苹果多酚对拘束应激小鼠免疫细胞氧化应激状态的影响（可编辑）

苹果多酚对拘束应激小鼠免疫细胞氧化应激状态的影响（可编辑） 苹果多酚对拘束应激小鼠免疫细胞氧化应激状态的影 响 暨南大学硕士学位名(中英对照): 苹果多酚对拘束应激小鼠免疫细胞氧化应激状态的影响 Effects of Apple Polyphenols on Immunocyte in Mice Treated with Restraint Stress作者姓名:王敏 指导教师姓名:栗原博 及学位、职称:教授 学科、专业名称:医学、免疫肿瘤药理学 论文提交日期:2010年 5 月 论文答辩日期:2010年 6 月 答辩委员会主席: 论文评阅人: 学位授予单位和日期: 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成 果,也不包含为获得 暨南大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:王敏 签字日期:2010 年5 月23 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 暨南大学有关保留、使用学位论文的规定,有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授 权 暨南大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名: 导师签名:签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编:暨南大学硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 实验目的:本实验以拘束应激为实验模型,研究了苹果多酚对拘束应激小鼠免疫功能 的影响,并探讨淋巴细胞内过氧化状态和线粒体功能的影响,旨在揭示苹果多酚对免疫调 节作用,并探讨其可能的作用机理。 实验:以拘束应激建立小鼠免疫低下模型,实验动物随机分为正常对照 组、拘束 -1 -1 应激模型组及苹果多酚低剂量组(200 mg?kg )和高剂量组(400 mg?kg )共 4组,每组 10只小鼠。小鼠拘束后恢复 3 d,测定小鼠脾脏指数、淋巴细胞总数和淋巴细胞自然杀伤 (NK)活性等,评价苹果多酚对免疫功能的调节作用。实验首先通过检测拘束应激小鼠脾 脏淋巴细胞内的丙二醛(MDA)和抗氧化能力(ORAC)水平,确定拘束对细胞内氧化及抗 氧化状态的影响。同时,测定脾脏淋巴细胞内自由基清除系统的关键酶超氧化物歧化酶(SOD) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性和抗氧化小分子活性物质谷胱甘肽(GSH)含量。 此外,我们还从基因水平检测自由基消除的关键酶CuZnSOD、MnSOD和GSH-PX mRNA的 表达水平。由于自由基主要由线粒体产生,因此我们利用紫外分光光度法检测线粒体呼吸链 复合酶?、?、?和?的活性,RT-PCR法检测线粒体呼吸链复合酶?的Ndufs1 和Ndufs8 mRNA表达的变化,判断苹果多酚对脾脏线粒体的保护作用。通过对上述免疫细胞内的自由 基产生和消除通路中各指标的测定,探讨应激负荷造成机体免疫低下的氧化应激机制,力图 揭示苹果多酚免疫调节的科学内涵。 -1 实验结果:拘束小鼠连续 5 d灌胃苹果多酚(200 和 400 mg?kg )缓解了因拘束应激所 致脾脏指数、脾脏淋巴细胞总数和脾脏淋巴细胞NK杀伤活性的降低。苹果多酚分别降低了 脾脏淋巴细胞内MDA含量和提高了ORAC水平,对脾脏淋巴细胞内的氧化-抗氧化平衡状态 有所调解。苹果多酚也能改善因拘束应激引起的脾脏淋巴细胞内清除自由基关键酶和重要 抗氧化小分子物质的紊乱,提升了小鼠脾脏淋巴细胞内SOD活性和GSH含量。苹果多酚也 能提高CuZnSOD、MnSOD和GSH-PX mRNA的表达。同时,苹果多酚显著提高产生自由基 的脾脏线粒体呼吸链复合酶?和?活性和呼吸链复合酶?的Ndufs1 和Ndufs8 mRNA表达。 实验结论:苹果多酚通过改善应激负荷引起的脾脏淋巴细胞内的氧化-抗氧化平衡失 衡、维持体内抗氧化酶(剂)平衡和保护线粒体功能,结果有益于调节免疫活性的作用。 实验创新点 (1)从动物整体到分子生物学水平的不同层次探讨了苹果多酚对免疫调节作 用及其部分 作用机制。 (2)实验验证并提出拘束应激应激选择性的抑制了免疫细胞线粒体呼吸链, 继而影响免 I暨南大学硕士学位论文 中文摘要 疫细胞的功能。 (3)实验结果提示苹果多酚缓解免疫细胞内氧化应激状态是通过改善线粒体 功能来实现 的。 关键词:苹果多酚;拘束应激;免疫能力;氧化应激;线粒体II暨南大学硕士 学位论文 英文摘要Abstract Object: This experiment, having restraint stress as a model, researched the changes of immunologic function, antioxidants and antioxidative enzymes and the variety of mitochondria function in mice. It would discuss the possible mechanism of Apple PolyphenolsAP improving the status of immunologic functionMethod: Kun Ming KM mice loaded with restraint stress were induced by fixed in the restraint cage. Animals were randomly divided into normal group, stress group, Apple Polyphenols 200 -1 -1 mg?kg and Apple Polyphenols 400 mg?kg . The effect of Apple Polyphenols on immunologic function were observed by the changes in spleen index, the totall number of spleen cells and natural killer NK cell activity in mice sacrificed 3 days after restraint stress. Firstly, the malondialdehyde MDA contains and oxygen radical absorbance capacity ORAC levels in restraint mice spleen lymphocytes were detected to determine the intracellular oxidation and antioxidant status. At the same time, the activities of the key enzymes superoxide dismutase SOD, glutathione peroxidase GSH-PX and antioxidant glutathione GSH in the free radical scavenging system were also determined. In addition, the mRNA expression of CuZnSOD, MnSOD and GSH-PX were also detected. Mitochondrion is the main generated place of free radical. Accordingly, we observed the mitochondrial respiratory chain complex?, ?, ? and ? through spectrophotometry instrument and examined the changes of the expression of Ndufs1and 8 mRNAs in spleen of mice through the method of RT-PCR to protect mitochondria function. By determination of these parameters in the free radical generation and the elimination system in the immunocyte, we explored the mechanisms about oxidative stress in stressed mice to reveal the immunomodulating effect of Apple Polyphenols-1 Result: An oral administration of Apple Polyphenols solution 200 and 400 mg?kg for five consecutive days to restrained mice alleviated the stress-induced reduction of spleen index, the total number of spleen lymphocytes and spleen NK cell activity. Apple Polyphenols had shown to be decreasing MDA content and increasing ORAC in spleen lymphocytes. Apart from that, SOD activities in spleen lymphocytes were also increased after Apple Polyphenols administration. In addition, Apple Polyphenols increased the GSH in spleen lymphocytes. At last, Apple Polyphenols increased the activity of mitochondrial respiratory chain complex? and ?, and also improved the expression of Ndufs1and 8 mRNAs in spleen lymphocytes of mice III暨南大学硕士学位论文 英文摘要Conclusion: These findings suggested that Apple Polyphenols may have immunomodulating effect towards restraint stress by improving oxidative stress by scavenging free radical, keeping the balance of antioxidant and oxidant and protecting mitochondrial function Novel Points: 1 Immunomodulating effet of Apple Polyphenols was studied with these animal models for the first time2 Restraint stress selectively affected the mitochondrial respiratory chain complexes in immunocyte3 Apple Polyphenols alleviated the status of oxidative stress of immunocyte through improving mitochondrial functionKey Words:Apple Polyphenols, restraint stress, immunocompetence, oxidative ststress, mitochondrion IV暨南大学硕士学位论文 缩略语说明 缩略语说明 AP Apple Polyphenols,苹果多酚 GAS General Adaptation Syndrome,一般适应综合症 HPA轴 Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis,下丘脑-垂体-肾上腺皮质 免疫反应 轴 SNS Sympathetic Nervous System,交感神经系统 GC Glucocorticoid,糖皮质激素 OS Oxidative Stress,氧化应激 ROS Reactive Oxygen Species,活性氧簇 RNS Reactive Nitrogen Species,活性氮自由基 SOD Superoxide Dismutase,超氧化物歧化酶 CAT Catalase,过氧化氢酶 GSH-PX Glutathione Peroxidase,谷胱甘肽过氧化物酶 MDA Malondialdehyde,丙二醛 ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity,抗氧化能力指数 GSH Glutathione,谷胱甘肽 NK Natural Killer Cell,自然杀伤细胞 MT Mitochondrion,线粒体 HPLC High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱仪 TBA 2-thiobarbituric acid,硫代巴比妥酸 RBL-2H3 Rat Basophilic Leukemia Cell,大鼠嗜碱细胞性白血病细胞 LPO Lipid Peroxidation,脂质过氧化 Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acidAAPH 2,2?-azobis2-amidinopropane dihydrochloride FL Sodium Fluorescein,荧光素钠 YAC-1 Lymphoma Cell,淋巴瘤细胞 SOS Sodium Octanyl Sulfonate,辛烷磺酸钠PI Propidium Iodide,碘化丙 啶 ACE Angiotensin Converting Enzyme,血管紧张素转化酶 FCS Fetal Calf Serum,小牛血清V暨南大学硕士学位论文 缩略语说明 ACT Apple Condensed Tannins,苹果缩合单宁 Glucosyl Transferases,龋齿菌转葡萄糖基酶 GTF DTT Dithiothreitol,二巯基苏糖醇 Taq酶 Taq DNA Polymerase,Taq DNA 多聚酶 Ficoll 聚蔗糖NADH 还原型辅酶 I DCPIP 2,6-二氯酚啶酚 VI暨南大学硕士学位论文 目录 目录 中文摘要I Abstract III 缩略语说明 V 1 前 言. 1 1.1 应激及其研究现状..1 1.1.1 应激的简介.1 1.1.2 应激与免疫.1 1.1.3 氧化应激..3 1.1.4 氧化应激性疾病及其防治.6 1.2 苹果多酚与氧化应激.7 1.2.1 苹果多酚简介8 1.2.2 苹果多酚的功能活性9 1.2.3 苹果多酚的应用10 1.3 立题依据.13 2 拘束应激对小鼠免疫功能的影响. 14 2.1 材料与方法14 2.1.1 实验药品及试剂14 2.1.2 实验仪器14 2.1.3 实验动物及YAC-1 细胞15 2.1.4 试剂的配制..15 2.1.5 实验15 2.1.6 免疫器官指数的测定.15 2.1.7 脾脏和胸腺细胞悬液制备..16 2.1.8 DiO/PI双染色法检测脾脏NK杀伤活性16 2.1.9 数据统计与分析17 2.2 实验结果.17 2.2.1 拘束应激后恢复不同的时间对小鼠脾脏和胸腺指数的影响17 2.2.2 拘束应激后恢复不同的时间对小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞总数的影 响..18 2.2.3 拘束应激后恢复不同的时间对小鼠脾脏淋巴细胞NK杀伤活性的影 响.19 2.3 与讨论20 3 苹果多酚对拘束应激小鼠免疫功能的影响及其机制探讨 21 3.1 材料与方法22 3.1.1 实验材料22VII暨南大学硕士学位论文 目录 3.1.2 实验仪器23 3.1.3 实验动物23 3.1.4 脾脏细胞悬液制备..24 3.1.5 脾脏T淋巴细胞亚群24 3.1.6 DiO/PI双染色法检测脾脏NK杀伤活性24 3.1.7 脾脏淋巴细胞内MDA含量及ORAC水平的测定..24 3.1.8 脾脏淋巴细胞内GSH含量测定26 3.1.9 脾脏淋巴细胞内SOD活性测定28 3.1.10 脾脏淋巴细胞内GSH-Px活性测定..28 3.1.11 脾脏线粒体呼吸链复合体酶活性测定.29 3.1.12 脾脏淋巴细胞基因表达.30 3.1.13 统计学处理32 3.2 实验结果.32 3.2.1 AP对拘束应激小鼠脾脏指数的影响.32 3.2.2 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞总数的影响32 3.2.3 AP对拘束应激小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响.32 3.2.4 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞NK杀伤活性的影响..33 3.2.5 AP对拘束应激小鼠脾细胞内过氧化状态及抗氧化能力的影响..34 3.2.6 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞内GSH的影响..35 3.2.7 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞SOD活性的影响.36 3.2.8 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞GSH-PX活性的影响.36 3.2.9 AP对拘束应激小鼠脾脏线粒体呼吸链复合体酶活性的影响38 3.2.10 AP对拘束应激小鼠脾脏淋巴细胞基因表达的影响..38 3.3 小结与讨论42 4 结论与展望. 45 参考文献 47 致 谢 52 附录:论文涉及的基因序列. 53 在学期间发表论文清单 60VIII暨南大学硕士学位论文 目录IX暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 1 前 言 近年来,随着现代工作和生活条件的改善,体力上的劳累已不再是人们疲劳的主要原 因,人们更多是在面对环境变化,生活习惯改?及物理化学等各种应激源所?给人们的身 心疲劳及生活习惯病。因此,亚健康状态及应激性疾病逐渐成为人们关注的重点。应激反 应是一种心理和生理上的临床症状,是机体在应激负荷状态下,为缓解应激原的压力,通 过神经、内分泌及免疫系统来调整机体内环境稳定时表现出的身心状态。当 机体在应激负 荷作用下体内代谢水平过剩反应时,会影响组织器官的正常功能,引起病理过程及疾病发 生。所以研究应激反应机制,寻找预防、缓解及消除应激性疾病的有效途径是目前急待解 决的社会问题。 1.1 应激及其研究现状 1.1.1 应激的简介 “Stress”一词是由哈佛著名的生理学家Walter Cannon博士在 1925年首次使用,研究机 体的紧急反应(Emergency reaction),或称战斗-逃避反应(Fight-flight reaction),并提出了 [1] 稳态(Homeostasis)思想,即有机体维持内环境的平衡状态学说 。在此基础上,加拿大 Hans Selye博士 1936 年首次在Nature上把应激现象称为“一般适应综合症” (General [2] adaptation syndrome,简称GAS) 。Selye不仅指出交感神经系统(Sympathetic nervous system,SNS)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质免疫反应轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA轴)在应激中的意义,同时也指出其他一些激素参与这种反应过程。尽管在此之后各 家对应激所下的定义在表达方式上有所不同,但应激的基本概念并没有超越Selye当年提出 的理论:机体在受到各种强烈因素(应激源)刺激时,即内外环境超出正常阈值时,所出 现的以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应以及免疫 [3][4] 系统出现的应答反应,因此引起的各种机能和代谢的改变 。 1.1.2 应激与免疫 应激是机体受到应激原负荷时出现的防御反应及适应过程,涉及到神经、内分泌及免 疫等多方面生理功能。国内外进行了大量的关于应激的产生机制、病理变化及临床方面的 研究,建立各种应激动物模型,包括电刺激、热刺激、冷刺激、夹尾、拘束等。其中,以 1暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 剥夺身体自由活动、拘束制动刺激为应激原的拘束应激Restraint stress, 也叫束缚应激 Immobilization stress,近于人的心理应激。心理应激影响免疫功能和健康Fig 1。 Fig 1 The potential impact of psychological stress on immune function and healthThis figure depicts the multiple ways psychological stress can influence the immune system and health span. Chronic stress in human or rodent models can cause dysfunction in the innate, adaptive, and acquired mediated immune responses. These stressassociated impairments in immunity can increase morbidity and mortality by causing more serious deficits in physical and [5] mental health 在应激原作用下,机体交感一肾上腺皮质系统和下丘脑一垂体一肾上腺(HPA) 皮质 激素发生变化,同时免疫系统功能也发生改变。过度或持续的心理社会应激 负荷,破坏机 体的内环境平衡状态。应激原影响免疫系统功能主要通过刺激HPA轴,促肾 上腺皮质激素 刺激肾上腺促进糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)释放。糖皮质激素通过抑 制细胞增殖与 2暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 [6] 分化,调节基因转录,减少细胞粘附因子的表达等来影响免疫 。动物实验结 果表明,直 接作用于机体的刺激能造成免疫机能的抑制拘束应激能明显影响机体的免疫功能,且大多 [7] 数的研究表明应激负荷会导致免疫抑制 。应激引起免疫系统变化的指标主要有三类:一 [8] 是动物免疫器官如胸腺、脾脏重量的改变,在强度拘束应激后出现胸腺和脾脏萎缩 。二 是免疫细胞和免疫分子数量的改变,指的是淋巴细胞数量、抗体及细胞因子表达量的变化。 [9] Fukui等 在研究中发现,拘束应激使脾脏和淋巴结的淋巴细胞数减少,血清抗体IgE、IgG1 和IgG2 的产生减少,脾脏和淋巴结的IL-4和IFN-γ表达也明显下降。三是免疫功能的变 [10] 化,包括特异性和非特异性免疫。Millan等 的研究发现细胞免疫对拘束应激的反应比体 [11] 液免疫敏感。Glaser等 的研究表明,应激负荷也能使Th1和 Th2比率失衡,使机体允许 [12] 病毒的复制,从而增加肿瘤诱发的机会。Bonneau等 发现拘束应激使流感病毒感染的小 [13] 鼠病毒复制加快,小鼠T淋巴细胞活性下降,T细胞的细胞因子表达也减少。Kurihara等 研究发现拘束应激减少自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)杀伤活性。 1.1.3 氧化应激 应激学说的机制研究核心内容是交感神经兴奋和HPA轴系统的反应。最近研究表明, [14] [15] 氧化应激也是应激形成损伤的可能机制 。Madrigal等 研究发现,拘束应激导致大鼠脑 内谷胱苷肽水平降低、质脂过氧化和线粒体功能引起障碍,认为拘束应激致氧化应激进而 [16] [17] 使神经系统受损。Nakamura等 和Gelderman等 研究发现自然杀伤细胞和T细胞等淋巴 [18] 细胞对自由基敏感,自由基可以使它们失活从而影响机体免疫功能。Azlina等 在研究生 育酚和生育三烯酸对大鼠束缚应激胃溃疡保护作用时发现,拘束应激组大鼠 的胃酸浓度和 血清谓泌素浓度明显升高,胃组织中过氧化程度指标性成分丙二醛的含量也升高,提示应 [19] 激性胃损伤和氧化应激相关。郑洁静等 在研究拘束应激诱发小鼠急性肝炎的过程也发 现,小鼠肝脏的脂质过氧化产物明显增加,总抗氧化能力、维生素C、谷胱甘肽的含量明 显下降,认为氧化应激是拘束应激致肝炎的原因。 氧化应激的概念最早源于人类对衰老的认识。 1956年英国学者Harman首次提出自由基 [20] 衰老学说 ,该学说认为自由基攻击生命大分子造成了组织细胞损伤,是引起机体衰老的 根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。1990年美国衰老研究权威Sohal 教授指 [21] 明了自由基衰老学说的种种缺陷,并首先提出了氧化应激的概念 :机体在遭受各种有害 刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多,这些高活性分子与体 内的抗氧化成分相互作用形成的抗氧化网络系统失衡,从而导致组织和细胞 损伤(见Fig3暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 2)。 正常细胞的结构和功能需要通过氧化还原途径来维持和调节,当机体处于应激状态下 时,体内自由基产生增加,当自由基累积超过机体清除能力范围时,机体就处于氧化应激 状态。氧化应激(Oxidative stress,OS),是机体在遭受各种刺激时,体内高活性分 子如活性氧自由基Reactive oxygen species, ROS和活性氮自由基Reactive Fig 2 ROS and the anti-oxidative net nitrogen species, RNS产生过多,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。 - RNS包括一氧化氮?NO、二氧化氮?NO 和过氧化亚硝酸根?ONOO 等;ROS包括 2 - 超氧阴离子?O 、羟自由基?OH和过氧化氢H O 等。需氧细胞有许多清除或中和 2 2 2 ROS的低分子量抗氧化剂,如:生育酚、维生素C和谷胱甘肽;抗氧化酶有超氧化物歧化 酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和过氧化物酶等。氧化 剂/抗氧化剂系统的失衡导致了氧化应激。这是一种有害的现象,因为ROS能与脂质,蛋白 和DNA相互作用,最终引起变异,致癌,细胞损伤甚至死亡。ROS另一方面可促发多不饱 和脂肪酸的脂质过氧化Lipid peroxidation,LPO,LPO反应的终产物MDA可使含氨基的蛋 白质、核酸、脑磷脂发生交连并丧失其活性,其中羟基自由基的作用更强 。近年来,大 量研究表明,氧自由基诱导的LPO反应与许多疾病的发生有密切的关系 。因此,寻找利于 人体吸收的能清除体内过量自由基的外源植物活性清除剂目前正成为人们研究关注的热 点。 自由基产生的重要场所是细胞内的线粒体Mitochondrion,MT,线粒体也是自由基攻 4暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 [22] 击的重要靶位 。如Fig 3A所示,ROS主要破坏靶标是线粒体呼吸链复合酶?,复合酶 [23] ?,复合酶?及复合酶?,线粒体膜及线粒体DNA(mtDNA)等 。线粒体复合酶 - 受损,则线粒体呼吸链电子传递受到阻碍,导致超氧阴离子?O 大量产生。正常情况 2 - 下,?O 由MnSOD还原成H O ,后者在谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX的作用生成水, 2 2 2 2+ 从而清除自由基。 H O 能在亚铁离子(Fe )的作用下转化成毒性较大羟自由基?OH, 2 2 - 从而造成DNA链断裂、蛋白变性及脂质过氧化等一系列损伤。?O 线粒体内产生的第一 2 - 个ROS,其具有高度氧化性却不易穿过生物膜。线粒体是?O 的主要产生场所,而 2 mtDNA则是其主要攻击目标。如Fig 3B所示,mtDNA的损伤将进一步破坏线 粒体呼吸链功 [24] 能,产生更多的自由基,从而形成氧化应激的恶性循环 。 A B Fig 3 Generators and targets of free radical species in mitochondria A A schematic diagram of the generation of the main mitochondrial free radical species and5暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 their targets. Solid arrows with solid arrowheads indicate generation of molecules. Solid arrows with pointed arrowheads ? indicate diffusion of molecules. Hatched arrows indicate damaging effects.B An illustration of the ‘vicious cycle’ hypothesis. MtDNA damage leads to defective Electron Transport Chain complexes, which consequently increase ROS [25] production, potentially leading to further mtDNA damage 1.1.4 氧化应激性疾病及其防治 氧化应激是自由基的氧化反应对身体造成损害。自由基会破坏健康的细胞, 侵害人体 内的蛋白质、酶等物质,造成人体组织器官受到破坏,加速机体的衰老进程并 诱发癌症以 及心、脑血管等各种疾病。到目前为止,医学界已发现许多疾病都与自由基有关,特别是 退化性疾病。其中研究较多的有:动脉粥样硬化、肿瘤、白内障、辐射损伤与烧伤、衰老、 关节炎、肺病、肾病、皮炎与肝病等。即使是病毒性、细菌性疾病,虽然病原不是自由基 的缘故,但自由基也在其中起着推波助澜的作用。白内障是眼睛失明的重要原因,而自由 基有可能对眼睛造成化学性损伤,令眼睛晶体混浊,形成白内障,而多种自由基清除剂有 抗白内障的作用。此外,目前医学界发现了在癌变的两个阶段-诱癌与促癌,都有自由基 的参与。致癌物质在物理与化学因素作用下,成为自由基,从而引发癌症。因此,氧化应 激被认为是造成多种重大疾病和一些常见病的重要原因。 通过降低高氧化应激水平来预防疾病,主要是有效且安全地将过量自由基从体内除 去。在内源性干预方面,人体可通过某种方法增加体内用于对抗过量自由基的物质,如谷 胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、SOD 等蛋白质的分泌,或增强这 些蛋白质之间的协同作战能力,这主要是通过增强身体锻炼来实现的。但这种内源性干预 很容易受限,如人们无法坚持足够的锻炼等,而且随着年龄增长和机体老化,自体自由基 的产生在数量上急剧升高,而自身分泌的抗氧化应激物质有限,协同能力也大幅下降。这 就使得外源性干预特别重要,即通过某种方法将外源性抗氧化物质送进人体内,协助清除 过量的自由基。 开发外源性抗过量自由基的物质需要满足几个条件: 1 外源性抗氧化物质需具备很高的安全性; 2 外源性抗氧化物质应能够很快到达潜在病灶区捕捉过量的自由基; 3 外源性抗氧化物质的作用机理应类似于人体内源性特异酶(如 GSH-PX、CAT和 6暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 Fig 4 The relationship of oxidative stress and disease SOD等),确保外源性物质不会过量,维持人体内的自由基含量处于正常水平; 4 由于外源性抗氧化物质的用量有限,最好具有再生循环能力。 目前的相关研究着重于两个方面。一方面是开发大分子蛋白质类的自由基捕捉剂。由 于其结构与机体内部产生的基本相同,容易满足以上条件。但开发这类物质 的生产成本非 常高,而且这类位置需要采用注射方法进行输送,方便度和舒适性差。另一方面是开发满 足上述条件的小分子化合物,经口服途径进入机体内部。近年来的研究显示,有一些小分 子化合物和微量元素能够促进人体分泌 GSH-PX、CAT 和 SOD 等内源性物质,本身也具 有部分捕捉过量自由基的功能,如谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、维生素 C、硫辛酸、锌、 钒和硒等。 最近从天然植物中寻找有效的抗氧化物质用于维持机体健康一直是研究人员重点关 注的内容。一些可食用的草本植物也被报道过具有捕捉过量自由基的功能,如葡萄、苹果、 茶等。他们的共同特点是含有大量的多酚类化合物,能够清除体内过量的自由基,苹果多 酚是自然界较丰富的一大类含有酚类基团、具有清除自由基能力的强抗氧化作用物质。因 此,本论文以苹果多酚为实验材料,从氧化应激的角度进行研究。 1.2 苹果多酚与氧化应激 7暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 1.2.1 苹果多酚简介 苹果为我国产量最大的水果,资源十分丰富,有着很好的营养价值和特殊的保健作用, 含有丰富的植物纤维、糖、矿物质、苹果酸、维生素、蛋白质和多酚类物质,被列为我国四 大水果之首。其中多酚类物质因对苹果汁颜色、风味,如苦涩味、收敛性等的影响,越来 [26][27] 越受到人们的关注 。随着苹果产量的迅速增加,人们对苹果综合开发利用的研究也日 益关注,苹果多酚(Apple polyphenols,AP)的开发与利用成为近年来人们感兴趣的题目 之一。苹果多酚是苹果中天然存在的一类重要生物活性物质,可以作为食品添加剂使用和 [28]用于保健食品的开发,具有较大的开发价值和应用前景 。 苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的总称,苹果多酚由优质苹果的皮渣和蔬果提取 -1 而成。在一些酿酒苹果品种中其含量可高达 7 g?kg FM(鲜重计),普通的鲜食品种中其 -1 -1 含量范围在 0.5~2 g?kg FM。在欧洲一些酿酒苹果品种的果渣中其含量为 7.24 g?kg (干 -1 重计),其中槲皮苷配糖体就占了一半以上(4.46 g?W 。苹果多酚包括原花青素类(原花 青素 B2等)、酚酸类(绿原酸等)、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、根皮苷等。如Fig 5和 Fig 6所示,为苹果多酚主要化合物的指纹图谱和主要化学结构,由原花青素B2、 根皮苷、 [29] [30] 绿原酸、低聚原花青素等 ,有着很强的生物活性。 Fig 5 The finger print of apple polyphenols used in this project 8暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 1.2.2 苹果多酚的功能活性多酚类最初主要用作制革鞣剂,近 30 年这类天然产物与蛋白质、多糖、生物碱、微 生物、酶、金属离子的作用规律及抗氧化、捕捉自由基等一系列化学活性逐渐被人们所揭 示。 OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH O O O O OH OH OH H H H HO O O O OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH H H H HO O O O O O O O OH OH OH OH O O O O O O O O O O H H H HO O O O OH OH OH OH OH OH OH R R R R HO HO HOO O OC C C OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH : : ?-Ep ?-Epi icatechin catechin : : P Pr rocyanidin ocyanidin B2 B2 : : : P P Pr r rocyanidin ocyanidin ocyanidin B B B1 1 1 Chlorogenic Chlorogenic a acid cid : : + +- -Catech Catechin inOH OH OH O OH H H H O O O OH OH OH OH OH OH HO OH O O O O O O O O O OH H H HO O O OH OH OH H H HO O O Ph Phlorid loridz zin in Gallic Acid Fig 6 The main active ingredients of apple polyphenols used in this project 1 苹果多酚的抗氧化及清除自由基能力 苹果多酚提取物中的主要成分为绿原酸和原花青素类物质等,其结构的主要特征是多 [31] 羟基取代的苯环,苯环上的电子的离域作用使酚羟基容易离子化,是很好的氢供体 。多 酚类物质中含有大量的这种氢供体基团,具有很强的提供氢质子的能力,能使具有高度氧 化状态的自由基还原,由于电子离域作用而形成相对来说比较稳定的自由基,因此能够终 止自由基链式反应,阻止新的自由基的生成。另外,多酚类参与体内代谢发挥 药效功能, 除了直接清除有害自由基外,还能与蛋白质进行沉淀和多种金属络合,抑制某些氧化酶的 活性,对自由基进行间接的清除,如通过参加辅酶?的电子来终止自由基的反应。 2 苹果多酚对微生物的抑制作用 以单宁为主体的多酚对微生物具有广谱抗性(包括对丝状真菌、酵母、细菌、病毒的 抑制)。作为次生代谢产物,多酚不仅能抵御食草动物对植物体的损害,同时也阻止了微 生物的侵袭,包括提高对于各种病原菌的耐受力和保护受伤部位。除了对植物致病菌外, 多酚类对动物和其他环境多种微生物的生长都能产生明显的抑制作用。对细菌的最低抑制 -1 -1 浓度MIC范围一般为 0.012~1 g?L 之间,对丝状真菌为 0.5~20 g?L ,对酵母菌为 25~1259暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 -1 g?L 。除了对细菌、真菌有抑制作用之外,多酚对植物致病病毒如烟草花叶病毒、烟草坏 死病毒、芜青皱叶病毒等,动物和人的致病病毒如蛇毒、流感病毒、胞疹病毒、痘病毒、 狂犬病毒等都有一定的抑制作用。其作用机理可能是多种因素共同作用的结果,如对蛋白 质的高度结合能力、通过与细胞膜结合改变微生物的代谢以及对金属的络合作用等。 3 苹果多酚对酶的影响 多酚物质对生物大分子如蛋白质、多糖的结合特性以及与金属离子的络合特性等化学 性质使其具有多种生物活性,而这些生物活性最本质的方面体现在多酚对酶的影响。多酚 对酶促反应的影响作用可能是几方面因素共同作用的结果。首先,生物催化剂的酶其化学 本质是蛋白质,与一般的蛋白质一样,酶也可以与多酚结合生成可溶或不可溶的结合物。 结合物比较酶的构形有所改变,酶的催化活性降低或丧失;其次,对以蛋白质、多糖等生 物大分子为底物的酶促反应,多酚也可同时与底物结合,剥夺蛋白酶、果胶酶等的催化反 应底物,或生成对酶反应活性降低的底物;此外,金属离子如 Mg、Zn、Mn对某一些酶起 到激活作用,有的还作为酶的辅基构成酶催化活性部位,多酚对金属离子的络合也可对酶 产生抑制作用。另外多酚具有较高的紫外线吸收特征,特别是对能量高、破 坏能力大的紫 外区有更强的吸收,可作为抗衰老和防晒剂的有效成分。 1.2.3 苹果多酚的应用 由于苹果多酚的众多功能和性质,科研人员在医药、日用化工,食品如水产加工、肉 制品加工、面包、糕点、油脂及清凉饮料等行业进行了多酚的应用研究。 1 抗突变及抗癌作用 苹果多酚对食品或环境来源的苯并芘等致癌物致癌性起一定的抑制作用。Selvaraju等 [32] 对“苹果多酚化合物抗肿癌作用”进行了研究,苹果多酚可以用于预防肺癌、乳腺癌、 皮肤癌和结肠癌等。在对多酚化合物的细胞培养实验中进一步发现,只有其中的花青素原 (前体物质)才有此作用,它比全体多酚化合物的抗肿瘤效果高,其肿瘤大小只有后者的 [33] 1/5,说明原花青素是苹果多酚化合物中抗癌的有效成分 。 2 抗衰老作用 [20] 衰老的自由基学说是Harman在 1955 年提出的 ,在众多衰老理论中一直占有重要位 置。该学说认为,人的衰老和致病因子与机体活性氧自由基(Oxygen free radicals,OFR) 直接有关,若这类自由基超过生理的局限,则对多聚不饱和脂肪酸、糖、蛋白质和核酸等 生物大分子产生损伤,导致细胞功能衰退及代谢紊乱,诱发多种疾病产生。因此,过量自 10暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 由基与衰老成因有直接关系。苹果多酚能提高人体内酶类自由基清除剂SOD、CAT和 GSH-PX等的活力,延缓衰老的进程。苹果多酚抗衰老表现在预防与衰老相关的疾病。 3 治疗各种炎症作用 各种炎症的发病机理为:进入生物体内的异物是对健康者影响很小的抗原物质,但人 体从T细胞放出的细胞分裂素,使体内一般细胞产生的IgE抗体被含有IgE受体的细胞接收, 则产生细胞的脱落颗粒,脱落颗粒可引起组胺、游离因子、血小板活化因子、前列腺分泌 物等物质从细胞中释放,结果引起毛细血管的渗透性增强,产生支气管哮喘、鼻炎、人体 过敏及麻疹等病症。使用苹果多酚能有效抑制组胺的游离,因而被作为抗变异药物使用。 [34] Tomomasa等 在试验中使用苹果多酚可抑制大鼠嗜碱细胞性白血病细胞(Rat basophilic leukemia cell,RBL-2H3)和巨噬细胞的组胺释放,因此苹果多酚可以起到抗过敏作用。 [35] Naoto等 研究证明苹果多酚与霍乱病毒协同作为粘膜佐剂,能降低霍乱病毒的毒性,同 时能降低霍乱病毒所致的血清中的IL-1 β、IL-6和TNF- α和脾脏中IgA和IgE的升高。 4 抑制高血压、高血脂及心脑血管疾病作用 苹果多酚对血管紧张肽转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性的实 验中发现:苹果多酚中的缩合鞣质类约占总多酚的一半,且其ACE抑制活性比茶多酚的主 要成分儿茶素和表儿茶素要高,可以有效治疗高血压、高血脂及心脑血管疾病。苹果多酚 [