中华鳖养殖中芽孢杆菌、嗜水气单胞菌及其噬菌体的分离和性质的研究

中华鳖养殖中芽孢杆菌、嗜水气单胞菌及其噬菌体的分离和性质的研究 中蚃蚃蚃殖中芽蚃杆菌、嗜水蚃胞菌气 及其菌的分和性蚃的究噬体离研 密 蚃: 校代蚃学:10075 分蚃号: 学号:20091061 理蚃士位蚃文学学 中蚃蚃蚃殖中芽蚃杆菌、嗜水蚃胞菌气 及其菌的分和性蚃究 噬体离研 学位申蚃人: 王志蚃 指蚃蚃教:管越强 授 教 学 位 蚃 蚃 : 理蚃士 学 学 科 蚃 蚃 : 水生生物 学 授 予 蚃 位 : 河北大 学 答 蚃 日 期 : 二?一二年五月 Classified Index: CODE: 10075 U.D.C: NO:20091061 A Dissertation for the Degree of M. ScienceIsolation and characterization of Bacillus, Aeromonas hydrophila and their phage during Pelodiscus sinensis’s farming Candidate: Zhi-li Wang Supervisor: Prof. Guan Yueqiang Academic Degree Applied for: Master of Science Specialty: Hydrobiology University: Hebei University Date of Accomplishment: May,2012摘 要 摘 要 目前,我中蚃蚃主要采用集蚃化蚃殖方式国,高密度的控蚃殖蚃好的蚃蚃效温来很 益,但蚃以及排泄物的蚃累也使得水蚃蚃化残,微生蚃蚃境失蚃,易爆蚃中蚃蚃疾病。极 目前人蚃多采取蚃物投放、蚃料添加抗生素以及施加微生蚃制蚃的方式蚃蚃水蚃、蚃来防治蚃疾病的爆蚃与,其中微生蚃制蚃以无蚃染、生蚃蚃保等蚃点受到人蚃蚃蚃。芽蚃杆菌是微生蚃制蚃的常用菌之一,在蚃化水蚃方面具有好的作用很,但在其生蚃蚃程中 曾蚃生蚃菌蚃染造成大蚃失。除此之外噬体很,菌治蚃是一蚃蚃蚃蚃菌性疾病非常噬体 有蚃展前景的治蚃方式,具有特性强、不危害有益菌群、无蚃物留等特点异残,已蚃有 一些者以小鼠、蚃、猪、虹蚃蚃等生物蚃蚃象蚃行了相蚃究取得了蚃好的成果学研并,但到目前蚃止蚃未有蚃似究以中蚃蚃蚃究蚃象。本蚃蚃以中蚃蚃蚃蚃蚃蚃象研研,自其蚃蚃中分芽蚃杆菌蚃行菌蚃蚃定离并,自蚃殖水中分芽蚃杆菌以及常蚃致病菌嗜体离 水 气噬体并研蚃胞菌的菌蚃行性蚃究,初步探蚃芽蚃杆菌菌蚃染的蚃防措施以及噬体 中蚃 蚃蚃菌性疾病的菌治蚃噬体,蚃蚃蚃果如下: 1 自中蚃蚃蚃道蚃蚃中分出 离3 株芽蚃杆菌,蚃菌落及菌形蚃、主要生理生化特体 征蚃定及 16S rDNA序列分析,其中一株菌被蚃定蚃短小芽蚃杆菌Bacillus pumilus,另 外 2株菌蚃沙福芽蚃杆菌Bacillus safensis。 2 以所分短小芽蚃杆菌蚃指示菌离,中蚃蚃蚃殖水中分得到其菌。蚃从体离噬体噬 菌具有蚃高的蚃蚃定性和蚃的 体广pH适蚃范蚃,可在 pH4~9 范蚃生蚃繁殖内,也可在 80 ?以下的蚃境中存活,但蚃 80 ?以上的高敏感温,蚃紫外蚃照射也比蚃敏感,照射 蚃蚃超蚃 6 min菌全部失活噬体;宿主的吸附蚃蚃不超蚃 与5 min;佳感染蚃昀数 MOI 蚃 0.001;一步生蚃曲蚃蚃果明,蚃菌感染宿主菌的伏蚃蚃蚃 噬体潜10 min,爆蚃蚃 蚃蚃 70 min,裂解量蚃蚃 94.25,伏期短、裂解潜量大,具有蚃强的“毒性”。 3 以水蚃蚃殖常蚃致病菌??嗜水蚃胞菌蚃宿主菌气,自中蚃蚃蚃殖水分相蚃体离 噬体菌,蚃菌性蚃及其宿主的蚃蚃蚃并噬体与研系等蚃行蚃究分析,蚃菌蚃噬体法在中蚃 蚃蚃殖中的蚃用奠定基蚃。蚃果表明分的的菌蚃裂解性菌离噬体噬体,菌噬斑透明、蚃 蚃整蚃。蚃菌蚃 噬体pH具有蚃的适用范蚃广,但蚃酸性蚃境比蚃敏感,pH5蚃几乎无 噬菌斑形成;宿主菌的吸附蚃蚃与略蚃,大蚃蚃 20 min;蚃紫外蚃射具有强的敏感很性, I摘 要 20 s 的紫外照射便使大量的菌噬体死亡,30 s 以上的紫外照射可使菌噬体全部失活;蚃 高蚃理也非常敏感温,超蚃 50 ?蚃,蚃低稀蚃倍数双的蚃平板上有 1~3菌个噬斑形成。 昀数佳感染蚃的蚃蚃蚃果蚃示, 当MOI0.1 蚃,菌噬体昀滴度高,而当 MOI0.001 蚃, 噬体昀菌滴度低;一步生蚃曲蚃蚃果蚃示,菌的伏蚃蚃蚃蚃 噬体潜50 min,爆蚃蚃蚃蚃 蚃 40 min,蚃嗜水蚃胞菌的裂解气量蚃蚃 92.8,裂解能力高。菌其宿主菌的噬体与 蚃蚃 蚃系研究蚃果表明,添加适蚃度的菌可以有效当噬体气降低嗜水蚃胞菌的蚃度,并使其 蚃持在蚃低的蚃度下形成蚃蚃平衡,不到达引蚃疾病的危蚃蚃度范蚃,而噬体菌的蚃度 在添加之后蚃有小幅度的蚃化。 蚃蚃体来,短小芽蚃杆菌菌蚃宿主菌噬体侵染能力强,但蚃紫外照射、高蚃理比温 蚃敏感,可采用紫外、高等方温噬体法消蚃菌,避免噬体菌蚃染;嗜水蚃胞菌菌气噬体 侵染宿主菌的爆蚃蚃蚃短,裂解量大,能有效降低嗜水蚃胞菌的蚃度气,但蚃生蚃条件 略微苛刻,蚃境蚃酸、紫外照射、度蚃高温均可能使其失活,蚃是蚃展菌治蚃蚃蚃噬体 当注意的蚃蚃。 蚃蚃蚃 中蚃蚃 芽蚃杆菌 嗜水蚃胞菌 菌 蚃菌蚃定 气噬体IIAbstract Abstract At present, the farming methods of Pelodiscus sinensis in China is mainly intensive culture which bring good economic benefits. While the accumulation of bait and feces had led to the deterioration of water quality and the disorder of the micro- ecological environment, easy to an outbreak of disease during its farming. People mainly take the drug delivery, antibiotics to the food and the use of probiotics to regulate the water quality and to prevent the diseases, and the use of probiotics is the better one because of its non-polluting and eco-friendly. Bacillus is one of the common bacteria of probiotics which has a good effect on water purification, while there had been bacteriophage pollutions during the production of Bacillus, causing great losses. In addition, phage therapy is a promising treatment with bacterial diseases, high specificity to pathogens, harmless to beneficial bacterias and no residual, and some scholars had carried out several relevant research on mice, chickens, pigs, rainbow and other organisms which had achieved good results, while there’s no similar study of P.sinensis, In this paper, bacillus were isolated from the intestinal tracts of P.sinensis, and then identification of these Bacillus were in search, while one bacteriophage of one of these Bacillus had been isolated, and it’s nature were studied in this paper, discussing the prevention measures to phage pollution of Bacillus. Another bacteriophage had been isolated from the aquaculture water of P.sinensis, and Aeromonas hydrophila is it’s host bacteria, which is the common pathogens of aquaculture.The nature of phage and the dynamic relationship between the phage and it’s host were studied in our paper, discussing the application of phage therapy in aquaculture. The results are as follows: 1 Three strains of Bacillus were isolated from the intestinal tracts of Chinese soft-shell turtle P.sinensis. One of them was identified as B. pumilus, the other two were identified as Bsafensis, based on the results of morphological, physiological and biochemical characteristics and the homological analysis of 16S rDNA sequence 2 Using B. pumilus,one of the three strains, as the host bacteria, one bacteriophage had been isolated from the aquaculture water of P.sinensis, and some of its characteristics wereIIIAbstract studied. The results showed that the phage has a high thermal stability and wide range adaptation of pH, that it can grow and reproduce within pH 4~9, can also survive in the environment below 80 ?, but it is sensitive to temperatures above 80 ?, and more sensitive to UV that all phage were inactivaty more than 6 min exposure time. In addition, the adsorption time of this phage to its host is less than 5min, high incidence of phage contamination, and the optimal multiplicity of infection is 0.001, high ability to infect Bacillus.What’s more, this phage’s incubation period was 10 min, the time of burst phage was 70 min, and the burst size was about 94.25. In short, this bacteriophage has a relatively short incubation period and a large burst size, with a greater harm to B. pumilus 3 Using A.hydrophila as the host bacteria, The phage isolated frome the aquaculture water of P.sinensis is lytic phage, whose plaque is transparent with tidy edge.The results showed that the phage has a wide range adaptation of pH, but sensitive to low pH that there almost have no plaque when pH5, the adsorption time of this phage to it’s host is slightly longer with 20 min, and it is very sensitive to UV that all lots of phages were die with 20 s exposure time and all phage were inactivaty more than 30 s exposure, and this phage is also very sensitive to high temperature that almost all phage lost their activity in the environment above 50 ?.The experiment of optimal multiplicity of infection showed that, the phage had highest phage titer when MOI0.1 and lowest phage titer when MOI0.001, different with the other referencesThe one-step growth curve showed that, this phage’s incubation period was 50 min, the time of burst phage was 40 min, and the burst size was about 92.8, having great cracking capacity. In addition, The dynamic relationship of the phage and its host bacteria results show that, adding appropriate concentration of phage can effectively reduce the concentration of A.hydrophila to a safe level that lowe enough to avoid related diseases, and the concentration of phage only have a slightly change, having a dynamic equilibrium near the first concentration ultimatelyIn summary, the phage of B. pumilus has a great infection capacity to host, and it is sensitive to UV irradiation and heat treatmen, UV and heat can be used to eliminate the phageIVAbstract to avoid the phage pollution.The phage of A.hydrophila has short incubation period and large burst size when infecting the host, having great effectivity in reducing the concentration of A.hydrophila, but its growth and reproduction require more suitable conditions, as it is sensitive to acidic environment, UV and high temperature, which may limit the development of the phage therapy Key words Pelodiscus sinensis Bacillus Aeromonas hydrophila Bacteriophage Bacteria identificationV目 蚃 目 蚃 第 1 章 蚃 蚃 1 1.1 中蚃蚃1 1.1.1 形蚃特征1 1.1.2 生活蚃性及地理分布 1 1.1.3 蚃蚃价蚃2 1.1.4 蚃殖蚃状2 1.2 芽蚃杆菌. 3 1.2.1 芽蚃杆菌生物特性 学4 1.2.2 芽蚃杆菌在水蚃蚃殖中的蚃用4 1.3 嗜水蚃胞菌气5 1.3.1 嗜水蚃胞菌特征及其分气布 5 1.3.2 嗜水蚃胞菌的危害 气6 1.3.3 嗜水蚃胞菌感染气条件及病症6 1.3.4 治蚃蚃策7 1.4 菌及菌治蚃噬体噬体8 1.4.1 菌 噬体8 1.4.2 菌治蚃蚃蚃及噬体局限性. 9 1.4.3 菌蚃噬体医学法在中的蚃用. 10 1.4.4 菌蚃噬体法在水蚃蚃殖中的蚃用11 1.5 本究的目的和研意蚃 12 第 2 章 中蚃蚃蚃殖中芽蚃杆菌的分蚃定离. 14 引 言 14 2.1 方与法. 14 2.1.1 蚃蚃材料 14 2.1.2 蚃蚃 15 2.2 蚃果. 16 2.2.1 蚃菌的生理生化蚃定. 16VI目 蚃 2.2.2 蚃菌的 16S rDNA蚃定. 19 2.3 蚃蚃. 22 第 3 章 短小芽蚃杆菌菌的分性蚃究噬体离与研24 引 言 24 3.1 材料方与法. 24 3.1.1 蚃蚃材料同 2.1.124 3.1.2 蚃蚃方法 24 3.2 蚃果. 26 3.2.1 短小芽蚃杆菌菌的分性蚃究噬体离与研26 3.2.2 菌的生物特性噬体学. 29 3.3 蚃蚃. 30 第 4 章 嗜水蚃胞菌菌的分性蚃究气噬体离与研33 引 言 33 4.1 材料方与法. 33 4.1.1 蚃蚃材料 同 2.1.1 33 4.1.2 蚃蚃方法 33 4.2 蚃果. 35 4.2.1 嗜水蚃胞菌菌的分及性蚃究气噬体离研35 4.2.2 菌的生物特性噬体学. 38 4.2.3 嗜水蚃胞菌及其菌的蚃蚃蚃气噬体系 39 4.2.4 菌保存噬体条件 42 4.3 蚃蚃. 43 第 5 章 蚃蚃展与望46 5.1 蚃蚃46 5.2 蚃于下一步工作的展望47 参献考文. 48 致 蚃54 攻蚃位期蚃取得的科成果学研. 55VII第 1 章 蚃 蚃 第 1 章 蚃 蚃 1.1 中蚃蚃 中蚃蚃,属于爬行蚃Reptilia、蚃蚃蚃蚃Testudinata、蚃蚃目Testudoformes、蚃 科Trionychidae、蚃属Pelodiscus,学名蚃 Pelodiscus sinensis,俗名有甲蚃、王八、 元 [1,2] 蚃、蚃蚃、水蚃等 。 1.1.1 形蚃特征 [3] 据《中蚃物志国》 蚃蚃,蚃科蚃物具有如下特征:蚃而平的骨蚃背甲,表体覆柔蚃的革蚃皮蚃;蚃蚃能垂直蚃入壳内;蚃被两肉蚃唇,吻端形成吻突;蚃骨蚃区敞蚃,前蚃骨愈合,蚃椎蚃蚃,体内没骨板有完全骨化,肋骨肋板愈合与,并突出于肋板外蚃;四肢具三爪。 作蚃蚃科蚃物的一蚃,中蚃蚃在大蚃 2蚃年的蚃化蚃程中也形成了蚃定又独特的形蚃蚃构,蚃蚃境具有非常强的适蚃力。中蚃蚃体躯扁平,呈蚃蚃形,背腹具甲,由蚃蚃蚃接;背甲暗蚃色或褐色黄,蚃蚃蚃厚蚃的蚃蚃蚃蚃,俗“裙称蚃”; 腹甲灰白色或黄白色,平坦光滑,有 7 个胼胝体,分蚃在上腹板、内与体腹板、舌腹板下腹板蚃 及蚃 板上;通覆柔体蚃的革蚃皮蚃,无角蚃盾片;体色基本一致,无蚃明的淡色斑点;蚃蚃,呈蚃筒状,伸蚃自如,蚃部粗大,前端尖呈三角形;吻端延蚃呈管状,具蚃的肉蚃吻突,蚃与径眼相等,鼻孔在吻突的前端,口蚃蚃、上下鄂具角蚃突;眼小,位于鼻孔的后方两;蚃口无蚃,蚃蚃敏蚃;四肢扁平,后肢比前肢蚃达,前后肢各有 5趾,趾蚃有蹼,内蚃 3趾有蚃利的爪,四肢均可蚃入甲壳内,尾部蚃短。 1.1.2 生活蚃性及地理分布 中蚃蚃是水蚃两温栖、肺呼吸、卵生的蚃爬行蚃物,在安静清阳、蚃、光充足的水岸蚃活蚃蚃蚃繁,生活于江河、湖沼、池塘、水蚃等水流平蚃、蚃蚃繁生的淡水水域,也常出没于大山溪中,能在水中自由游泳,也能上岸在蚃地活蚃,但是不能离水 源太蚃。 喜蚃晒阳太、乘凉蚃,夏天有上岸盖晒的蚃蚃,多在夜蚃活蚃蚃食或蚃卵繁殖。在我国北方,中蚃蚃在 10 月底蚃始冬眠,第二年 4 月蚃份始蚃食,喜蚃吃蚃蚃、昆虫等,也吃谷蚃、水草等植物性蚃料,并且特蚃嗜食蚃蚃、臭蚃等腐蚃蚃蚃的蚃料,抗蚃蚃,但 1河北大理蚃士位蚃文 学学学 是蚃食、残忍,如果缺乏蚃料蚃相会残互蚃,吃蚃方尸体,小胆怕声音,白天多数况情 下伏在水中潜或者底泥中,夜蚃浮出水面蚃食。 中蚃蚃寿达命可 60蚃以上,一般 4~5蚃成熟,4~5月水中交配,待 20 d蚃卵,多 次性蚃卵,雌性在繁殖季蚃一般可蚃卵 3~4次,至 8月蚃束;通常首次蚃卵蚃 4~6枚, 体重在 500 g左右的雌性可蚃卵 24~30枚;蚃卵点一般蚃境安静阳、干燥向、土蚃松蚃。 由于具有蚃强的适蚃蚃境的能力,中蚃蚃分布非常广泛,在我除了国青西藏、海以 及新疆之外的其他地均区有分布,以蚃江流域和蚃南地区蚃多蚃,外主要分国布在越南, [4] 20世蚃中后期被引入到日本、泰国国来、蚃以及蚃西蚃等地 。 1.1.3 蚃蚃价蚃 中蚃蚃昀重要的蚃蚃价蚃是食用,的蚃蚃和它滋蚃价蚃早在 3 000年前就被人蚃所 蚃蚃。其与体他蚃物的蚃成相比,蚃体蛋白蚃含量高,富含人体氨氨必需的基酸和蚃味 基酸;含有丰富的蚃物蚃成分,而且微量元素蚃、蚃和硒很含量高,具有蚃血蚃蚃的功 能,能蚃有效地提高人活体力;脂肪中有 70%以上蚃不蚃和脂肪酸,高度不蚃和脂肪酸 占 25%以上,其中 DHA二十碳五蚃酸和 EPA二十六碳很蚃酸含量高,能抑制血小板 凝蚃,防止血栓形成和蚃脉硬化,降低机固醇体内胆的含量,被蚃称"蚃黄金";蚃体内 生素的含量也极丰富,尤其是具有抗化氧功能的蚃生素 E,蚃防止人蚃胞体老化、化解 蚃性蚃瘤有重要作用。由于具有如此丰富的蚃蚃价蚃,中蚃蚃常被人蚃作蚃一蚃珍品佳 [5] 肴和具有滋蚃功能的特殊食品 。 除此之外,中蚃蚃的蚃蚃价蚃蚃蚃在蚃方面。蚃蚃用体医医于蚃已蚃有近 2 000年的蚃史,蚃甲是常用中蚃材,有滋蚃、壮阳散蚃消蚃的功能,可治多蚃疾患。裙蚃胶原[6] 蛋白富丰,可以作蚃猪皮、牛皮胶胆原蛋白的有效替代品 。蚃的蚃、肉、血、亦均 能 入蚃,蚃蚃用于脱肛、痔蚃等,肉能滋蚃蚃和虚祛蚃通蚃,蚃血可以治蚃蚃体衰弱。中蚃蚃制品蚃具有抗癌、防止白蚃胞减少等作用,目前以蚃蚃国内原料制作了各蚃滋蚃 品、 蚃蚃和胶囊制蚃等。 1.1.4 蚃殖蚃 状 我国湾台省人工蚃蚃始于 20世蚃 50年代,主要集中在南部,年蚃近千吨国。我大蚃各省市的中蚃蚃商蚃蚃殖始于 70年代后期,80年代是其蚃累蚃段,蚃入 90年代后 中 蚃蚃蚃殖蚃迅速蚃展,蚃在我的中蚃蚃蚃殖蚃已蚃蚃国入了蚃定蚃展蚃期,全蚃国量超2第 1 章 蚃 蚃 蚃 10000 t 大蚃,蚃蚃蚃 50蚃,占水蚃蚃殖蚃蚃量的 1%,占淡水蚃殖蚃蚃蚃的 7%左右,形成了大蚃模、有影响的特蚃水蚃蚃殖蚃蚃。 目前,我中蚃蚃蚃殖蚃在蚃殖范蚃上国几乎遍布各省,蚃量之高已蚃居世界之首,蚃殖蚃模也一直呈蚃大蚃蚃。但是,随国着蚃蚃蚃形蚃的改蚃,以及人蚃蚃生活蚃量的要求越越高来,中蚃蚃的蚃殖仍存在着一些蚃蚃。 首先,慢慢蚃展起来的集蚃化蚃殖方式蚃短了蚃的蚃成期,大大提高了中蚃蚃的蚃[7] 量,但高密度的蚃殖及封蚃式温坏晒室等破了蚃的甲等自然蚃性,使得蚃病易爆蚃极 。 其次,在我北方国,不少蚃殖蚃仍采用常温粗放蚃殖模式,但老蚃殖企蚃的温室蚃构装、蚃施配、水蚃的管理、蚃料加工和投蚃技蚃等比蚃落后,不蚃使周蚃的生蚃蚃境蚃化,也使得蚃病蚃生率高,使得蚃殖成本高,高品蚃的中蚃蚃所占比例低,蚃以适蚃[8] 激烈的市蚃蚃 。 争 再次,近几国年我加强了蚃蚃牧蚃品的重蚃,但相蚃忽蚃了畜禽、水蚃品的蚃量和食品安全蚃蚃 如使用蚃禁蚃物、激素、蚃量使用添加蚃等 ,造成了蚃品品蚃下降,食品安全无保障,直接或蚃接地危害着人蚃的健康和生存蚃境。作蚃世蚃蚃蚃的一蚃,我的蚃国品必蚃蚃格按照蚃蚃蚃蚃布的各蚃蚃品蚃准蚃蚃生蚃,低蚃量甚至是存在食品安全蚃蚃的中蚃蚃必然不蚃足要求。 蚃蚃体来,面蚃新的蚃形蚃以及人蚃越越高的生活国来需求,我的中蚃蚃蚃殖蚃国 蚃不断地提高蚃殖水平和管理水平,采用先蚃的科蚃殖学模式,推广生蚃蚃殖的理念,施用蚃蚃、高效的配合蚃料,加强蚃蚃病的蚃防,在降低蚃殖成本的同蚃重蚃蚃境保蚃与食品安全蚃蚃,向着无公害、可持蚃、高品蚃、高效益的方向蚃展。 1.2 芽蚃杆菌 高密度、高蚃量、高效率的集蚃化工厂蚃殖,是一蚃生蚃系蚃比蚃特殊的蚃殖方式,蚃殖蚃程中需要不断喂地投蚃料,使用蚃物和消毒蚃等蚃防疾病来,然而蚃殖水比蚃体封蚃独立,蚃蚃的排泄物、蚃以及有残清机碎屑不能及蚃除,从体而蚃致蚃殖水中有机物蚃度急蚃增加,破坏体了水自蚃能力,蚃些物蚃不被化分解断氧,蚃致、蚃氨氮硝酸氮的蚃累增加,造成生物中毒。 芽蚃杆菌是微生蚃制蚃常用菌,因其特性蚃常被用蚃化水蚃。独来3河北大理蚃学学 士位蚃文 学 1.2.1 芽蚃杆菌生物特性 学 芽蚃杆菌,革蚃氏阳性菌,好氧,蚃异,能蚃生蚃子,耐高温,抗蚃激性强,是目前改良水蚃的水微生蚃蚃控蚃中常用的菌蚃体,具有特的性蚃。和独早期使用的微 生蚃 制蚃菌株--光合蚃菌、硝化蚃菌等相比,芽蚃杆菌蚃定性好、抗性强,具有耐高、温耐酸碱、耐蚃蚃等特点,芽蚃一旦生成便能耐受各蚃不利件条,在工蚃生蚃制粒蚃程中以[9] 及通蚃蚃殖蚃物酸性胃蚃境蚃均能保持高度蚃定性 ;蚃藏蚃程中,芽蚃杆菌以休眠蚃子的形式存在,具有蚃蚃定性可以蚃蚃蚃保存,不消耗蚃料的蚃蚃成分,保蚃蚃料品蚃[10] 。 芽蚃杆菌蚃水蚃的蚃化主要蚃在方面体两:具有丰富的蛋白蚃、脂肪蚃、淀粉蚃、[11] 蚃蚃素蚃等 ,在水体体增蚃蚃程中分泌出的蚃些高活性蚃蚃能强烈地分解蚃殖水以及底泥中的碳氮磷系、系、系、硫系蚃染物,分解蚃蚃多糖、蛋白蚃和水溶性有机物,降低水体富蚃蚃化,减少底泥生成,在水蚃境中形成蚃蚃菌群并;生蚃繁殖蚃程中分会泌一些蚃菌素等物蚃,蚃蚃殖水中的蚃蚃菌、体异弧菌等致病菌的生蚃和繁殖具有一定 的 抑制作用。 除了蚃水蚃具有一定的蚃化能力,芽蚃杆菌蚃于蚃蚃的蚃菌性感染也有一定的抑制作用。在生蚃繁殖蚃程中,芽蚃杆菌耗氧能力非常强,蚃入蚃蚃体内后可以消耗掉蚃量的气体,造成蚃蚃蚃蚃蚃内氧状,抑制好致病菌的生蚃氧;在蚃子形成或蚃蚃蚃胞蛋白水解的蚃程中,能蚃生抗生素,可以作蚃生物控制素,且蚃一些蚃光的弧菌蚃有生蚃拮抗作[12] 用,能蚃减少蚃蚃的疾病感染,提高其成活率 ;生蚃繁殖蚃程中能蚃蚃生 B族蚃生素和蚃生素 C及 KZ,蚃能蚃生植酸蚃促蚃水蚃蚃物蚃植酸磷的利用和蚃脂肪的消化吸 收; 繁殖蚃程中蚃生的蚃蚃性脂肪酸能降低蚃物蚃道 pH,降低氨蚃度,促蚃益生乳酸菌的 [13] 生蚃 。 1.2.2 芽蚃杆菌在水蚃蚃殖中的蚃用 芽蚃杆菌是第一蚃用于水蚃中的益生菌,1986 年,Kozasa 首次土从离壤中分出 1 株芽蚃杆菌添加到日本蚃蚃(Anguilla japonica)蚃料中,降低了蚃体因感染蚃德蚃氏菌 [14] Edwardsiella tarda的死亡率 。1998年,Laurent verschuere把它添加到日本蚃的蚃殖 [15] 水中体,有效减少了由蚃德蚃氏菌引起的蚃蚃大量死亡 。到目前蚃止,多究蚃明很研 [16] 芽蚃杆菌能大大降低水中蚃硝酸蚃的含量 ,在蚃化水蚃方面具有好的很功效。1999 4第 1 章 蚃 蚃 年,蚃蚃等人向蚃非蚃蚃殖水中添加以芽体抱杆菌蚃主的微生物蚃合菌蚃,能明蚃改善 水蚃条件,降低氨氮、蚃硝酸蚃,提高蚃非蚃的生蚃。2002 年,任保振等在温室蚃蚃池 投喂蜡含有蚃芽抱杆菌的有益微生物,蚃果降低了水中的有体机蚃染物的 COD、氨氮 [17] 含量以及蚃硝酸氮的含量,而且池水和底沙中的蚃蚃菌异数量也明蚃增加 。 除 此之 外,芽蚃杆菌蚃蚃殖水的蚃蚃菌和体异弧菌生蚃和繁殖也具有一定的抑制作用,同蚃促 蚃底泥异蚃菌的生蚃、浮游微藻的平蚃繁殖,不蚃能蚃抑制水中体条件致病菌的繁殖, [18] 也促蚃了蚃池物蚃和能量的循蚃,有利于蚃池的自我蚃化 。 作蚃近几年新蚃的微生蚃制蚃中常用的益生菌,芽蚃杆菌充分蚃了自体己的蚃蚃, 在蚃解蚃殖水的微生蚃蚃境、体减少蚃蚃的疾病蚃生以及提高蚃蚃蚃量方面也已取得了 蚃好的成效,然而在芽蚃杆菌抗菌物蚃生蚃以及水蚃蚃用蚃程中,曾蚃生菌蚃染噬体, [19] 造成了一定的蚃失 ,因此究芽蚃杆菌及其菌的性蚃研噬体,蚃其蚃用将于水蚃蚃殖蚃 程中的水蚃蚃化及疾病防治、避免生蚃蚃用蚃程中的菌蚃染等方面具有与噬体重要意 蚃。 1.3 嗜水蚃胞菌 气 1.3.1 嗜水蚃胞菌特征及其分气布 嗜水蚃胞菌气(Aeromonas hydrophila),属于弧菌科(Vibrionaceae)气属蚃胞菌 [20,21] (Aeromonas),嗜有蚃温力菌群,是蚃胞菌的气模式蚃 ,革蚃氏蚃性,蚃酵型, 短杆状,直形或略弯,两端蚃蚃, 大小蚃蚃 0.5~1.2×2.0~2.8 μm,无芽蚃,无蚃膜,兼性 蚃氧,具生蚃极鞭毛,蚃性强运,在水中以直蚃或自蚃方式蚃。蚃菌蚃生蚃运条件要求 不蚃,可在多蚃培蚃基上生蚃:在普通蚃蚃蚃脂培蚃基上生蚃良好,菌落蚃蚃形,半透 明,乳白色至色奶黄,蚃蚃整蚃,表面蚃、湿光滑,中蚃有隆起,不蚃生色素,菌落的大小与温培蚃蚃蚃及度有蚃,直径昀达大可 3~4 mm;在蚃血蚃脂培蚃平板上有强很 的 [22] 溶血性,形成的菌落周蚃有明蚃的完全β溶血蚃,溶血蚃蚃且通明 ;在肉蚃培蚃基中生蚃迅速,无菌膜和菌蚃; M 蚃脂和 SS培蚃的菌落呈无色;伊蚃美蚃蚃脂培蚃的菌落呈粉蚃色; RS蚃脂培蚃的菌落呈色黄昀温。适生蚃度蚃 28~35 ?, 适宜 pH范蚃蚃 5.5~90,可以在 NaCI 蚃度蚃 0%~4%的培蚃基中生蚃。 嗜水蚃胞菌蚃气氧兼性蚃菌型,不能在含 5%NaCl 的蚃蚃肉蚃中生蚃,可蚃酵多蚃糖,如葡萄糖、果糖、蔗糖、芽麦苷糖、阿拉伯糖、甘露醇、水蚃等,能蚃酵多蚃水碳5河北大理蚃士位蚃文 学学学 化合物,蚃酸和或蚃气,不蚃酵乳糖和肌醇,化蚃、氧V-P 蚃定、硝酸蚃蚃原、明胶蚃蚃、蚃氨脱氨双胶阳酸蚃蚃、精酸水解、液化明、蚃蚃蚃蚃均蚃性,MR、蚃氨脱酸蚃蚃、尿素蚃蚃蚃性,蚃生硫化蚃,蚃弧菌抑制蚃不敏感。蚃菌蚃外界蚃境的抵抗力甚强,蚃蚃蚃要求低,有水就能常年累月地生存,但蚃干燥抵抗力弱,紫外蚃蚃蚃照射 24 h 失即去活力。 除此之外,嗜水蚃胞菌存在气着非可培蚃viable but non-culturable,VBNC蚃状,蚃蚃蚃上是一蚃休眠状,菌蚃小成蚃体状球,耐低温及不良蚃境,可存活蚃蚃蚃很,一旦温条度回升或者蚃得生蚃所需要的蚃蚃件,VBNC蚃的蚃菌状状又可回蚃到正常蚃,[23,24] 重新具有致病力 ,因此嗜水蚃胞菌有强的伏性。 气很潜 1.3.2 嗜水蚃胞菌的危害 气 嗜水蚃胞菌气广泛存在于自然界中,尤其以水蚃境蚃主,在淡水及含有机物的水 中、 [25] 淤体离泥及淡水蚃的表均可以分得到,可引起多蚃蚃蚃蚃染病 ,常常蚃致蚃、蛙、蚃蚃的蚃菌性蚃血病或出血病,甚至皮腐赤斑腐蚃,曾有究者蚃道蚃菌研会引起蚃科蚃暴[26-28] 蚃性蚃染病、牛蛙暴蚃性疾病,甚至引会起甲蚃出血性蚃血症 ,急性暴蚃,具有非常高的死亡率,蚃蚃殖蚃蚃大的蚃蚃蚃失来极,是淡水蚃殖蚃蚃及甲蚃暴蚃蚃菌性蚃染病的主要病菌之一。上世蚃 90 年代,我国南方各省淡水蚃殖蚃蚃流行暴蚃性蚃染 病, [26] 一些蚃道其致病菌称气便蚃嗜水蚃胞菌 。 [30-32] 此外外的一些究蚃蚃蚃蚃菌是一蚃国研典型人?蚃?蚃共患病病原 ,在其水它生蚃蚃蚃物、哺乳蚃物亦有蚃似蚃蚃,不蚃可以使蛙、蛇、蚃致病,而且蚃可引起人的感染,蚃致可致蚃蚃感染及急性腹蚃;人蚃因感染蚃菌而蚃生胃蚃炎及蚃口感染的病例日蚃增多,在食品蚃生蚃蚃中,某些国将气家已嗜水蚃胞菌定蚃必蚃蚃菌。 1.3.3 嗜水蚃胞菌感染气条件及病症 嗜水蚃胞菌是气条件性致病菌,其寄生性与没腐生性有明蚃的界限,水蚃蚃蚃蚃一般无致病力,而当残蚃殖密度蚃高、蚃多水蚃富蚃蚃化、水蚃境蚃化蚃,蚃菌的毒力提高,很屏容易突破蚃蚃脆弱的防御障而使其蚃病。 嗜水蚃胞菌的致病性主要是气因蚃其在生蚃繁殖蚃程中可以蚃生多蚃致病因子,包括 HEC 毒素、蚃毒素、溶血毒素、蚃胞毒素等外毒素和胞外蛋白蚃、脂蚃、几丁蚃蚃[33] 等多蚃蚃,就是蚃些毒素和蚃蚃致病力起到主要作用 。蚃菌依靠它的毒力及致病力 能 6第 1 章 蚃 蚃 侵蚃寄主的蚃蚃,在蚃蚃生蚃、繁殖内,因此它份必蚃具蚃完整的毒力成才能致病。 在不同的生活蚃境下,嗜水蚃胞菌感染不气体同的有机,可很能蚃生不同的疾病,例如,感染蚃的品蚃不同,往往表蚃出不同的蚃床症状,病蚃的蚃床症状蚃局部蚃蚃、坏死、水蚃、突眼及腹部膨蚃,外可另坏内能蚃生腹水、蚃血及破蚃器官,脾、蚃蚃色[34-36] 蚃黑,肝蚃白,胆黄汁蚃 。 [37] 蚃然蚃菌蚃生的毒素蚃蚃多,致病性蚃蚃蚃,感染蚃蚃后可引起蚃血症 、腐皮病等,但感染蚃菌的蚃、蚃等水生蚃物均有一些共同的症状,可早蚃蚃早治蚃:表体充血、出血,剖蚃可蚃蚃壁有出血蚃象,有的在肝、蚃、脾等蚃内会器官也有出血蚃象,血管中的蚃蚃胞蚃形、溶解,白蚃胞数减量少,毛蚃血管壁受蚃,引起出血,蚃菌侵入肝、 蚃、脾等蚃蚃器官,引起炎症。感染了蚃菌的中蚃蚃,表体状腹甲蚃重斑蚃充血、甚至[38] 出血,表体疤某些部位出蚃蚃蚃、痕,口鼻蚃重充血、流血,蚃内肝、脾、蚃蚃大 。而且感染了蚃菌后果蚃很重,尽清早蚃蚃后需要及蚃除病蚃,并且蚃水,因蚃一旦蚃病,病蚃的排泄物和分泌物以及尸体会的病原菌便再度感染健康蚃,蚃病特点蚃蚃蚃感 染, 不断死亡,感染率蚃 60%~80%,高可 昀达100%;死亡率蚃 30%~60%,蚃重者可达 90% [39] 以上 。 目前中蚃蚃感染嗜水蚃胞菌的蚃病蚃道蚃多气,蚃脖子病、蚃斑病、穿孔病、蚃底板病、白斑病、腐皮病、出血性蚃血症等常蚃蚃病中,由嗜水蚃胞菌感染所气引起 的疾 病蚃昀普遍,造成的蚃失也大。很据蚃蚃,自 1987 年以来,我省因蚃病造成的蚃蚃蚃 [40] 失累蚃 达2000 万元 ,其中危害蚃大的出血性蚃血症的致病菌便是嗜水蚃胞气菌,国 内脖气已蚃道的甲蚃蚃子病、蚃穿孔病和甲蚃出血性蚃血症也均被蚃蚃是由嗜水蚃胞菌 [41-43] 引起 ,蚃底板病、白底板病蚃然比蚃蚃蚃,病原蚃蚃多,但嗜水蚃胞菌的蚃蚃性气 [44] 感染才是蚃蚃昀另研死亡的因素 。有究蚃蚃,嗜水蚃胞菌 气9605 菌株感染稚蚃可引 起粘液性蚃炎病,感染幼蚃蚃出蚃非典型性赤斑病,感染成蚃蚃致出会血性蚃炎病,同 [45,46] 一菌株蚃不同蚃格的蚃其致病性有蚃大的差异 。 1.3.4 治蚃蚃策 由于嗜水蚃胞菌蚃蚃素等蚃物其敏感气黄极,而蚃物防治比蚃蚃蚃、直接,目前很 [47] 多水蚃蚃殖企蚃直接向蚃殖水中投放蚃素等蚃物体黄,但是中蚃蚃的耐蚃性比蚃高 , 大量使用蚃物后,在水以及中蚃蚃形成蚃物留会体体内残,影响中蚃蚃的品蚃及其出口, 7河北大理蚃士位蚃文 学学学 昀会体重要的是危害蚃食用者的身健康。而且,嗜水蚃胞菌气与它通常其病原菌如和温 气气蚃胞菌、豚鼠蚃胞菌和假蚃胞菌有密切蚃系,蚃合致病,蚃一蚃物往往达不到治蚃 效果,反而会响体影中蚃蚃以及人健康。 被蚃殖企蚃普遍采用的方法蚃有向蚃料中添加蚃抗生素广,如蚃大素、蚃蚃菌素霉,[48] 但蚃只是蚃蚃性的解蚃决法,嗜水蚃胞菌抗性强气,蚃多抗生素的很很耐蚃性都高 ,很可能蚃生抗性突蚃菌,使以后的治蚃更加困蚃,而且抗生素留性强残,会增加其它致 [49] 病菌的抗蚃性 ,也会干蚃蚃殖蚃境中有益生物群的生蚃繁殖,引起微生蚃平衡失蚃,蚃生二次蚃染和内源性感染,蚃昀会坏区破蚃殖水域正常生物蚃系的平衡, 形成蚃性循蚃。 随残坏着病原菌抗蚃性、蚃物留、生蚃蚃境破等蚃些蚃蚃的蚃生,生物防治越越来受到人蚃的重蚃,其中菌治蚃以其蚃一性强、无留、生蚃蚃保等蚃蚃噬体残慢慢走入人蚃的蚃蚃。 1.4 菌及菌治蚃 噬体噬体 1.4.1 菌 噬体 噬体学个菌是微生物的一重要分支,是一蚃感染蚃菌、放蚃菌、菌等微生物的真非 蚃胞原生物,蚃蚃菌病称毒,蚃微小体,蚃蚃蚃构,具有蚃格的寄生性,广泛分布于自然界中,凡是有蚃菌的蚃所,就可能有相蚃的菌存在。噬体2005年,蚃病国毒分蚃委蚃会构把核酸蚃型、形蚃蚃、基本特性、宿主菌蚃型等特征及基因蚃的蚃蚃和蚃制方式作[51] 蚃分蚃依据,菌分蚃 将噬体14科 36 。 属 根据噬体与菌其宿主菌的蚃系,可其分蚃裂解性菌将噬体Virulent phage和溶原性 噬体菌Temperate phage蚃。两噬体称噬体烈性菌又蚃毒性菌,感染蚃胞后可立即在宿 主蚃胞内增殖,分并内泌毒素,引起蚃菌蚃胞的裂解。和性菌感染蚃胞温噬体后有两条 途径:一是裂解条径途,蚃与噬体徉烈性菌一;一是另条径溶原途,又被作称溶原性感 染途径,宿主蚃胞溶原化成蚃溶原性蚃菌,菌蚃蚃成蚃前菌蚃噬体噬体状,宿主菌与共 存,蚃蚃程因噬体状条异菌的蚃蚃、宿主菌的生理蚃以及周蚃的蚃境件的差而有所不同, 当体内噬体溶原性蚃菌的菌受到强烈因素的刺激蚃,如紫外照射,也蚃蚃成蚃会烈性噬 菌体,可以蚃溶源性菌是噬体体内埋藏在蚃菌的“定蚃炸蚃”。 噬体菌在宿主蚃胞中的生蚃繁殖可分蚃吸附、侵入、增殖、成熟和蚃放 5蚃个段, 噬体它内菌蚃法的原理就是利用在生蚃繁殖蚃程中能分泌毒素,蚃放蚃致病菌起到裂解 8第 1 章 蚃 蚃 作用,降低致病菌密度,蚃而减会少或避免致病菌感染或蚃病的机,从达而到治蚃和蚃 防疾病的目的。 由于蚃有前菌的蚃菌噬体噬体能抵抗相蚃溶源性菌的溶菌作用,不适合用于持蚃的 噬体菌治蚃蚃程,所以必蚃蚃蚃烈性菌 噬体 1.4.2 菌治蚃蚃蚃及噬体局限性 相蚃于化蚃物治蚃学,菌治蚃的蚃点多噬体很:1)具有强的特性很异,可以有蚃 蚃性地蚃蚃一些特定的有害蚃菌,不蚃非蚃蚃的其会它正常菌群蚃生溶菌作用,蚃生将 物和体/或其蚃境中的正常菌群生蚃平衡的影响昀程度降到小,不破坏微生物生蚃系蚃。 [51] 2)具有特的独增殖方式??指数增殖 ,条况件适宜的情下,每一菌在个噬体每一个 n 裂解周期中都可蚃生数达量高 200 的子代,菌以 即噬体将200 增殖,理蚃上蚃,只要 噬体菌的繁殖速度大于病原菌分裂的速度,一菌蚃个噬体粒就足以蚃死蚃菌,称之蚃 [52] “全”或“无”效蚃 all or nothing 。3)蚃菌蚃蚃生抗性很,据蚃道,蚃菌蚃菌噬体 -7 -6 [53] 蚃生抗性的突蚃蚃率蚃 10 ,而蚃抗生素的抗性突蚃蚃率蚃 10 ,低于抗生素 。4)蚃 蚃菌的耐蚃性突蚃适蚃性蚃强,使蚃菌蚃菌蚃生抗性即噬体,但菌是一蚃有噬体“生命 力的”病毒,具有更快的蚃、蚃制异速度,在一定程度上能蚃忍受宿主蚃菌的蚃异。5) 无副作用,无蚃物留残,随减着宿主菌的少,菌在被宿主菌感染的病噬体会体或蚃境中 逐蚃消失,不留在会残体内周蚃蚃境或者生物,而且有蚃菌蚃噬体法的副作用目前未有 蚃道。6)研噬体制蚃蚃的周期短、成本低。培育和生蚃菌的周期短,且成本低,只要 蚃蚃的离心,不需要特殊蚃蚃就可以去除蚃菌碎片蚃菌蚃行蚃化噬体,而且噬体菌制蚃 在常下可以蚃期保存温,蚃和蚃用比蚃方运便。7)蚃蚃方式多蚃,菌制蚃可以噬体皮 下注射,口服,也可以外部用蚃,且蚃效持久。 和大多治蚃方数案一蚃,菌治蚃也具有一定的噬体局限性。1)噬体异菌的特性太 强,裂解范蚃窄,宿主甚至具有菌株特性异,而很多疾病蚃多蚃致病菌蚃合致病,蚃一 噬体菌无法蚃足要求,急需蚃蚃出蚃宿主蚃的菌噬体;2)噬体菌有可能蚃蚃毒力因子, 昀好在大蚃模蚃用前了解全基因蚃序列; 3)有些菌在适的蚃噬体当条候和件下会蚃致 蚃菌蚃基因的水平蚃移蚃蚃;4)噬体体菌抗的出蚃,作蚃一蚃外物蚃体,菌噬体将刺 激被作用生物蚃生相蚃的抗体体,但到目前蚃止,已蚃在人蚃、猪、牛的血清以及牛初 [54] 乳中蚃蚃了 E. coli的菌抗 噬体体,而在蚃行菌治蚃的蚃蚃中噬体噬体却蚃未蚃蚃菌 9河北大理蚃士位蚃文 学学学 的抗体,蚃蚃蚃菌的蚃蚃噬体低免疫反蚃,使在蚃蚃蚃殖中蚃用菌治蚃具蚃了蚃蚃噬体; 5)抗菌噬体噬体突蚃菌株的出蚃也限制着菌治蚃的蚃展,因此在蚃行菌治蚃之噬体前, 需要蚃菌蚃行大噬体研量的基蚃究,例如免疫原性及安全性蚃价、抗菌菌株噬体毒力等。 6 菌治蚃所噬体与涉及的蚃量蚃蚃的蚃系非常蚃蚃,不易掌握。Nakai T等人究指研出 [55,56] 噬体菌接蚃越早越好 ,而 Payne 蚃蚃蚃早接蚃不一定有效。造成菌治蚃失蚃的噬体 原因之一就是人蚃蚃其特殊的蚃力学方式缺乏了解,若使用高蚃度的菌蚃蚃菌噬体直接 蚃行蚃死,蚃然效果蚃著,但成本高,且容易形成抗性蚃菌;若小蚃量投放菌噬体,利 用其特的蚃制方式在大独量增殖后攻蚃蚃菌蚃蚃裂解作用,蚃需要了解其宿主菌的增殖 域来确噬体定投放菌蚃机,蚃菌密度不到达增殖域蚃,蚃菌快速分