卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD4^CD25^＋调节性T淋巴细胞增殖及免疫抑制功能的实验研究

卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD4^CD25^＋调节性T淋巴细胞增殖及免疫抑制功能的实验研究 卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD4^CD25^，调节性T淋巴细胞增殖及免 疫抑制功能的实验研究 ? 206?2006年3月第41卷第3期ChinJObstetGynecol,Mch!.,1 估价,有助于癌变的早期诊断.在CIN和浸润性癌组织中, DNA倍体已经被证实,可作为评估具有向更高级病变 转化的相对风险性的预测因子J.本研究采用流式细胞仪 分析LSIL和HSIL患者宫颈上皮脱落细胞内DNA倍体分 布,结果显示,HSIL组织中DNA异倍体的检出率较高 (90%),与LSIL患者(58%)相比,差异有统计学意义,提 示,DNA倍体分析有助于识别发展中的LSIL. 大量实验证明,持续感染高危型HPV与宫颈癌的发生 和发展密切相关,而HPV感染和DNA非整倍体的同时出现 也提示这些改变有因果关联.高危型HPV导致宿主细胞 病毒癌基因E6,E7持续表达,其表达产物可共同干扰细胞 周期调控并抑制细胞凋亡,引发有丝分裂畸变和染色体不稳 定j.突变的细胞大量增生,反复合成DNA,导致细胞DNA 含量为正常的2倍,4倍甚至8倍,最终出现多倍体和非整 倍体.因此,出现高危型HPV感染和非整倍体的细胞异型 性改变,可能预示着宫颈癌的发生.此外,由于HPV感染的 平均时间只有8—14d,而且大多数HPV感染可自行恢复 (尤其是年轻妇女),因此,正常的DNA倍体分布也可能是 短暂的HPV感染和复原的信号【.由于DNA倍体与HPV 亚型分布及HPV感染的清除密切相关,可疑的DNA倍体分 布有可能暗示持续感染高危型HPV,因此,DNA倍体分析用 于鉴别感染高危型HPV而细胞学检查正常的患者,可能具 有一定的实用价值. 本实验证明,HPV感染(尤其是高危型)与宫颈疾病的 发生和发展密切相关,而且HPV亚型检测作为细胞学筛查 的辅助手段,有利于早期发现和处理宫颈低度病变患者中的 高危人群.从DNA倍体和HPV亚型分布关系的研究中又 可以看出,高危型HPV感染与DNA异倍体的产生有显着相 关性(P<0.05).因此,HPV亚型检测和DNA倍体分析可 为宫颈癌的发生,发展提供追踪和诊断的特征性信息. 参考文献 1BoUmannR,MehesG,TorkaR,eta1.Determinationoffeatures indicatingprogressioninatypicalsquamouscellswithundetermined significance:humanpapillomavitustypingandDNAploidyanaly幽 fromliquid—basedcytologicsamples.Cancer,2003,99:113—117. 2SolomonD,DaveyD,KurmanR,eta1.The2001BethesdaSystem: terminologyforreportingresultsofcervicalcytology.JAMA,2002, 287:2114-2119. 3RajagopalanH,NowakMA.VogeIsteinB,eta1.Thesignificanceof unstablechromosomesincolorectalcanceroNatRevCancer,2003, 3:695-701. 4LorenzatoM,BuryJP,CucheroussetJ.eta1.UsefulnessofDNA ploidymeasurementonliquid—basedsmeal~showingconflieting resultsbetweencytologyandhigh—riskhumanpapillomavirustyping. AmJClinPathol,2002,118:708-713. 5RihetS,LorenzatoM,Clave1C.Oncogenichumanpapillomaviruses andploidyincervicallesions.JClinPathol,1996,49:892-896. 6DuensingS,MungerK.Thehumanpapillomavimstype16E6and E7oncoproteinsindependentlyinducenumericalandstructural chromosomeinstability.CancerRes,2002,62:7075-7082. 7HoGY,BiermanR,BeardsleyL.eta1.Naturalhistoryof cervieovaginalpapillomavirusinfectioninyoungwomen.NEnglJ Med,1998.338:423-428. (收稿日期:2005-06-13) (本文编辑:姚红萍) 卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD4+cD调节性T淋巴细胞 增殖及免疫抑制功能的实验研究 李晓叶枫陈怀增吕卫国程琪谢幸 CD4+cD未调节性T淋巴细胞是一类具有抑制CD和 cDT淋巴细胞活化和增殖功能的免疫调节细胞.最近的 研究发现,在卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者外周血及腹腔内, 这类细胞的比例显着增加,可能是卵巢癌患者免疫功能下降 和生存率低下的重要原因之一….我们先前的体外实验也 证实,卵巢癌细胞株SKOV3的培养上清液和健康人外周血 淋巴细胞共培养后,能诱导其中的CD;cD去调节性T淋巴 细胞比例增加.为了进一步阐明其机制,我们将卵巢癌细 胞培养上清液和纯化的CD4+c调节性T淋巴细胞共同培 基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y204078) 作a~:310006杭州,浙江大学医学院附属妇产科医院妇瘤科 通信作者:谢幸(Email:xiex@mail.hz.zj.cn) 养,观察其增殖,表型及功能是否发生改变. 一 ,材料与方法 1.主要材料与试剂:卵巢癌细胞株SKOV3购于美国典 型物种保藏中心(ATCC),RPMI一1640培养基,胎牛血清 (FBS)购自美国LifeTech公司,Fieol1分层液购自美国 Amersham公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗cD单克 隆抗体(单抗),藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的抗cD 单抗购自美国BD公司,FITC标记的抗糖皮质激素诱发型肿 瘤坏死因子受体(GITR)单抗购自美国R&DSystems公司, PE标记的抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单 抗,cD与cD28单抗购自美国eBioscience公司,人重组白细 胞介素2(rII一-2)购自英国PeproTechEC公司,细胞破膜剂购 自美国CahagLaboratories公司,分选CD;cDT淋巴细胞的 j产科杂志2006年3月第41卷第3期ChinJOhstaGFneco],March2006.Vo1.41.No.3 免疫磁珠抗体购自德国MiltenyiBiotec公司,5一溴脱氧尿核 苷(5-bromodeoxyuridine,BrDU)细胞增殖测定试剂盒购自瑞 士Roche公司. 2.卵巢癌细胞培养上清液的收集:在5%CO,37?条 件孵箱内,以含10%FBS的RPMI一1640培养基传代培养 SKOV3细胞,待细胞生长至培养瓶底80%满时,改用元血清 培养基培养2d,收集培养上清液(记为SKOV3一S),一2O? 保存待用. 3.外周血CD4+cD未调节性T淋巴细胞的分选:健康志 愿者白细胞悬液购自浙江省血液中心,用Ficol1分层液分离 外周血单个核细胞,细胞计数后,用全自动磁细胞分离仪(德 国MiltenyiBiotec公司产品)分离得到CD4+CDT淋巴细胞 与CD4+cDT淋巴细胞,操作严格按说明书进行. 4.T淋巴细胞培养与增殖测定:将CD4+cDT淋巴细 胞与cDcD三T淋巴细胞各自分成4组,分别在培养基中加 入cD3单抗(2g/m1)和cD28单抗(2m1),CD3,CD:单 抗与rlL-2(100U/m]),CD3,CD28单抗与SKOV3一S (1O/m1),及仅加入SKOV3?S,每组重复3孔,每孔细胞数 为5X10个,培养72h后,BrDU掺入标记法测定细胞增殖能 力,以酶联免疫检测仪测定吸光度值(测定波长450mn,参 考波长630nm),以此值表示细胞增殖能力. 5.CD;cD去调节性T淋巴细胞的抑制增殖能力测定:将 CD;CD去T淋巴细胞与每孔5X10个CD;CD矗T淋巴细胞 按不同细胞数比例(O:1,1:8,1:4,1:2,1:1),在CD和CD8 单抗共同作用下培养,72h后BrDU掺入标记法测定细胞增 殖能力.另将CD;cD未T淋巴细胞在含或不含SKOV3-S的 RPMI-1640培养基中培养3d后,再分别与5X10个CD CD25一T淋巴细胞按1:2比例共同培养,72h后BrDU掺入 标记法测定细胞增殖能力,观察CD;cDT淋巴细胞抑制 CD;cDT淋巴细胞增殖能力的变化,抑制率(%)的计算 方法为(1一共同培养72h后吸光度值/CD;CDT淋巴细 胞单独培养72h的吸光度值)×100%.以上各组均重复3 孔. 6.SKOV3一S作用后cDcD去调节性T淋巴细胞表型变 化的检测:CD;cD去T淋巴细胞在含或不含SKOV3-S的 RPMI-1640培养液中培养72h后,流式细胞仪(美国 BeckmanCoulter公司产品)检测细胞表面CTLA-4与GITR 蛋白的表达水平,细胞内CTLA-4的检测需先用细胞破膜剂 破膜后再加入相应抗体.每组实验重复5次. 7.CD4+cD调节性T淋巴细胞内叉头蛋白3(Foxp3)基 因的mRNA表达的测定:经和未经SKOV3一S作用后的 CD4+CD夹T淋巴细胞用一步法抽提总RNA,加入TRIzol试 剂,经异丙醇沉淀后用纯水溶解,莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV)逆转录酶逆转录后进行PCR反应.引物序列如 下:Foxp3基因的产物长度为260bp,上游引物5- cTAcGccAcGcTcATccGcTGG-3,下游弓I物5一GTAGGG TTGGAAcAcc,rlGcTGGG一3;内参照B肌动蛋白(3-actin)产 物长度为224bp,上游引物5一TTccAGccTTccTTccTGG_3, 下游引物5-TTGcGcTcAGGAGGAGcAAT一3.PCR反应条 件为94?预变性5min,随后进行28次循环(94?208, 6O?20s,72oC308),最后72?延伸10min,扩增产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳.Foxp3基因的mRNA表达量以其与 3-actin的条带相对比值表示.每组实验重复5次. 8.统计学方法:应用SPSS11.0统计软件分析,细胞增 殖能力,CTLA-4和GITR蛋白表达水平,Foxp3基因的mRNA 表达量用露?s表示,各组数据之问比较采用t检验. 二,结果 1.SKOV3-S诱导的CD4+cD调节性T淋巴细胞增殖能 力的变化:在CD,和cD丝单抗作用下,CD4+cDT淋巴细胞 元明显增殖,而CDCDT淋巴细胞则出现了明显的增 殖反应;再加入rIL-2后,CD4+cDT淋巴细胞出现了增殖, 但幅度比CDCD:一T淋巴细胞低,仪为部分激活;再加入 SKOV3一S后,CD4+cDT淋巴细胞也出现了增殖,但CD CD一T淋巴细胞的增殖却受到抑制.在仅含SKOV3一S的 培养基中培养后,CD4+CDT淋巴细胞也出现了增殖,而 CD4CDT淋巴细胞则无明显增殖.见图1. }四 皇c 培养液类型 圈1卵巢癌细胞培养上清液SKOV3一s诱导的 CD4*CD2;调节性T淋巴细胞增殖能力的变化 2.CD;cD调节性T淋巴细胞对CDCD一T淋巴细 胞增殖的抑制作用:CD;cD毒T淋巴细胞与CD4+CD矗T淋巴 细胞在cD,和cD:单抗共同作用下培养72h后,CD4+cD毒 T淋巴细胞对后者的增殖具有抑制作用,并随CD:cD未T淋 巴细胞比例的增加而增强.SKOV3-S作用后的CD;cD去T 淋巴细胞对CD:CD矗T淋巴细胞增殖的抑制作用较未经 SKOV3-S作用的显着增强,抑制率分别为69.82%和 44.29%,两者比较,差异有统计学意义(t=7.411,P= 0.002). 3.CD4+cD毒调节性T淋巴细胞CTLA~和GITR蛋白的 表达水平:SKOV3一S作用后CD;cDT淋巴细胞膜表面 GITR蛋白的表达水平为(72?5)%,cTLA一4表达水平为 (24.5?3.1)%,细胞内cTLA_4蛋白的表达水平为(84.3 ?7.4)%,与未经作用的CD:cD去T淋巴细胞[依次为(38 ?5)%,(11.8?2.3)%和(52.1?9.3)%]相比,表达均显 着增加,三者分别比较,差异均有统计学意义(t值分别为 ? 208?中华妇产科杂志2006年3月第41卷第3期 ChinJObstetGynecol,March2006,VoL41,No.3 11.878,7.346和6.067,P值均<0.01). 4.CD4+cD嘉调节性T淋巴细胞Foxp3基因的mRNA表 达量:经和未经SKOV3一S作用的CD4+cD未T淋巴细胞内 Foxp3基因的mRNA表达量分别为0.901士0.053和 0.863?0.028,两者比较,差异无统计学意义(t1.400,P= 0.199). 讨论 本研究发现,外周血中分离的CD;cD未调节性T淋巴 细胞对cD和cD单抗的刺激没有增殖反应,当CD4+cD未 T淋巴细胞与分离的静息CDCD一T淋巴细胞共同培养 时,可抑制后者增殖,并且这种抑制作用随CD;cD去T淋巴 细胞比例的增加而增强;rIL-2可部分恢复CD4+cD未T淋巴 细胞的增殖,虽然仍低于CDCD一T淋巴细胞的增殖. 这些结果与以往的研究结果一致J. 本研究将卵巢癌细胞培养上清液SKOV3一S加入培养 基,观察其对CD4+cD未调节性T淋巴细胞增殖的影响,结果 发现无论在CD3和CD.单抗存在与否的情况下,SKOV3一S 均能促使CD;CD丢T淋巴细胞显着增殖,提示卵巢癌患者 体内CD;cDT淋巴细胞的增加可能与卵巢癌细胞分泌的 某种可溶性物质有关.将SKOV3.S作用的CD;cD未T淋巴 细胞与CDCD一T淋巴细胞共同培养时,发现经SKOV3一 s作用的CD;CD2;T淋巴细胞对后者增殖的抑制比未经作 用的CD;cD未T淋巴细胞显着增强,提示SKOV3.S还能增 强CD;cDT淋巴细胞的免疫抑制功能.此外,本研究还 发现,SKOV3-S的存在能使静息CDCD一T淋巴细胞在 受到cD和cD.单抗活化刺激后的增殖显着下降,提示卵 巢癌细胞分泌的物质还可能通过下调CD4CD一T淋巴细 胞数量而抑制宿主的体液免疫应答. CTLA-4与GITR蛋白是CD4+cD调节性T淋巴细胞的 特征性表面标志和功能相关分子,CTLA-4还是T淋巴细胞 活化的负调控因子,在体实验表明,CTLA-4是CD4+cDT淋 巴细胞发挥免疫抑制作用所必需的J.本研究测定了 SKOV3-S作用后CD;cD三T淋巴细胞表型蛋白的表达,结 果发现crLA4和GITR蛋白表达均显着增加,提示SKOV3.S 增强了CD;cD三T淋巴细胞的抑制增殖功能,这可能是通 过上调其CTLA-4和GITR蛋白的表达而实现. Foxp3基因是CD4+cD丢调节性T淋巴细胞分化与功能 的决定性基因,是T淋巴细胞具有调节性功能的特征性标 志_6J.Khattri等-7进行动物实验发现,Foxp3基因的mRNA 含量决定外周血T淋巴细胞的功能及数量,当Foxp3缺乏时 会导致小鼠出现免疫过强,而过度表达时,则表现为外周血 T淋巴细胞数量和活性降低的低免疫状态.在受到某些活 化因子如卵白蛋白(ovalbumin)刺激后,过度表达Foxp3的 CD4+cD嘉T淋巴细胞的免疫抑制能力比野生型显着增强. 本研究发现,SKOV3一S作用后CD;cD去T淋巴细胞的免疫 抑制功能显着增强,但细胞内Foxp3基因的mRNA表达只有 轻微的增加,差异无显着性,故CD4+cD未T淋巴细胞的免疫 抑制功能与Foxp3含量的关系有待进一步实验验证. 综上所述,本研究发现卵巢癌细胞能分泌某种可溶性物 质,促进CD4+cD未调节性T淋巴细胞的增殖,并通过上调 CTLA-4和GITR蛋白的表达,增强CD;cD三T淋巴细胞的 免疫抑制功能,从而使卵巢癌患者的局部免疫功能受抑.若 能确认这一可溶性物质,可能为卵巢癌的免疫治疗提供有效 的靶点. 参考文献 lCufielTJ,CoukosG,ZouL,etaLSpecificrecruitmentof regulatoryTcellsinovariancarcinomafostersimmuneprivilegeand predictsreducedsurviva1.NatMed.2004.10:942-949. 2Lix,YeDF,Xiex,eta1.ProportionofCD;cD矗regulatoryT cellisincreasedinthepatientswithovariancarcinoma.Cancer Invest,2005,23:399-403. 3JonuleitH,SchmittE,StassenM,etaLIdentificationand functionalcharacterizationofhumanCD4+cDTcellswithregulatory propertiesisolatedfromperipheralblood.JExpMed,2001,193: 1285—1294. 4LevingsMK,SangregorioR,SartiranaC,eta1.HumanCD25 CD4Tsuppressorcellclonesproducetransforminggrowthfactor beta,butnotintedeukin10,andaredistinctfromtype1Tregulatory cells.JExpMed,2002,196:1335—1346. 5BirebentB,LorhoR,LechartierH,eta1.Suppressivepropertiesof humanCD4*cD矗regulatoryTceilsaredependentonCTLA-4 expression.EurJImmunol,2004.34:3485-3496. 6DujardinHC,Burlen?DefranouxO,BoucontetL,eta1.Regulatory potentialandcontrelofFoxp3expressioninnewbornCIMTceUs. 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