【word】 奥硝唑缓释膜用于鼠类动物的生物安全性评价

【word】 奥硝唑缓释膜用于鼠类动物的生物安全性 奥硝唑缓释膜用于鼠类动物的生物安全性 评价 奥硝唑缓释膜用于鼠类动物的 生物安全性评价 徐全臣,陈秀娟,王志国,刘梦东,耿新杰 (青岛大学医学院附属医院,山东青岛266003) 山东医药2011年第5】卷第49期 摘要:目的探讨奥硝唑一羧甲基壳聚糖缓释膜(药膜)对鼠类动物的生物安全性.方法?l0只小鼠随机 分为实验组和对照组,分别于尾静脉注射药膜浸提液和生理盐水进行全身急性毒性反应;?以V79系小鼠成纤维 细胞为实验细胞,以RPMI1640培养液为阴性对照组,0.64%苯酚溶液为阳性对照组,采用MMT法进行细胞毒性 实验;@40只豚鼠试验前24h背部脱毛,分别用药膜浸提液,基质浸提液,生理盐水,2,4-二硝基氯苯涂擦脱毛区, 计算四种溶液的致敏率;?10只大鼠于脊柱两侧肌肉内埋植药膜,第1,2,4,6周切取标本计算降解百分率.结果 该药膜无细胞毒性,无全身急性毒性及皮肤过敏性,药膜第2周已降解,至第6周几乎完全降解.结论药膜具 有良好的生物安全性和降解性,可望用于临床. 关键词:奥硝唑;羧甲基壳聚糖;生物安全性;鼠类 中图分类号:R781.4文献标志码:B文章编号:1002-266X(2011)490282 羧甲基壳聚糖(CM—c)是壳聚糖的水溶性衍生 物,其可溶可吸收的特性作为成膜载体已经越来越 受到人们的重视.研究显示,以CM—C为载体,奥硝 唑为主药制成的缓释药膜,质量控制可靠,抑菌性和 缓释性能良好?.为了保证该药膜用于人体时安 全,2009年12月,2010年10月,我们按照国家规 定,对药膜进行了生物安全性评价. 1材料与方法 1.1材料实验动物为6周龄左右健康昆明小鼠 l0只,雌雄各半,体质量17,23g,由青岛市药品检 验所提供.白色豚鼠40只,体质量300—350g,雌 雄各半,由青岛市药检所实验动物中心提供.SPF 级Wistar大鼠10只,雌雄各半,由山东大学医学院 实验动物中心提供.实验细胞为V79细胞(中国仓 鼠肺成纤维细胞),由中国科学院上海生物科学院 细胞资源中心提供. 1.2方法 1.2.I药膜的制备取CM—C1.6g,溶于40ml纯 化水中,配成4%的溶液;取高聚合物聚乙烯醇 (PVA)1.6g,溶于40ml纯化水中,配成4%的PVA 溶液.将两种溶液混合,加入甘油】ml后搅拌4h, 加人0.48g奥硝唑,继续搅拌4h,然后把共混液倒 入一底面光滑的圆形金属槽中.放入烘箱50?烘 干,12h后取出即得药膜.所制药膜厚0.3mm,可 分切出任意大小形状.乙醇消毒后装入密封袋中保 存.扫描电镜观察见药膜呈蜂窝状,孔隙均匀,直径 约3m. 28 1.2.2急性毒性实验昆明小鼠10只,随机分为 实验组和对照组,每组5只;实验组于尾静脉恒速注 射载体浸提液50mL/kg,对照组注射同批号火菌生 理盐水50ml/kg,于注射后4,24,48,72h观察动物 有无轻,中,重度毒性反应或死亡情况. 1.2.3细胞毒性实验实验分3组:药膜浸提液 组,阴性对照组(RPMI1640培养液),阳性对照组 (0.1%苯酚).将对数生长期的V79细胞用0.25% 胰酶消化,制成1X10/ml的细胞悬液,取出96孔 细胞培养板,分别加入细胞悬液100l,置37培 养24h.待细胞贴壁,弃去原培养液,分别加入各组 材料(100l/孔),同样条件继续培养2,4,71, 每孔加入MTr20l,再培养4h,吸弃原培养液,每 孑L加入缓冲盐溶液150l,清洗2次,弃除余液,立 即加入二甲基亚砜150l/孔,室温放置并轻度振荡 15,20rain.使用酶联免疫检测仪在490nm波长 处测定各孔的吸光度值(OD),各组细胞按下式汁算 细胞相对增殖度(RGR).RGr=实验组OD/阴性对 照组OD×100%. 1.2.4皮肤过敏实验40只健康白色豚鼠随机 平均分为4组:奥硝唑药膜组,基质组,阴性对照组 (生理盐水),阳性对照组(2,4一二硝基氯苯)实验 前24h仔细将豚鼠背部两侧剪毛,面积约3cm× 3era.分别用0.2ml125g/L奥硝唑药膜浸提液,等 体积基质浸提液,生理盐水,1%2,4一二硝基氯苯涂 于豚鼠左侧脱毛区,用1层油纸及2层消毒纱布覆 盖,以胶布固定,持续6h;7d和14d以同样方法 山东医药2011年第5l卷第49期 重复1次,共3次.于末次给药致敏后14d,将受试 物0.2ml涂于豚鼠右侧脱毛区,其中阳性对照用 0.1%2,4.二硝基氯苯,6h后去掉受试物,温水冲 洗干净,即刻观察并记录6,24,48h皮肤及心率,呼 吸等情况.根据出现的红斑与水肿情况评分计算反 应值,最后计算出实验动物皮肤致敏率结果. 1.2.5体内降解实验10只Wistar大鼠,背部剪 毛形成约4cmX4cm的术野,沿脊柱作一长约2onl 的切口,取脊柱两侧等距离的两个肌肉位点,用止血 钳分离脊柱两侧肌肉,形成足够间隙.奥硝唑药膜 剪成4.0mmX8.0mm长方形,烘致恒重,经紫外线 消毒,植入大鼠背部肌肉.1,2,4,6周切取标本,洗 去黏附物,烘致恒重,按下式计算降解百分率.降解 百分率#(W0.W1)/W0×100%;W0为降解前质 量(g),W1为降解后质量(g). 2结果 2.1急性毒性实验实验组和对照组小鼠状况良 好,未见明显毒性症状,72h内活动如常,饮食饮水 均正常,无动物死亡现象,动物体质量日益增加. 2.2细胞毒性实验药膜浸提夜组毒性分级为0 一 I级,药膜对细胞无不良反应,符合国家规定 的.见1. 表1各组在不同培养时间的OD值,RGR及细胞毒性分级 2.3皮肤过敏实验实验组观察6,24,48h,皮肤 过敏实验致敏率均为0,阳性对照组分别为90%, 100%,100%.. 2.4体内降解实验1周时实验组内置膜取出后 基本完整,表面粗糙,有白色及红色絮状附着物.第 2周时,内置膜已成凝胶状,较第1周明显变薄,与 周围组织易区分.第4,6周呈菲薄致密近透明的 银白色纤维囊,周围组织颜色正常.1,2,4,6周奥 硝唑药膜降解百分率分别为15%,35%,72%, 98%. 3讨论 生物材料在应用于人体之前必须经过严格的检 验,除临床应用所要求的机械及理化性外,还应具有 良好的生物安全性.CM.C是壳聚糖的水溶性衍生 物,具有良好的生物相容性以及可降解性_4J.本实 验中,奥硝唑缓释药膜无全身急性毒性及皮肤过敏 性,埋植于大鼠肌肉后2周时已经融化,6周时几乎 完全降解,龈沟中的液体量多于肌肉组织,推测药膜 在3周左右即可完全降解. 以CMC为载体的缓释药膜质地均匀,在电镜 下观察,材料表面呈蜂窝状,纵剖面上有较规则的通 道,这些孔和通道相互构成网架,形成三维立体结 构,适合细胞的三维生长,能为新生组织提供良好的 支架.在细胞毒性实验中,实验组细胞在第4天和 第7天的细胞相对增殖率大于100%,表现出对细 胞生长的促进作用,这种促进作用与文献报道的 CM—C能够促进成纤维细胞的生长的结论相一 致J.基于以上两点我们推测,将缓释药膜置于牙 周袋内,能够促进牙周膜成纤维细胞的再生. 综上所述,以CM—C为载体,奥硝唑为主药制成 的缓释药膜具有良好的生物安全性,可望应用于临 床. 参考文献: [1]徐全臣,钟德钰,吉秋霞,等.奥硝唑缓释膜体内外释放度的研究 EJ].中国药房,2007,18(1):33. [2]徐全臣,王志国,邓婧,等.奥硝唑缓释膜生物学性能的初步研究 [J].中国海洋药物,2009,28(6):36. [3]孙敬方.动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2001: 195-375. , [4]WangLC,ChenXG,XuQC,eta1.Plasmaproteinadsorptionpat— ternandtissue—implantreactionofpoly(vinylalcoho1)/carboxym— ethyl-ehitosanblendfilms[J].JBiomaterSciPolymEd,2008,19 (1):113. [5]王征,刘万顺,韩宝芹,等.不同分子量羧甲基壳聚糖的制备及其 对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞生长的影响[J].生物医学 学杂志,2007,24(2):340. (收稿日期:2011-04-07) 29