磷酸缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司) 9灭菌注射用水(福建汇正药业有限公司) 0.9%氯化钠溶液(福建汇正药业有限公司) 75%乙醇(福建汇正药业有限公司) 95%乙醇(福建汇正药业有限公司) 100%乙醇(上海振兴化工厂) 二甲苯(上海试剂一厂) 苏木精染剂(上海振兴化工厂) 中性树胶 1.3.主要仪器及设备 手术台、手术刀、止血钳数把、小弯镊数把、剪骨钳一把、5mL 注射器等 开颅手术器械一套 一次性刀片(日本羽毛牌) 隔水式电热恒温培养箱(福州医疗电子厂,型号:HHBH500) 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,型号:DHG-9023A) 生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司, 型号:JK-5) 电子恒温水温箱(上海福玛设备有限公司,型号:PM) 包埋专用冷冻台(湖北泰康达医疗设备有限公司,型号:0905418) 石蜡切片机(Leica,Germany,型号:RM2245) 自动脱水机(Thermo Fisher,型号:Pathcentre) 显微镜(Olympus,型号:CH2O) 显微数码摄像系统(Olympus,型号:BX51TE) 防脱玻片及盖玻片(北京中杉金桥生物技术有限公司) 台式离心机(中佳,SC-3160) 低温高速离心机(HERAEUS,Germany,BIOFUGE) 超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司,VS-1300) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time Syetem Germany,TP800 单温度 PCR仪(EPPENDORRF,Germany, Personal) 核酸蛋白分析仪(BECKMAN,U.S.A.,DU640) 10精密电子天平(SARTOEIUS,Germany,BS201S) 普及型电子天平(河南兄弟仪器设备有限公司,HZF-A600) 超低温冰箱(SANYO,Japan,MDF-382E) 低温冰箱(Electrolux,瑞典,BCD-277) 陶瓷研钵(直径 5cm,北京中杉金桥生物技术有限公司) 1~10 μL微量移液器及枪头(Finnpipette) 10~100μL 微量移液器(Finnpipette) 100~1000 μL微量移液器(Finnpipette) 各种 EP管及枪头 1.4.所用软件 图像采集系统(SPOT3.0) 专业图像分析系统(Image Pro Plus 6.0) 统计软件(SPSS17.0) 2.方法 2.1. 实验分组 清洁级近交系 19日龄雄性 SD大鼠 50只,体重 50-70g,置于福建省立医院 动物饲养 2d,自由摄食、水,室内温度 22?,相对湿度 60%-70%,12h 照 明。采用随机数字表法,将实验动物分为分为 5组,各 10只: A组:阴性对照组(生理盐水组),不建立模型,不干预; B组:阳性对照组(戊四氮组),建立模型,不干预; C组:奥卡西平低剂量组(100mg/kg),建立模型并干预; D组:奥卡西平中剂量组(200mg/kg),建立模型并干预; E组:奥卡西平高剂量组(300mg/kg),建立模型并干预。 2.2.1.慢性癫痫点燃动物模型的建立[5] 每日 9 时,B 组、C 组、D 组、E 组按 40mg/Kg(浓度 10mg/ml) 腔注射 戊四氮; A 组腹腔注射同等剂量生理盐水。每组予戊四氮后观察 1 小时, 幼鼠癫痫发作行为学表现。根据 Racine 分级,凡连续 5 次 2 级以上的发作即判 定该鼠被慢性点燃。此后戊四氮腹腔注射由 1次/日,改为 1次/2~3日,以维持 11点燃效应。 [6] 附:癫痫发作 Racine分级 : 0级,无任何反应; 1级,胡须抖动,面肌抽动; 2级,点头、咀嚼或湿狗样抖动; 3级,一侧前肢抬起,阵挛; 4级,站立伴有双侧前肢阵挛; 5级,跌倒,全身强直阵挛性发作,或抽搐致死。 2.2.2.干预方法 每日各组给药前均称重,具体如下: A组,每日腹腔注射等量生理盐水,不给药; B组,每日上午 9:00腹腔注射戊四氮 40mg/kg,不给药。 C组、D组、E组每日 8:00灌胃予奥卡西平分别按 100mg/Kg、200mg/Kg、 300mg/Kg 剂量的一半灌胃预处理,一小时后腹腔注射戊四氮 40 mg/kg,观 察 1h, 记录幼鼠的行为学表现;至 20:00再灌胃予奥卡西平当日剂量的一半,如此 进 行,连续 21d。 3.取材方法 (1)麻醉。10%水合氯醛按 3ml/kg腹腔注射幼鼠。 (2)抽血。用剪骨钳剪开胸骨,5mL注射器从左心室进针,抽血 2~3mL。 (3)取脑。断头后,用剪骨钳沿颅正中缝剪开颅骨,剪破脑膜,止血钳游 离脑组织。 (4)分离海马。手术刀沿正中矢状线将整个大脑切成两半,右侧大脑用眼 科镊仔细分离海马组织。 (5)分装、冻存。将分离好的右侧海马迅速置于已加入 Trizol 细胞裂解液 的冻存管内,立即放入液氮灌内速冻 1min,转存在-70?超低温冰箱,待用。 (6)制备蜡块。另左侧大脑将其在距额极 2mm 和距尾级 1mm 处各切一刀, 取中间段,置 4%多聚甲醛中固定 24h,常规脱水,透明,浸蜡,包埋,石蜡切 片。 124.幼鼠海马免疫组织化学染色 4.1. NSE 与 GFAP 免疫组织化学染色(streptavidin peroxydase,SP法) (1)每组各取 10只大鼠的石蜡切片,片厚 3 μm,63?烤箱烤片 2h; (2)常规二甲苯脱蜡(旧松节油 10min?新松节油5min) ,梯度酒精水化(依 次:100%乙醇5min?95%乙醇5min?85%乙醇5min?75%乙醇5min)。 (3)每张切片加50 μl3%过氧化氢去离子水室温孵育 10min,以阻断内源性 过氧化物酶的活性。磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲 洗,2min ×3次; (4)一抗稀释后,每张切片滴加50μl,37?孵育 1h,PBS冲洗,2min×3 次; (5)每张切片滴加 50μl试剂 1(聚合酶辅助物),37?孵育 20min,PBS 冲洗,2min×3次; (6)每张切片滴加50 μl试剂 2(辣根过氧化物酶),37?孵育 20min,PBS 冲洗,2min×3次;(7)100 μl 新鲜配制的二氨基联苯胺 (diaminobenzidine,DAB)溶液显色 5min,光镜下观察,自来水充分冲洗; (8)苏木精复染 3min,水冲洗 2min,盐酸分化 1s,水冲洗 5min; (9)常规脱水(75%乙醇 5min?85%乙醇 5min?95%乙醇 5min?100%乙醇 5min),二甲苯透明,烤片,中性树胶封片,光镜观察。 4.2.神经细胞 NCAM免疫组化染色 (1)每组各取 10只大鼠的石蜡切片,片厚 3 μm,63?烤箱烤片 2h; (2)常规二甲苯脱蜡(旧松节油 10min?新松节油5min) ,梯度酒精水化(依 次:100%乙醇5min?95%乙醇5min?85%乙醇5min?75%乙醇5min)。 (3)柠檬酸(pH6.0)高压 1.5min 对组织进行抗原修复, PBS冲洗, 4min ×3次; (4)每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢,室温下孵育10分钟,以阻断内 源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗,4min×3次; (5)第一抗体稀释600倍后,每张切片加50 μl,室温下孵育60min。PBS冲 13洗,4min×3次; TM (6)每张切片加50μl 即用型Vision ,室温下孵育15min,PBS冲洗, 4min×3次; (7)每张切片加100μl新鲜配制的DAB显色液,显色 5min,光镜下观察, 自来水充分冲洗; (8)苏木精复染 3min,水冲洗 2min,盐酸分化 1s,水冲洗 5min; (9)常规脱水(75%乙醇 5min?85%乙醇 5min?95%乙醇 5min?100%乙醇 5min),二甲苯透明,烤片,中性树胶封片,光镜观察。 5Real Time PCR5.1. 总 RNA的提取 (1)取 100g海马组织置于液氮充分预冷的陶瓷研钵内,用研磨棒轻轻敲碎, 并防止其弹出钵外,待其敲成小碎块后迅速研磨,至肉眼看不到粉末为止此 过程 应不断添加液氮。 (2)向研磨成粉末状的组织中加入 1mLTrizol溶液,并完全覆盖样品。 (3)室温静置 5~10min,使 Trizol 与组织充分反应。 (4)待样品完全融化后,用研磨棒继续研磨至裂解液呈透明状。将刀浆移至 2个 1.5mL 离心管中,室温静置 5min。 (5)加入 1/5体积氯仿,剧烈震荡,至溶液完全乳化,无分相现象。 (6)室温静置 5min,4?,12000rpm离心,15min。 (7)从离心机小心取出离心管,此时刀浆分三层:上层是透明的水层,RNA 溶解在此层;半固体状的中间层,此层包含 DNA;下层是粉红色的有机溶剂, 蛋 白质、多糖溶解在次层。 (8)把上层溶液小心转移至新的离心管中,每管约 400~500 μL。注意:切 勿吸到中间层,宁少勿多。 (9)加入等体积异丙醇,上下颠倒混刀,室温静置 10min。 (10)4?,12000rpm离心,15min。 (11)弃上清,留离心管底部的白色沉淀,每管加入 1mL 预冷的 75%乙醇 (100%乙醇:DEPC 水3:1) ,将管底的 RNA轻轻弹起,上下颠倒,清洗沉淀。 14(12)4?,12000rpm离心,15min。 (13)可在管底观察到少量白色沉淀,弃上清,用移液器吸除少量上清,室 温通风干燥 10min。 (14)加入 20μLDEPC 水(已高压)溶解 RNA。如不溶可在 65?温箱放置 10min,再冰上放置。 (15)RNA溶液置于-70?冰箱保存,待用。 5.2. RNA的检测 5.2.1. 吸光度测定方法 (1)用TE按1:100稀释RNA溶液(原始浓度RNA2μL+TE198 μL) (2)测量260nm,280nm和320nm三处波长的吸光度 (3)计算 RNA浓度(ug/μL)OD260-OD320×0.04ug/μL×稀释倍数RNA纯度 OD260/OD280 总 RNA收量(ug)RNA浓度ug/ μL×20 5.2.2. 凝胶电泳方法 (1)取 5 μLRNA原液至一个 1.5mL的 EP管中,使用 RNase Free dH2O 将其稀释至 100ng/ μL。需 RNase Free dH2O 体积( μL)[5 μL×RNA 浓 度 3 ug/μL×10 /100(ng/ μL)。 (2)取 10 μLRNA(100ng/ μL)至一个 1.5mLEP管内。 (3)每组共用一管 10μL Control RNA(100ng/ μL) (4)70?水浴2min,立即将水浴后的EP管放置在冰上。 (5)向每管加入2μL 6×Loading Buffer,混合均刀 (6)琼脂糖凝胶电泳。 5.3. GFAP Real Time PCR5.3.1 反转录 反应体系: RNase Free dH2O1.5 μl Oligo d T Primer 0.5 μl 15Random 6 mers0.5 μl 5×PrimeScript Buffer 2.0 μl EnzymeMix 0.5 μlTotal RNA5.0 μlReaction mix total 10.0 μl 反应条件: 37?15min 35?5s 4? ? 反应结束后,将产物 cDNA置超低温冰箱(-70 ?)保存待用。 5.3.2. Real Time PCR GFAP引物由大连宝生物有公司设计并合成: F: 5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’; R: 5’-TTTAATGTCACGCACATTTC-3’; 管家基因( β-action)引物由大连宝生物工程有公司设计并合成: F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 反应体系: RNase Free dH2O 9.5 μl PCR Forword Primer10 μM0.5 μl PCR Reverse Primer10 μM0.5 μl SYBR Premix Ex Taq2× 12.5 μl cDNA 2.0 μl total25.0 μl 反应条件TP800PCR 仪: Patten 1(预变性): 95? 30s Patten 2(PCR反应,40 cycles): 95?5s60? 30s 16Patten 3: Dissociation Curre 5.4.NCAM Real Time PCR5.4.1.反转录 反应体系同 GFAP的反转录体系。 反应条件同上。 反应结束后,将产物 cDNA置超低温冰箱(-70 ?)保存待用。 5.4.2. Real Time PCR NCAM引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成: F: 5’-ACAGCGGTGAACCGTATTGGA-3’; R: 5’-ACAGCGGTGAACCGTATTGGA-3’; 管家基因( β-action)引物由大连宝生物工程有公司设计并合成: F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 反应体系: RNase Free dH2O 9.5 μl PCR Forword Primer10 μM0.5 μl PCR Reverse Primer10 μM0.5 μl SYBR Premix Ex Taq2× 12.5 μl cDNA2.0 μl total 25.0 μl 反应条件TP800PCR 仪: Patten 1(预变性): 95? 30s Patten 2(PCR反应,40 cycles): 95? 5s60? 30s Patten 3: Dissociation Curre 6.图片结果判定 每个蜡块取 3 张片,每张片取 400 倍 3 个视野,使用 Olympus 图像采集 系 统,应用 Image Pro Plus6.0软件对各组海马随机抽取 5个不相重叠的 400 倍视野 17测量积累光密度值(intensity optial density, IOD)进行图像分析。7. 主要观察指标 (1)幼鼠行为学改变(癫痫发作潜伏时间、发作级别、发作持续时间、点 燃率、死亡率); (2)幼鼠体重增长变化情况; (3)幼鼠海马组织中GFAP及NCAM的染色强度及阳性细胞数; (4)幼鼠海马组织中 GFAPmRNA 及 NCAMmRNA 的表达变化。8.数据分析与统计方法数据均采用 SPSS17.0 软件处理,数据以 ?S 表示。多组样本均数比较采用 完全随机设计的单因素方差分析(one way analysis of variance,One Way ANOVA),并进行方差齐性检验,均数的两两比较采用(least significance difference,LSD)或 Dunnett(方差不齐时)检验,其中组内 GFAPmRNA 与 NCAMmRNA 的两两比较采用配对 t 检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。相 关分析采用直线相关(bivariate correlation) ,α 0.05 为检验标准,P0.05为差 异有统计学意义,相关系数 r 值正为正相关,r 值负为负相关,r 值零为零相关。 第二节 结果 1.幼鼠行为学改变 A组幼鼠注射生理盐水后,行为无异常。B组注射 PTZ 后 1h内,幼鼠出现 2?5 级痫性发作,表现为阵发性凝视、呆滞、湿狗样颤动,并出现自动症,如 重复、刻板点头、咀嚼等,伴有面部抽动、惊厥;一侧前肢震颤和持续性点头, 双前肢震颤加重,翻滚,跳跃;严重发作者衰竭死亡。约 14 天后,B 组幼鼠普 遍被慢性点燃。与 B组相比, C、D、E组点燃率低(0%~10%),死亡率低(0%~10%), 且在癫痫发作潜伏时间上差别均有统计学意义(P<0.05)(表 1)。C 组与 D 组 之间癫痫发作潜伏时间较短,有显著性差异(P<0.05)(表 1)。D 组与 E 组癫 痫发作潜伏时间差别无显著性(P>0.05) ,但 E 组出现点燃 1 只、死亡 1 只幼 鼠。 18表1 各组大鼠癫痫发作比较(n10, ?S) 分组例数 潜伏时间(min) 点燃率% 死亡率% A组10 ? ? 0 ? B组102.4?0.710020 *? C组106.5?1.7 0 0 * D组10 11.7?2.00 0 *? E组109.4?1.7 1010 F值39.6 P值0.000 ? 与 B组比较,* P<0.01;与D组比较 P<0.05 2. 各组幼鼠体重的变化 各组大鼠在 21内体重均有增长,且呈逐渐加快趋势。与 A组相比,B、C、 D幼鼠体重增长与 A组无明显差异(P>0.05);E组幼鼠体重增长缓慢,14d、 21d增长的体重明显少于 A组(P<0.01,表 2,图 1)。 表 2. 各组幼鼠体重的增长g, ?S)不同时间点体重净增长g 21天体重组 别例数 初始体重(g)7d 14d21d总增长(g) A组 10 55.7?3.0 34.8 47.668.5151.1 ?19.5B组 8 54.5?3.4 25.5 59.557.0 142.6?32.0C组 10 56.9?2.3 34.8 48.071.6 154.3?14.5D 组 10 55.5?3.2 32.5 57.370.9 160.7?7.6* E组 9 52.5?2.8 34.0 30.738.4 103.1?17.3 F值13.2P值 0.000 * E组与其他各组之间均有显著性差异, P<0.05 19图1 各组幼鼠21日体重增长变化 250 A组 200 B组 150 C组 100 D组 50 E组 0 时间(d)3. 免疫组织化学染色结果 3.1.NSE在海马组织的表达 A组仅有少量神经元染色呈阳性,胞浆中出现棕黄色颗粒,细胞膜完整,核 圆,核仁清晰。神经胶质细胞呈阴性。NSE 阳性细胞胞浆较少,突起不明显, 阳性物位于胞浆内。 B组大鼠海马内出现大量 NSE阳性细胞,以 CA3区较 明显, 排列紊乱,细胞肿胀、丢失,免疫原性强弱不等,有的染色加深,有的染色变 淡, 细胞核未着色,这些阳性细胞形态不规则,自胞体向四周,发出多个短、粗大 的 突起。B组 NSE阳性细胞数大于对照组(P<0.01)。 C、D、E组 NSE阳性细胞数较 B组减少,染色较淡,胞质及突起着色均匀, 但形态略有差异,偶见细胞膜破坏,有统计学差异(P<0.01)。C组较 D组,阳 性细胞较多,染色较强,差异有统计学意义(P<0.01)。而 D组与 E组比较, 均无显著性差别(P>0.05)。(表3,图2) 表 3 各组海马 NSE阳性细胞的积累光密度值(IOD)比较( ?S) 组别例数 海马组织?? A组 10 49.07?7.96*? B组 8 186.71?12.45 *?? C组 10 142.06?10.32 ? * D组 10 93.71?6.11 *? E组 9 99.28?11.44 F值357.532 P值 0.000 ? ? 与 A组比较,* P<0.01;与B组比较, P<0.01;与 D组比较 P<0.01 20 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 体重(g) A BCD 图2-A A组海马NSE DAB呈色×200 图2-B B组海马NSE DAB呈色×200 图2-C C组海马NSE DAB呈色×200 图2-D D组海马NSE DAB呈色×200E 图2-E E组海马NSE DAB呈色×200 3.2.GFAP 在海马组织的表达 各组大鼠海马的 GFAP阳性细胞数以 A组最少,B 组最多。与 A组比较, B组大鼠海马各区均见 GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞,数量明显增多,免 疫反应性增强,胞浆深染呈棕褐色,细胞形如蜘蛛,周围有放射状突起,突起粗 大不规则,分支增多。可见细胞水肿,表现为胞体增大,胞浆淡染,胞核染色深, 有的内有空泡,存在显著性差异(P<0.01,表 4) 。与 B组比较,A、C、D、E 21各组阳性细胞数量减少,免疫原性减弱,着色浅淡,存在显著性差异(P<0.05, 表 3)。C组较D组,阳性细胞较多,染色较强,差异有统计学意义(P<0.05)。 而D组与E组比较,均无显著性差别(P>0.05)。(表4,图3) 表 4 各组海马内 GFAP表达的积累光密度值 IOD( ?S) 组别例数 海马组织 ?? A组 10 24.12 ?3.02 *? B组 8 59.40?4.50 ??* C组 10 43.37?4.84 *?D组 10 35.92?4.10 *?E组 9 33.32?4.06 F值 55.7 P值 0.000 ? ? 与 A组比较,* P<0.01;与B组比较 P<0.05;与D组比较, P<0.05 ABCD 22图3-A A组海马GFAP DAB呈色×200 图3-B B组海马GFAP DAB呈色×200 图3-C C组海马GFAP DAB呈色× 200 图3-D D组海马GFAP DAB呈色×200E 图3-E E组海马GFAP DAB呈 色×200 3.3.NCAM 蛋白在海马组织 DG区的表达情况 各组大鼠海马 DG区的 NCAM 阳性细胞数以 A组最少,B组最多。与 A 组 相比,在光镜下观察 B组 NCAM 免疫反应阳性细胞数量明显增多,免疫反应 性 增强,胞浆深染,呈棕褐色,存在显著性差异(P<0.01,表 4)。C、D、E 各 组,NCAM 阳性细胞数量增多,GFAP免疫原性增强,着色稍深,存在显著性差 异P0 01。与 B组相比,A、C、D、E组 NCAM 阳性细胞数量减少,GFAP免 疫原性减弱,着色浅淡,差异有统计学意义(P<0.05)表 4)。C 组较 D 组, 阳性细胞较多,染色较强,差异有统计学意义(P<0.05)。而D组与E组比较, GFAP阳性细胞数量与染色强度,无显著性差别(P>0.05)表 4,图 3-A~E)。 表 5 各组海马 NCAM表达的积累光密度值(IOD)( ?S) 组别 例数 DG区 ?? A组 1012.64 ?2.90 *? B组8111.89 ?3.95 ?? * C组 10 83.18?8.97 *? D组 10 60.32?8.26 *? E组9 58.02?7.20 F值264.276 P值 0.000 ? ? 与 A比较, * P<0.01;与 B组比较, P<0.05;与 D组比较 P<0.05 23 A B C D 图4-A A组海马NCAM DAB呈色×200 图4-B B组海马NCAM DAB 呈色×200 图4-C C组海马NCAM DAB呈色×200 E 图 4-D D 组海马 NCAM DAB 呈 色×200 图4-E E组海马NCAM DAB呈色×200 3.4 各组幼鼠海马内 NSE、GFAP与 NCAM 表达IOD的比较 幼鼠海马内NSE、GFAP和NCAM的积累光密度值IOD均以A组最少,B组最 多,C、D、E呈依次减少趋势,其中D、E组无明显差别(P>0.05,表3、4、5)。 从表6看出,NSE、GFAP、NCAM在组内的两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。 NSE在各组的表达均高于GFAP、NCAM的表达(P<0.01)。GFAP的表达在A组 多于NCAM的表达,在B、C、D、E组少于NCAM的表达(P<0.01,表6,图5)。 24表 6 幼鼠海马 NSE、GFAP、NCAM 积累光密度值的组内比较( ?S) 分组 NSE GFAP NCAM F值 P值 A组 49.07?7.96 24.12 ?3.02 12.64?2.90 128.6 0.000 514.883 0.000 B组 186.71?12.45 59.40?4.50 111