N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化 N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克 隆、表达及产物纯化 作者:余云彦，张卫星，闫欣欣，唐琴琴，刘乃华，晏永波，李校，林绍强 【摘要】目的:从猪肾中提取RNA，从中克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达。:从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出GNE基因，经测序，感受态大肠杆菌E.coliDH5a转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(NiSepharose6FastFlow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。结果:RNA提取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77，说明无明显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白(GNE)。SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45kD的单一条带，与基因序列推测值一致。结论:GNE基因已被成功地克隆和表达。 【关键词】N-乙酰-D-萄糖胺-2-差向异构酶;基因;克隆;纯化;猪 Abstract:Objective:ToclonethegeneofN-acetyl-D-glucosamin e-2-epimeraseaccordingtoRNAextractedfrompigkidneyandexpressi tinE.coliBL21(DE3)andthenpurifytheproduct.Methods:RNAwasextr 1 actedfromporcinekidneytoclonethegeneofN-acetyl-D-glucosamine-2-epimerasewithRT-PCRfollowedbysequencing.RecombinantplasmidwasconvertedintoE.coliDH5aandtoidentifyitfollowedbytheconversionoftherecombinantplasmidinE.coliBL21(DE3)andexpression.TheproteinwaspurifiedbyHis-tag(NiSepharose6FastFlow)， desaltedbyG-25columnandidentifiedbySDS-PAGE.Result:RNAwasextractedfromporcinekidneyandidentifiedwithultravioletspectrophotometer:OD260=0.0346，OD280=0.0195， OD260/OD280=1.77(between1.7and2.2)， itshowedthattherewasnoproteinandphenolcontamination.AmplificationofGNEwithRT-PCR， thesequencelengthofGNEwas1206bpencodefor402aminoacids.Themolecularweightofpurifiedproteinwas45kDrevealedbySDS-PAGE， whichwasconsistenttotheanalysisbasedongenesequence.Conclusion:N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerasegeneissuccessfullyclonedandexpressedinE.coliBL21(DE3). Keywords:N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase;gene;cloning;purification;pig N-乙酰-D-神经氨酸(N-Acetylneuraminicacid，Neu5Ac)的酶法合 成主要以N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)与丙酮酸为底物，在Neu5Ac醛 2 缩酶(Neu5Acaldolase)的催化下生成Neu5Ac[1]。为克服ManNAc价格昂贵的问题，通过碱性条件[2]或使用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)使廉价的N-乙酰-D-葡萄糖胺转化为ManNAc[3]。用Neu5Ac醛缩酶，以ManNAc和丙酮酸为底物进行Neu5Ac酶法合成，已有多篇论文报道[4-6]。酶法合成具有转化率高、提取简单、产品纯度高[7]、环保等优点，鉴于醛缩酶可以从重组微生物中获得[8]，人们倾向于以此方法来生产Neu5Ac。1996年，Maru等人从猪肾中成功克隆出了GNE，该酶的克隆对两步酶法[9]生产Neu5Ac带来了希望，而GNE是酶法合成Neu5Ac最为关键的限速酶[10-11]。本研究从猪肾中克隆出GNE基因，将该基因克隆至表达载体pET28(b)并转入至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达，并对其表达产物进行了纯化[12]。 1材料和方法 1.1材料 质粒、菌株及工具酶:质粒pBluescri-ptIIKS(+)、pET28(b)(中国科学院上海生命科学研究院杨晟教授惠赠);菌株E.coliDH5a、E.coliBL21(DE3)、限制性内切酶EcoRV、NdeI、EcoRI、T4DNA连接酶和碱性磷酸酶(CIAP)为Takara公司产品，引物由Takara公司合成。试剂及动物材料:RT-PCR试剂盒、质粒抽提试剂为Takara公司产品;NiSepharose6FastFlow购自GEHealthcare;咪唑、尿素为Sigma 3 产品;EDTA、DisodiumSalt、0.5MEDTA(pH.0)、NaCl、TritonX-100、Tris-Hydrochloride、Ammoniumpersulfate均购自Promega公司;氯霉素购自Amresco，LB培养基、其他试剂为进口分装或国产;新鲜猪肾购自农贸市场。 1.2实验方法 1.2.1Trizol法提取总RNA:取适量组织置1.5mL离心管中，加入Trizol匀浆，室温静置5min;加入0.2mL氯仿，静置，4?离心，取上清;加入0.5mL异丙醇，静置，4?离心，弃上清;加入1mL75%乙醇，洗涤沉淀，4?离心，弃上清，重复一次;晾干，加入DEPCH2O溶解(65?促溶)。 1.2.2总RNA定量:RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大吸收峰。用分光光度计测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。根据OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/mL)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000 1.2.3RT-PCR与RT-PCR产物的测序及分子量鉴定:根据相关报道以下一对PCR引物:正义链:catatggagaaggagcgcgaa反义链:gatatctaggcgaggcggctcagca下划线部分为NdeI和EcoRV的酶切位点。反转录聚合链式反应(RT-PCR)扩增得到两端分别为NdeI和EcoRV 4 的E酶基因片段。进行RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳回收，测序结果在NCBI网站进行blast分析。50ng左右的回收DNA进行电泳，参照分子量，估计DNA样品的分子量。 1.2.4携带epi基因重组质粒PRYepi的构建:将扩增得到的epi基因片段以平端连接进入EcoRV酶切pBluescriptIIKS(+)载体，再将该中间载体用NdeI和EcoRI双酶切，凝胶电泳后，胶上回收目的片段，与同样酶切的载体PET28(b)片段混合T4连接酶16?连接过夜，得到表达载体PRYepi。 1.2.5GNE基因工程菌构建:感受态制备:挑单菌落培养，摇菌至OD600=0.3,0.5;离心，弃上清，加入0.5mL感受态制备试剂，冰浴;取100μL置入1.5mLEP管中(冰浴)。质粒转化:100μL感受态中加入3μL质粒，冰浴30min;42?水浴2min后立即置于冰水浴2min;加入900μLLB，37?，200r/min培养1h(此时做含卡那霉素平板);更换新鲜的LB，重悬，混匀，涂布平板，37?过夜。挑单菌落到卡那霉素液体LB，37?，180r/min过夜。 1.2.6质粒提取、酶切鉴定及琼脂糖电泳:质粒提取:按照Takara公司质粒提取试剂盒操作指南提取大肠杆菌E.coliDH5a，E.coliBL21(DE3)质粒。所提取质粒酶切:Plasmid6μL，EcoRI1μL，ddH2O11μL，10×ReactionBufferH2μL，37?，酶切3,4h，酶切产 5 物进行琼脂糖电泳检测。琼脂糖电泳:DNA样品加入10,20μL1×凝胶缓冲液溶解沉淀，0.2倍体积6×碱性凝胶载样缓冲液，上样，90V电压电泳，置EB工作浓度浸泡30min于凝胶成像系统检测。 1.2.7GNE的表达及产物纯化:基因工程菌接种于LB试管，加入卡那霉素(50μg/mL)培养过夜后接种于LB培养基，37?、200r/min震荡培养，在OD=0.6左右时，30?下加入IPTG，终浓度为0.1mmol/L，30?下200r/min诱导培养，分别于诱导后3h、6h、9h取样0.5mL，沉淀细胞冻存于-20?。将冻存细胞以裂解液(15mmol/LTris-HCl，7mol/L脲，2mol/L硫脲，1%DTT，4%CHAPS，pH8.0)重悬，超声破壁20个循环后离心，加入8mol/L尿素，混匀，11200r/min离心，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。4mL样品加1mL50%凝胶和bindingbuffer的混合液于室温低速混匀1h，G25柱上样，用bindingbuffer至吸光率为基线，用elutionbuffer洗脱，收集样品，SDS-PAGE检测。 2结果 2.1抽提总RNA的结果 猪肾总RNA，通过紫外分光光度计检测，OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7,2.2之间)，说明无明显的蛋白质和酚污染。RNA浓度(mg/mL)=40×0.0346×3.5/1000=4.84× 6 10-3。 2.2目的片段RT-PCR结果 琼脂糖电泳结果显示，样品为单一条带，且分子量约为1206bp，符合实验预期目标。电泳图中样品颜色非常亮，说明产物浓度比较高及RT-PCR条件比较合理(见图1)。 2.3测序结果 RT-PCR产物送宝生物工程有限公司(大连)测序，测序结果在NCBI网站进行blast分析。经过对扩增产物的测序证明，其DNA序列与genebank中的GNE编码基因(D83766)一致，其分子量为1206bp(见图2)。 2.4质粒的鉴定 2.4.1质粒转化大肠杆菌E.coliDH5a结果:重组质粒转化E.coliDH5a，37?培养箱过夜，24h后观察菌落生长情况。阴性对照的图中无菌落，阳性对照的图中只有蓝色的菌落，而具有卡那霉素抗性的重组质粒则为白色菌落。上述3种培养皿中都添加了等量的50μg/mL的卡那霉素。重组质粒转化获得成功(见图3)。 7 2.4.2质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)结果:作为阴性对照的图中无菌落出现，阳性对照的图中只有蓝色的菌落，而具有卡那霉素抗性的重组质粒则为白色菌落，此结果与重组质粒转化E.coliDH5a的结果一样，重组质粒转化获得成功(见图4)。 2.4.3重组质粒转化的酶切鉴定结果:PET28(b)空质粒大小为5368bp，目的基因为1206bp，故PRYepi重组质粒大小为6574bp。电泳结果显示为介于6223bp和7743bp之间的单一条带，且靠近6223bp，大约6574bp，样品分子量空质粒和目的片段的分子量之和(见图5)。 2.5GNE的表达结果 基因工程菌在裂解液中超声破碎，裂解液上清SDS-PAGE电泳检测，在45kD处有对应的蛋白出现。样品1、样品2、样品3中IPTG终浓度分别为0.05、0.025、0.01mmol/L(见图6)。 2.6目的蛋白纯化结果 蛋白纯化后经SDS-PAGE检测只在45kD出现了一条比较明显的条带，GNE已被成功纯化出来(见图7)。 8 3讨论 本研究是GNE基因的克隆、表达及纯化。之所以采用酶法合成Neu5Ac，是因为酶法具有天然材料提取、化学合成、以及微生物发酵等方法无法比拟的优点。由于唾液酸在天然原料中含量极低，且分离纯化过程复杂，收率低而难于满足工业化生产的需要。化学法合成唾液酸反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，反应步骤繁多;另一方面，化学合成法涉及到复杂的基团保护和去保护步骤以及环境保护等问题，故有一定的局限性。目前利用发酵法生产唾液酸的研究工作仅限于较小规模试验。因此，人们倾向于以此方法来生产Neu5Ac。本研究选用的是原核表达系统——大肠杆菌BL21(DE3)，在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体转化细菌(通常选用大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得目的蛋白。原核表达系统的优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。 【参考文献】 [1]MaruI.Whyissialicacidattractinginterestnow?Completeen zymaticsynthesisofsialicacidwithN-acyglucosamine2-epimerase[ 9 J].JBiosciBioeng,2002,93(3):258-265. 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