丙种球蛋白对大鼠脑缺血再灌注脑组织中NF-κB和MDA的影响

丙种球蛋白对大鼠脑缺血再灌注脑组织中NF-κB和MDA的影响 丙种球蛋白对大鼠脑缺血再灌注脑组织中NF-κB和 MDA的影响 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的并表示谢意。 年占月，。El 学位论文作者签名 手写 参占认 签字日期:obff 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 手写 :参舀叫 导师签名 手写 : El 签字日期:旁凶ff年‘月『o日 签字日期山f年么月厂o 摘要 摘要 目的:探讨丙种球蛋白对大鼠脑缺血再灌注损伤时的脑保护作用及作用机 制。 方法:将90只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为假手术组 假手术+生理盐 水 18只、实验对照组36只 造模+生理盐水 及实验用药组36只 造模+丙种球蛋 白 。参照Zea Longa法将大鼠制成右侧大脑半球缺血再灌注模型。各组分别于 造模后24h、72h、120h进行TTC染色计算脑梗塞体积，神经功能缺损评分，病理 形态学观察，用免疫组织化学染色方法观察脑组织NF―kBp65表达，用分光光度计 测定脑组织中丙二醛含量。 结果: 1(实验用药组、实验对照组大鼠都出现右侧大脑半球梗塞灶及神经功 能缺 损症状，但实验用药组各个时间点较实验对照组轻 P O(05 。 2(实验用药组、实验对照组大鼠右侧大脑半球都出现明显的水肿、坏死等 病理形态学上改变，但实验用药组各个时间点较实验对照组轻。 Bp65FB性细胞数目在 3(与假手术组相比，实验用药组、实验对照组NF―K 各个时间点明显增加 P O(05 ;实验用药组与实验对照组相比，NF-KBp65阳 性细胞数目在各个时间点时明显减少 P O(05 。 4(与假手术组相比，实验用药组、实验对照组脑组织中MDA含量在各个时 间点明显增加 P O(05 ;实验用药组与实验对照组相比，脑组织中MDA含量在 各个时间点明显减少 P 0(05 。 结论: 1(丙种球蛋白早期能减少大鼠脑缺血再灌注脑梗塞体积，改善大鼠脑缺血 再灌注后的神经功能缺损症状。 B表达和MDA含量增加，早期使用丙种 2(大鼠脑缺血再灌注后脑组织中NF―K 球蛋白能减少NF―KB的表达及MDA含量，减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应及自 由基损伤。 B;MDA 关键词:脑缺血再灌注;丙种球蛋白;脑保护;炎症因子;NF―K Abstract ABSTRACT illustratethe effectof on cerebral Objective:To neuroprotectivegammaglobulin inratsandto the mechanism( ischemia-reperfusioninjury possible explore Methods:90adultWistarratswith 250"--280 masculinity，weighingg，wererandomly dividedinto3 combinedwithnormalsaline groups:sham??-operation[sham????operation withnormal control combined saline NS 】 and NS 】;experimentalgroup【operation combinedwith modelsofmiddlecerebral experimentalgroup【operation gammaglobulin】;rat cerebral established arteryocculions MCAO -inducedischemia-reperfusioninjury MCARl Was further toZea method(EachWas dividedinto3 to accordingLonga’S group subgroupsaccording different 20h (Afterweobservedthe in deficit scores，we phases 24h，72h，1 changeneurological sacrificedthem andbraintissue wereobtainedatdifferent successively samples phases 24h， 72h， 120h ineach observedthe ofcerebralinflarctTTC group(We range by dyeing(observed inrats’brainafter the histologicalchange hematoxylin-eosin HE stainingby lightmicroscope， detectedthe ofNF―r33 inthebrain tissue expression p65 injury by mensuratedthecontentof thebrain tissuethe malondialdehyde MDA ininjury by absorption Wasusedforstatistic way-ANOVA analysis( spectrometry(One Result: 1(AfterMCARI，the ratsinthe control and experimentalexperimentalgroupexperimental hadthe of cerebralinflarctand group largerangeright neurological withthe control the of Wasall experimentalgroup，inexperimentalgroup，thedegreedamage at24h，72hand slightersignificantly 120h P 0(05 ( 2(Thebraintissueofthe ratsafterMCARIroccurredclear experimental withthe control the experimental group，the change;however，compared group，inexperimental at of Was 24h，72hand1 degreedamagesli曲tersignificantly 20h P o(05 ( 3(The levelsof inthe control and NF-r,Bp65 group expression protein experimental were at 1 thanthosein 24h，72hand experimentalgrouphigher sham―operationgroup 20h P 0(05 ( The levelsof in Waslowerthanthatofthe expressionNF―r,Bp65proteinexperimentalgroup control at experimentalgroup 24h，72handl20h P O(05 ( significantly 4(MDAinbraintissuesafterMCARIraised of gammaglobulin significantly;theapplication III Abstract theMDAIeveI( decreased Conclusion: 1(The of candecreasethe ofcerebralinflarctand applicationgammaglobulin range the deficitatterMCARI( neurological improve inthebrain tissue 2(The of andthecontentofMDA injury NF―r,Bp65protein expression intheacute ofMCARI(Gammacould relievethe increased stage globulin effectively reactionandinhibitthereactionof intheacute ofMCARI( inflammatory lipidperoxidation stage in;brain factor;NF-KB;MDA words:MCARI;gammaglobul protection;inflammatory Key IV 中英文缩略词 中英文缩略词 MCAIR Middlecerebral 大脑中脑动脉缺血再灌注 artery ischemia-reperfusion MCAO Middlecerebral 大脑中脑动脉 artery occlusion MDA 丙二醛 malondialdehyde NF(rd3 nuclear B 核因子一KB factor―kappa ICAM Intercellularadhesion 细胞间粘附分子 molecule BBB bloodbrainbarrier 血脑屏障 TTC chloride 氯化三苯基四氮 唑 triphenyltetrazolium ROS reactive 活性氧 oxygenspecies IL Imedeukin 白细胞介素 Q TNF(a tumornecrosisfactor 肿瘤坏死因子一Q H hour 小时 V 目录 目 录 第l章 引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 第2章材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1实验材料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1(1实验动物及分组„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((3 2(1(2实验设备,仪器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(3 2(2动物模型制备及用药途径、方 法„„„„„„„„„„„„„„„„4 2(3一般情况观 察„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 2(4标本取材及处 理„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 2(5病理形态学观 察„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6 2(6免疫组化染色法测NF(r,B p65„„„„„„„„„„„„„„„„„((7 2(7丙二醛 MDA 测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 2(7(1脑组织匀浆的制备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((8 2(7(2脑组织蛋白测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((8 2(7(3丙二醛 MDA ;澳IJ 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((8 2(8数据处理及统计学方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 第3章结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。10 3(1一般情况观 察„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((10 3(2神经功能缺损评分结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。10 3(3脑组织病理学改 变„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 3(4免疫组化染色结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一12 3(5脑组织MDA含量的变化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„13 第4章讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。23 4(1脑缺血再灌注模型的选 择„„„„„„„„„„„„„„„„„„。23 4(2丙种球蛋白对神经功能缺损评分、脑梗塞体积的影响„„„„„„((23 4(3脑缺血再灌时丙种球蛋白对脑组织中NF(rJ3表达的影响„„„„„(24 4(4脑缺血再灌住时丙种球蛋白对脑组织中MDA的影响„„„„„„„25 VI 目录 4(5小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((26 第5章结论与展望„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 5(1结1沧„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。27 5(2不足之处及展 望„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((27 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((28 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 攻读学位期间的研究成 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 综 述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((33 VII 第1章引言 第1章 引言 脑保护治疗是缺血性脑卒中基础与临床研究的重点之一，而缺血再灌注损 伤机制是脑保护研究的重要病理生理基础n一1。脑缺血再灌注损伤是多环节、多 因素、多途径的酶促级联反应，主要包括炎症反应、自由基大量生成、兴奋性氨 基酸释放、细胞内钙超载等重要环节。这些环节彼此重叠，互为因果，并相互 联系，形成恶性循环最终引起细胞凋亡或坏死。。引:其中炎症反应在脑缺 血再灌 注损伤的发生发展起了重要作用瞄1。脑缺血再灌注后受损脑细胞产生的致炎因子 F(K JL一1、JL一6、TNF-Q、NB等 刺激诱导粘附分子 ICAM一1、E(选择素、 VCAM(1等 表达，介导了白细胞与内皮细的粘附与组织浸润，导致微循环堵 塞、血脑屏障破坏、脑水肿加重?川。 近年来国内外已有许多学者正积极研究探索干预脑损伤后炎症反应的靶点 和药物，如抑制白细胞浸润 抗中性粒细胞抗体、多西环素等 ，拮抗补体与 F(K 粘附分子 ICAM(1抗体 、抑制NB活化 阿斯匹林、糖皮质激素、抗氧 化剂 等m1。丙种球蛋白作为一种传统的调节免疫功能、干预炎症反应机制的药 物已广泛运用于神经系统脱髓鞘及感染性疾病的治疗与研究，有较好的效果。 但运用于缺血性脑卒中神经保护治疗研究，国内仅见少量相关报导。如雷小峰 等砷3应用丙种球蛋白治疗脑梗死的临床研究，显示丙种球蛋白能调节脑梗死后增 球蛋白对大鼠脑缺血再灌注损伤的研究观察了C妇表达水平，显示脑缺血,再灌注 后补体糸统激活加重了脑水肿，丙种球蛋白能通过抑制补体有效减轻脑水肿。 许多研究表明:丙种球蛋白能抑制炎症因子的产生、粘附分子的表达、内皮细 胞的活化等炎症反应的多个环节nh12’1刖;但目前关于脑缺血再灌注损伤时丙种球 B表达方面的研究，国内未见相关报导。为此，我们通过建立大 蛋白影响NF(K B NF(K 鼠缺血再灌注模型，选择核转录因子(K B 为研究观察指标，对丙种 B表达及其相关因子作一观察，以探讨其可能存在炎性保 球蛋白影响NF(K 护机制新途径。 核转录因子(K factor B 于1986年被发现，因其能和 免疫 B Nuclearkappa 球蛋白K链基因上的增强子结合，故得此名。几乎所有类型的细胞中都有其存 B广泛分布在神经细胞、胶质细胞和血管内皮细胞，在静 在;神经系统中，NF(K 第1章引言 K 息状态下，NF(KB与抑制因子IB结合成复合物存在细胞浆中，没有生物活 性;脑缺血再灌注时NF(KB被激活，从而启动了细胞因子及细胞粘附分子等相 关靶基因的转录，引发炎症反应和自由基损伤等病理生理过程n4’151。研 究发现，NF( KB能与许多细胞因子和炎症介质的基因启动子区域的固定核苷酸序列结合，既 可启动粘附分子、IL(1、IL-6和TNF(Q等细胞因子的基因表达，又可被细胞因子、 自由基、神经毒性肽等所激活，是细胞内炎症信号转导通路的调控中心，因此 在缺血再灌注损伤过程中测定其可以较好的反映炎症反应的程度n6J"。 另外，脑缺血再灌注损伤时，自由基的产生释放与NF(KB活化关系密切。 脑缺血再灌注损伤发生后，大脑产生大量的活性氧和自由基，加重了脑组织的 损伤。NF(KB激活后可促进iNOS等表达产生自由基，产生的自由基反过来又 可激活NF(KB，从而形成正反馈，使反应不断扩大n瓯191。丙二醛 MDA 是自 由基与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应的产物，是反映机体自由基水平 和氧化应激水平的一项指标，在缺血再灌注损伤过程中测定脂质过氧化作用稳 定的代谢产物MDA含量可反映脂质过氧化程度，间接反映细胞受损程度甲一?。 目前国内关于丙种球蛋白对脑缺血再灌注损伤时脑组织中NF(KB表达及 MDA含量的影响尚未见相关报道，本实验的目的在于通过观察丙种球蛋白对脑 缺血再灌注损伤组织中NF(KB的表达和MDA含量的影响，以探讨丙种球蛋白 干预脑缺血再灌注炎症损伤途径的可能机制。为寻求脑缺血再灌注损伤神经 保 护治疗的新途径、新方法提供实验依据。 2 第2章材料与方法 第2章材料与方法 2(1实验材料 2(1(1实验动物及分组 夜节律光照，室内温度控制在25?左右，相对湿度为60"--70,。分组:?假手 组12只;其中每组6只用于TTC染色，6只用于HE染色及免疫组化。?实验 只;其中每组6只用于TTC染色，6只用于HE染色及免疫组化。 2(1(2实验设备,仪器 电子天平TG328A型 上海分析仪器厂 超低温冰箱 -70? 青岛海尔特种电器有限公司 高速冷冻离心机 长沙趋势仪器有限公司 石蜡切片机 德国 SONY数码相机 日本 组织匀浆器38mm,75mm 河北琢州玻璃仪器厂 分光光度计722s型 福建新大陆生物技术有限公司 2-1(3试剂 石蜡 广州市创博化工有限公司产品 二甲苯 天津红岩化学试剂公司产品 伊红和苏木精染色剂 Amresco公司产品 TTC试剂 Amresco公司产品 抗NF―KB 武汉博士德生物有限公司 SP法免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 第2章材料与方法 DAB显色试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 PBS缓冲液 武汉博士德生物工程有限公司 中性甲醛 北京化学试剂公司 酒精 75,、80,、90,、100, 天津红岩化学试剂公司产品 双缩脲法蛋白定量测试盒 南京建成生物工程研究所 MDA测定试剂盒 南京建成生物工程研究所 丙种球蛋白 江西博雅生物制药股份有限公司 2(2动物模型制备及用药途径、方法 1 线栓的制备:选直径为0(235mm、长度为5cm的同本尼龙鱼线作导 mm 左 丝。用酒精灯烤制线头，使导丝一端形成一微小圆球，小球直径在0(25 右为合格导丝，在距圆球端2(0cm处标记，使用前酒精浸泡消毒。 2 实验大鼠的术前准备:实验大鼠在实验前12h禁食，4h禁水。所有的 实验在室温25?右左。 3 造模的手术过程 参照Zea Longa瞳21氏法 :术前30分钟经腹腔注射 10,水合氯醛3 ml,kg麻醉大鼠，将麻醉好的大鼠置于手术台，仰卧位，头及四 肢固定好，取颈部右侧旁正中切口，分离右侧颈外动脉和迷走神经，再分离 右 侧颈外动脉和颈内动脉，分离颈外动脉主干，在其远端lcm处结扎。用动脉夹 临时夹闭颈总动脉，提拉颈外动脉的结扎线，在颈外动脉距颈总动脉分叉0(5cm 处剪一小口。使用自制的线栓，从小口推动线栓由颈外动脉进入颈内动脉，穿 过颈内动脉和颈外动脉分叉处约1(8cm左右时，有阻力感，记录栓塞开始时间， 栓塞后2h，将尼龙线拔出，退至于颈外动脉处剪断。假手术组造模步骤一样， 仅仅线栓插入的深度为1(Ocm。 4 神经功能缺损评分:参照Zea Longa口羽评定法，进行神经功能 缺损程 度的评分: 0分:无神经功能缺损; 1分:不能完全伸展对侧前肢; 2分:行走向左侧转圈; 3分:行走困难向左侧倾倒; 4分:不能自发行走意识丧失。 造模成功评分:1―3分为模型制作成功。术后大鼠完全清醒 术后2 4 第2章材料与方法 小时左右 为第一次评分，术后各组大鼠在取脑前 即24h、72h、120h时间 点 第二次评分。 5 纳入及排除研究标准: 纳入标准:第一次神经功能缺损评分为1-3分的大鼠; 排除标准:1 第一次神经功能缺损评高于3分者分或低于1分。2 开颅后 发现蛛网膜下腔出血者。3 未达到观察时点死亡的大鼠。上述因素使各组实验 大鼠不足预定数目的通过随机抽样原则补齐实验大鼠再重新造模。 6 干预:实验用药组的大鼠在第一次神经功能缺损评分后立即给予丙种 球蛋白2(59,kg腹腔注射，假手术组、实验对照组在相同的时间给予等量的生理 盐水腹腔注射。 2(3一般情况观察 观察造模后动物精神状念、活动及饮食等情况，着重观察神经缺损功能症 状。 2(4标本取材及处理 各组术后各时间点，使用1096的水合氯醛3ml,kg腹腔麻醉大鼠后，断头处死 大鼠，固定，用牙科钻在额、顶部开颅，咬骨钳剪开颅骨，剪去视神经、嗅束及 延髓，取出脑组织，除去小脑及脑干，将大脑迅速置于冰盐水漂洗，剥除脑膜。 l、TTC染色:将用于TTC染色组的大鼠大脑置入一20?冰箱内冷冻20分 钟后，自前脑额极起用组织切片机连续切出5,6片冠状切片，将脑片放入2, TTC染色液中，37。C避光孵育约30分钟;非梗死区红色，梗死区呈现白色。用 数码相机拍照，然后输入计算机图像分析系统，测得每脑片的缺血面积，计算 出每只大鼠的脑梗死灶体积。 2、丙二醛的测定 断头取脑后，取右侧大脑皮层200 mg左右，制备成10, 的脑组织匀浆待测。 3、病理切片及NF(K B的免疫组化染色断头取脑，留200mg大脑组织制 作脑组织匀浆后，将大脑组织放入10,的福尔马林溶液固定用作病理切片及NF― KB的免疫组化染色。 第2章材料与方法 2(5病理形态学观察 将脑组织用10,中性甲醛缓冲液浸泡固定24h，浸泡液为组织的20倍，使 其固定完全，再进行脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察脑组 织形态学变化。 1 石蜡切片 织，做冠状切片，按以下步骤操作:自来水冲洗一脱水机一甲醛I一甲醛II― 水酒精[111(5h一脱水完毕放入二甲苯I一二甲苯II一将标本放入已熔化的液体 石蜡中再放入60。C左右的温箱内一将标本的断面向下放入装有液体石蜡的包埋 框中，在室温下使其自然冷却凝固，修整石蜡块一将已修整好的石蜡块使用切 片机连续切片3,4张，厚度4pm，在46。C温水中展开，载玻片捞片，然后放入 50,60。C烤箱中干燥20分钟。 2 HE染色 1 石蜡切片常规用二甲苯 I 脱蜡10分钟; 2 二甲苯 II 10分钟: 3 将切片放入无水酒精 I 2分钟; 4 从无水酒精 I 放入无水酒精 H 2分钟; 5 将切片放入90,酒精2分钟;自来水浸泡15分钟; 6 将切片放入80,酒精2分钟，中性树脂封固; 7 自来水冲洗; 8 苏木素染色液染色10分钟; 9 自来水清洗; 10 0(5-1,盐酸酒精溶液分化数秒; 11 自来水清洗10分钟; 12 放入伊红染液染色l,2分钟; 13 自来水清洗; 14 放入80,酒精30-40秒; 15 放入90,酒精30―60秒; 16 置入无水酒精1-5分钟; 17 置入无水酒精1-5分钟; 6 第2章材料与方法 18 置入二甲苯 I 1-5分钟; 19 置入二甲苯 II 1-5分钟: 20 中性树胶封固。 结果判断:在光学显微镜下正常细胞的胞核呈黑蓝色，胞浆呈淡红色。凋 亡的细胞在脑组织中常呈单个散在分布，核染色质致密浓缩，核碎裂等。坏死 的组织呈均质红染无结构物质，核染色消失。 B 2(6免疫组化染色法测NF-K p65 采用S-P方法DAB显色，设阴性对照 PBS代替一抗 。 实验步骤如下: 1 将蜡片常觑脱蜡; 2 3,H:0:室温孵育5-10分钟，4?过夜，PBS冲洗2分钟×3次; 3 高压抗原修复，待冷却后PBS冲洗2分钟X3次; 4 5,-10,正常血清封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，分别滴加适 当稀 B 1:300 ，37。C孵育20分钟; 释的抗NF―K 5 PBS冲洗5分钟x3次; 6 滴加生物素化的二抗，37?孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次; 7 滴加试剂辣根酶标记联酶卵白素工作液，37?孵育20分钟，PBS冲洗2 分钟×3次: 8 DAB显色，自来水充分水洗，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜观 察。 对免疫组化染色的切片进行图像分析，采用千屏HMIAS一200高清晰彩色医 学图像分析系统，计算阳性细胞单位数，以胞浆和胞核黄染为阳性细胞。 脑组织免疫组化染色采用S-P法。NF-KBp65蛋白阳性细胞为胞浆和胞核着 色呈棕黄色，每张切片在400倍光镜下选择缺血再灌注侧脑组织区域3个不重复 的视野计数阳性细胞，取平均值，从阴性至阳性细胞数计0,---,5分。标准如下:阴 性，计0分:阳性细胞数 5,，计1分:阳性细胞数6,-15,，计2分:阳性细胞数 16,一30,，计3分:阳性细胞数31,-50,，计4分:阳性细胞数 50,，计5分。 2(7丙二醛 MDA 测定 7 第2章材料与方法 2(7(1脑组织匀浆的制备 各组按规定的时间点麻醉大鼠，断头取脑，去除包膜，取右侧脑缺血区脑 组织200mg，在4。C生理盐水中眼科剪剪碎，用玻璃匀浆器制成10,的匀浆，再 用高速冷冻离心机4。C、3500,R离心20min，取上清液待测。 第2章材料与方法 试剂盒组成: 试剂一:使用前37?水浴至透明: 试剂二:使用前每瓶加双蒸水170ml混匀: 试剂三:使用前用90一100?的双蒸水60ml充分溶解后，再加冰醋酸60ml混 匀: 标准品:lOnmol,ml四乙氧基丙烷。 TBA法MDA测定操作步骤 标准管 标准空白管 测定管 标准品 m1 O(1 无水乙醇 m1 0(1 10,脑组织匀浆 m1 0(1 试剂一 m1 O(1 O(1 0(1 摇动试管架数次，混匀 试剂二 m1 3 3 3 50,冰醋酸 m1 1 1 l 旋涡混匀器混匀，用保鲜膜扎紧试管口，刺一孔，于95?水浴40min，流 Fl，取上清液于540nm处，lcm光径，蒸馏水调零， 水冷却，3500rpm离心lOmi 测定各管吸光度值 OD 。 按公式计算MDA含量 脑组织M。A含量cnm。l,mgw。，:芸蠕塞冀暑暑栗勰×标准品浓度 10nmol,m1 ?匀浆蛋白浓度 mgpro,m1 2(8数据处理及统计学方法 数据结果以均数?标准差 i?s 表示，数值变量资料采用两个样本均数的 t检验和多个样本均数比较的方差分析中的SNK―q检验，借助SPSSI1(5 统计软 件成，P O(05为具有显著性差异。 9 第3章结果 第3章结果 3(1一般情况观察 假手术组动物清醒后饮食、活动等明显下降，无神经功能缺损症状，以后 各时间点均未出现神经功能缺损症状，饮食、活动至120h时基本恢复正常。实 验用药组与实验对照组造模清醒后饮食、活动等也明显下降，出现神经功能缺 损症状，但实验用药组与实验对照组各时间段相比，神经功能缺损症状都相 对 轻微 见表1 ，饮食、活动恢复也更快。整个实验过程，实验动物无明显体重 减轻、皮肤溃烂、术口感染及呕吐等症状。观察期内动物死亡5只，于相应的 时间段补充。5只死亡动物分别为:24h实验对照组3只，72h实验对照组1只， 24h实验用药组1只;解剖后发现均为蛛网膜下腔出血致死。 3(2神经功能缺损评分结果 假手术组动物各时间点未见神经功能缺损症状。实验用药组与实验对照组 造模后均出现神经功能缺损症状，但实验用药组比实验对照组相应各时间点的 神经功能缺损评分均较低 P;O(05 ，表明大鼠脑缺血再灌注后使用丙种球 蛋白 能减轻神经功能缺损症状。 见表1，图表1 表1 各组动物不同时间点神经功能缺损评分比较 i?s，n 12 注:与同时点实验对照组比较:?P 0(05 lO 第3章结果 &5 3 乙 5 2 圈实验对照组 神经功能缺损评分 L5 口实验用药组 l n5 0 24h 72h 120h 图表l各组动物不同时间点神经功能缺损评分 3(3脑组织病理学改变 3(3(1标本大体观察 假手术组在24h、72h、120h时的动物脑组织标本均未见缺血性病理改变。 实验对照组右侧大脑半球大脑中动脉供血区苍白、肿胀，72h最为严重;实验用 药组也可见类似改变，但与实验对照组各个时间点相比，程度略轻。 3(3(2梗塞体积结果 假手术组动物各时间点未见梗灶。实验用药组与实验对照组造模后均出现 右大脑中动脉供血区大片梗塞灶，但实验用药组比实验对照组相应的各时间点 的梗塞体积均较小 P O(05 ，表明大鼠脑缺血再灌注后使用丙种球蛋白能减 见表2，图表2，图片1--一6 小梗塞体积 P O(05 。 表2各组动物脑组织不同时间点脑梗塞体积 ram3 比较 i?s，n 6 注:与同时点实验对照组比较:AP 0(05 第3章结果 筋0 脑 梗 塞 加O 体 积 ^ 坫O 暑 圈实验对照组 暑 J 口实验用药组 加O 5O 0 24h 72h 120h 图表2各组动物脑组织不同时间点脑梗塞体积 3(3(3 HE染色 假手术组:神经元形态结构正常，胞膜清晰可辨，胞核完整呈圆形，核仁、 核膜清晰，边界清楚。 实验对照组:24h即出现细胞问质水肿，胞体肿胀，胞浆可见空泡，胞核缩 小呈三角形或长条形，深染，染色质弥漫性深染;部分神经元细胞坏死，胞膜 及核膜消失，核呈碎片:神经纤维走行不清或消失，可见白细胞浸润;72h细胞、 组织水肿更明显，细胞坏死也增多;120h以细胞坏死为主。 实验用药组:各时间点病理改变与实验用对照相似，但较对照组轻。 见 图片7,15 3(4免疫组化染色结果 假手术组动物脑组织NF-KBp65的阳性表达细胞数在各时间点均很低。实 验用药组与实验对照组在各时间点NF-K Bp65的阳性细胞百分数都高于假手术 水平，120h逐渐降低，表明脑缺血再灌注能激活NF-KB的表达。实验用药组与 实验对照组相比，各个时间点的NF-K Bp65的阳性细胞百分数都明显更低 B 的表达。 P 0(05 ，表明大鼠脑缺血再灌注后使用丙种球蛋白能减少NF―K 12 第3章结果 见表3、图表3，图片16"--24 表3各组动物脑组织不同时间点NF-K Sp65免疫组化染色计分比较 i?s，n 6 注:与同时点空白对照组比较:#P 0(05:与同时点实验对照组比较:,kP O(05 Z ’ 4 K ? 弓 s:3 计 口假手术组 分 2 圈实验对照组 口实验用药组 1 0 72h 120h -1 图表3各组动物脑组织NF(KB免疫组化染色计分 3(5脑组织MDk,含量的变化 假手术组动物脑组织MDA的含量在各时间点均较低。实验用药组与实验对 照组在各时间点脑组织MDA的含量都高于假手术组同时间水平 P 0(05 ，表 明脑缺血再灌注后脑组织MDA的含量增加。实验用药组与实验对照组相比，各 个时间点脑组织MDA的含量均明显更低 P O(05 ，表明大鼠脑缺血再灌注后 见表4，图表4 使用丙种球蛋白能减少脑组织MDA的含量 P 0(05 。 13 第3章结果 假手术组 1(33?0(26 1(37?0(23 1(35?O(18 实验对照组 3(54?O(40。 5(38?0(53。 3(24?0(25。 实验用药组 2(69-t-0(37。? 3(65?0(72。? 2(47?0(37。? 注:与同时点空白对照组比较:gP 0(05;与同时点实验对照组比较:AP o(05 6 5 4 口假手术组 囝实验对照组 3 口实 验用药组 2 脑组织吾?^o暑o】-?g 1 O 24h 72h 120h 图表4各组动物脑组织MDA nmol,mg 的变化 14 第3章结果 图片 第3章结果 图4实验用药组72h脑组织TTC染色 图5实验对照组120h脑组织TTC染色 图6实验用药组120h脑组织TTC染色 16 第3章结果 图7假手术组24h脑组织额叶HE染色 X200 图8实验对照组24h脑组织额叶HE染色 ×200 图9实验用药组24h脑组织额叶肛染色 ×200 17 j 第3章结果 图1l实验对照组72h脑组织额叶肛染色 X200 18 第3章结果 图13假手术组120h脑组织额叶HE染色 ×200 图14实验对照组120h脑组织额叶HE染色 ×200 19 ――( 第3章结果 ―――――――――――――――――――――――――――――――― ――r(―二二二二 图 囊? 飞? 巳:’ ”-_?闷 ‖ ? 了 (-‖簪剖 ?， ( 1 I_?1 簟脚???? 图 NF―K 17实验对照组24hBp65免疫组化染色 X400 ”。。‖ 气,税 气。。|| 图18实验用药组24h 第3章结果 卜毒,。，] e(- ‘g二一墨(( ’i ’‖‘ 、崤焉嗡 一 一 k ry f l薹譬(-。k，巨FIt_l―-L【 ?。 图21实验用药组72hNF-KBp65免疫组化染色 X400 21 第3章结果 NF―K 图22假手术组120hBp65免疫组化染色 ×400 r’ ’9 鲞 (( 【 (， 霉、 堇(二， p NF-K 图23实验对照组120hBp65免疫组化染色 ×400 ―r， 囊擎妒 - 图24实验用药 第4章讨论 第4章讨论 脑卒中是严重危及人类生命健康的常见病多发病，其中缺血性脑卒中占脑 血管病的75,乜31。近年来，随着临床对缺血性卒中溶栓治疗开展的越来越广泛， 有关缺血再灌注损伤及其干预机制的研究受到了越来越多的重视。神经保护治 疗也成为目前基础与临床研究的热点之一。本实验中我们通过建立大鼠脑缺血 再灌注模型，使用丙种球蛋白对其进行干预，观察大鼠神经功能缺损症状、脑 梗塞体积及脑组织中N卜KB表达与MDA含量，对丙种球蛋白干预脑缺血再灌注 的炎症损伤途径的可能机制及作用进行探讨。 4(1脑缺血再灌注模型的选择 人类缺血性卒中主要发生于颈内动脉系统，其中大部分为大脑中动脉及其 分支闭塞引起，所以在实验动物脑缺血研究中，局灶性脑缺血标准动脉模型是 大脑中动脉闭塞动脉模型。其模型的制作有多种方法如开颅法、栓塞法、光化 学法模型等，但这些方法各自存在创伤大、死亡率高、可控性差，或造模时间 长、对造模技术要求高等不同方面的缺陷，目前较少被研究者选用。 本次实验我们采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，这种方法由 Koizumi乜铂首创，经Zea Longa乜23改良，具有不开颅、创伤小、死亡率低、可复 流、稳定性好、初学者较易操作等优点，近年来为越来越多的国内外研究者广泛 采用。本次实验中我们选用了72只大鼠造模，仅有5只死亡，死亡率不到1096， 除死亡外其余大鼠均出现1-3分不等的神经功能缺损症状，TTC染色出现明显术 侧脑梗塞，HE染色也可见明显的术侧缺血缺氧的病理改变，说明我们建立的大 鼠局灶性脑缺血再灌注模型是成功的，为本研究奠定了实验基础。 4(2丙种球蛋白对神经功能缺损评分、脑梗塞体积的影响 脑缺血再灌注损伤是多环节、多因素、多途径的酶促级联反应，主要包括炎 症反应、自由基大量生成、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载等重要环节。其 中炎症反应在脑缺血再灌注损伤的发生发展起了重要作用?’4’副。 本研究实验用药组与实验对照组造模后均出现神经功能缺损症状，但实验 第4章讨论 用药组比实验对照组相应各时间点的神经功能缺损评分均较低 P 0(05 ;实验 用药组与实验对照组造模后均出现右大脑中动脉供血区大片梗塞灶，但实验用 药组比实验对照组相应的各时间点的梗塞体积均较小 P 0(05 ;HE染色也显 示:在实验各时点实验用药组比实验对照组病理损害较轻。上述结果显示，脑 缺血再灌注损伤使用丙种球蛋白能降低脑梗塞体积，改善神经功能缺损症状。 这与黄莹等?伽研究的结果相近，其研究运用丙种球蛋白对大鼠脑缺血再灌注损 伤的研究，显示丙种球蛋白能通过抑制补体有效减轻脑水肿。雷小峰等西3应用丙 种球蛋白治疗脑梗死的临床研究，显示丙种球蛋白能调节脑梗死后增高的IgG 水平和降低的CD4+TC、CDs+TC，提高临床疗效。有研究显示:丙种球蛋白尚 具有细胞因子抑制与调节作用，丙种球蛋白能抑制炎症因子的产生、粘附分子的 表达、内皮细胞的活化等炎症反应的各个环节n2J3’2引; NF(K 导了白细胞与内皮细的粘附与组织浸润，导致微循环堵塞、血脑屏障破坏、脑 水肿加重。而丙种球蛋白能抑制内皮细胞活化和粘附分子表达，还能直接中和 许多致炎因子及通过竞争性结合巨噬细胞IgGFc受体抑制炎症因子的产生 n“甄271，从而减轻脑缺血再灌注的炎症反应，减轻脑组织的水肿坏死。因此，我 们推测丙种球蛋白有可能通过干预影响致炎因子表达，发挥神经保护作用。 4(3脑缺血再灌时丙种球蛋白对脑组织中NF-KB表达的影响 越来越多的研究表明，中枢神经系统的许多疾病的发生发展与NF(1cB的活 化相关，如脑缺血,再灌注，脑出血，癫痫，感染都可引起炎症反应，使NF(nB 大量活化，其DNA活性也增列28】。NF(1 B在脑缺血,再灌注损伤中的作用是目 前研究的热点。脑缺血再灌注损伤时，NF(1cB的激活可以促使IL(1、IL(6、IL(8、 TNF(a等炎症因子表达上调，而这些因子反过来又可以激活NF(rB，从而使 NF(r,B活化在组织间不断扩散，加重炎症反应;此外，NF(r,B可促进粘附分子的 表达，引起外周炎性细胞进入脑组织，因此在缺血再灌注损伤过程中测定其 可以 较好的反映炎症反应的程度[15,16,18】。 本实验中免疫组化显示假手术组动物脑组织NF(r,Bp65的阳性表达细胞数 在各时间点均很低。实验用药组与实验对照组在各时间点NF(r,Bp65的阳性细胞 24 第4章讨论 百分数都高于假手术组同时间水平 P 0(05 ，表明脑缺血再灌注能激活NF(1cB 致，可能与造模方式不同有关。实验用药组与实验对照组相比，各个时间点的 使用丙种球蛋白能减少NF(r,B的表达。 有研究表明，丙种球蛋白本身存在丰富的抗IL(1、IL(6、TNF(a等自身抗体， 能直接中和这些炎症因子，并且IgG分子的Fc片段竞争性结合巨噬细胞IgGFc 受体，使巨噬细胞不再能通过Fc受体结合抗原抗体复合物的Fc段，减少炎症 因子的产生【12'251。由此影响NF(KB与炎症因子间的正反馈;此外丙种球蛋白还 能抑制内皮细胞活化和粘附分子表达，进一步减轻脑缺血再灌注损伤时的炎症 反应„，30l;从而降低NF―r,B的表达。 缺血区时DNA碎片明显增加，并且中风组织容积增大;Irving等【32J研究提示特 缺血再灌注过程中具有双重作用:NF(1?适度的活性可保护神经细胞，而NF(rd3 的过度活化又将导致炎症级联反应。因此，在脑缺血再灌注过程中把NF(r,B的 表达控制在什么范围值得进一步实验研究。本实验中实验用药组各时间点的 NF(r,B明显高于假手术组 P 0(05 ，表明不存在使用丙种球蛋白后过度抑制了 NF(rd3的活化。 4(4脑缺血再灌住时丙种球蛋白对脑组织中MDA的影响 脑缺血再灌注时，大量的炎性细胞聚集在受损的脑组织中，释放各种炎性 介质，产生大量的自由基，广泛攻击易损区不饱和脂肪酸双链的生物膜结构， 引起脂质过氧化“瀑布状"连锁反应，导致膜结构及功能的破坏，同时生成脂 脑缺血再灌注损伤 时， 质过氧化物，其中以MDA毒性最大，也最为普遍n吼3?; 自由基的产生释放与NF(KB活化关系密切。脑缺血再灌注损伤发生后，脑组织 产生大量的自由基和活性氧，加重脑组织的损伤。NF(KB激活可促进iNOS等 第4章讨论 表达并产生自由基，产生的自由基反过来又可激活NF(KB，从而形成正反馈， 9’331。 使反应不断扩大u 本实验假手术组动物脑组织MDA的含量在各时间点均较低。实验用药组与 实验对照组在各时间点脑组织MDA的含量都高于假手术组同时间水平 P O(05 ， 表明脑缺血再灌注后脑组织MDA的含量增加。说明氧自由基引发的脂质过氧化 反应参与了脑缺血再灌注损伤，这与众多的研究结果相一致?’眠矧;本实验中脑 缺血再灌注后MDA的含量在72h达到高峰，与脑梗死体积的高峰出现时间相一 致。实验用药组与实验对照组相比各时间点的MDA含量明显降低 P 0(05 ， 提示丙种球蛋白能抑制脑缺血再灌注损伤时MDA的升高，减轻自由基对脑组织 的损害。其机制可能为丙种球蛋白通过抑制脑缺血再灌注时的炎症反应的多个 环节，降低NF(KB表达，抑制自由基的产生，减轻脂质过氧化反应及MDA生 成，从而减轻自由基损害。至于丙种球蛋白能否直接抑制自由基或MDA未见相 关文献报道，有待迸一步研究。 4(5小结 炎症反应损害在脑缺血再灌注损伤过程中起着重要作用，从干预炎症反应 入手，探讨治疗缺血性脑血管病的新途径具有重要价值。目前，国内外研究显 示有众多的干预措施及药物可干预脑缺血再灌注损伤时的炎症反应，但能被运 用于临床干预脑缺血再灌注炎症反应的药物相对较少，而丙种球蛋白作为一种 副作用较少、且能提高自身免疫功能的药物具有广泛的运用前景。本实验中， 我们对脑缺血再灌注的大鼠使用丙种球蛋白后降低了脑组织中NF-KB的表达及 MDA的含量变化，探讨了丙种球蛋白减轻脑缺血再灌注损伤时的炎症反应、自由 基生成等的可能机制，为临床使用丙种球蛋白治疗缺血性脑卒中提供了实验依 据。 26 第5章结论与展望 第5章结论与展望 5(1结论 1(丙种球蛋白早期能减少大鼠脑缺血再灌注脑梗塞体积，改善大鼠脑缺血 再灌注后的神经功能缺损症状。 2(大鼠脑缺血再灌注后脑组织中NF-K B表达和MDA含量增加，早期使用 丙种球蛋白能通过减少NF_KB的表达及MDA含量，减轻脑缺血再灌注损伤的炎 症反应及自由基损伤。 5(2不足之处及展望 本研究的局限性在于样本量有限，实验观察时间不长，所的指标及观察 时间点较少，未对NF―K 作出检测，而且未能对丙种球蛋白如何抑制NF-KB的表达、MDA生成作更深入 的机制探讨。因此，有必要在此基础上，开展进一步的相关研究。 27 致谢 致谢 三年来，在学习、生活上导师给予了我无微不至的关怀，对我的成长倾注 了大量的心血，使我在专业水平、做人处事等各方面都有了长足的进步。师德 如山，师恩如海，永生难忘。 衷心感谢赣州市人民神经内科曾祥俊主任医师等全体老师对我临床实习工 作等方面的精心指导。 衷心感谢赣州市人民医院病理科、检验科全体老师在动物模型制备、标 本 制作、指标检测方面的指导与帮助。 最后，让我向所有曾经关心、支持和帮助过我的人致以最诚挚的谢意! 江 斌 2011 年5月 参考文献 参考文献 【l】王万铁(缺血一再灌注损伤(见:金惠铭，王建枝，主编(病理生理 学(人民卫生出版社，第7 版，2008，141??155( WC，SpellmanSR，NussbanmES，et afterfocalcerebral [2】Jean a1(Reperfusioninjury role ischemia:theofinflammationandthe therapeuptichorizon[J](Neuorsurgery，1998， 43 6 :1382-1397( GA(1schemicbrain Dis，1 16 [3】Rosenberg edema(Ping(Cardiovase999，42 3 :209―2 a1(Cellular of Z，BetzAI，et localizationtumornecrosisfactor 【4】CongC，Qin alphafollowing in focalcerebralischemia Res，1998，801 I-2 :l-8( mice[J](Brain J，Davalos and 【5】VilaN，Castillo A，etal(Porinflammatorycytokinesearly neuorogicai inischemic worsening stroke[J】(Stroke，2000，31 10 :2325( AJ，MoffettJR，et real-time R，Williams RT―PCR of [6】Berti a1(Quantitative analysis assocsatedwith brain Cereb inflammatorygeneexpression ischemia-reperfusioninjury【J】(J BloodFlow Metab，2002，22 9 :1068―1079( Yilmaz andD(Neil adhesionmoleculesand 【7】Gokhan Granger(Cell ischemic[J](stroke( NeurolRes(2008 October;30 8 :783-793( 【8】董为伟(神经保护的基础与临床，第一版(科学出版社:222(238( 【9】雷小峰、朵振顺(静脉免疫球蛋自治疗急性脑梗塞的临床研究【J】(山西医药杂志，2003， 23 6 :534(537( 【lO】黄莹、李长清(静脉注射免疫球蛋白对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J】(中国全科医学， 2009，12 16 :1489(1491( fIl】沈慕昌(第三代静脉输注免疫球蛋白药理学、免疫学作用机理【J】(李中国输血杂志，2001， 14 5 :281(283( 【】2】曹忠然，陈淑兰(静脉注射免疫球蛋白免疫调一符机制的研究进展【J】(医学综述，2007，13 13 :1027(1028 PMechanismofactionof K，CiebiadaM，G6rski [13】Kasztalska immunoglobulinapplied MerkurLekarski(2010 intravenously[J](Pol oct;29 172 :263―8 【14】姚小梅，王纪佐，朱学良(NF-KBp65在脑缺血再灌注后的作用fJ】(中 华神经医学杂志， 2004，3 5 :330(333( a1(Distinct Bsubunitsin S，et rolesofdifferent 【l5】WangJ，WangX，Hussain NF―kappa T andcell indendritic inflammatory regulating stimulatorygeneexpression cells[J](1mmunol， 1 :6777( 2007，178 1 H，Grillon in 【16】Seegers E，TrioullierY，eta1(Nuclear Bactivation factor-kappa permanent intraluminalfocalcerebraliscbemiainthe rat[J】(Neurosci activates DT，Dixona1(Globalcerebralischemia nuclear 【17】ClemensJA，StephensonEP，et B toevidence Brain prior ofDNA ResMolRes,1997， factor-kappa fragmentation[J】(Brain 参考文献 48 2 :187―96( 【18】刘宗超，周官恩(NF-1cB与脑缺血【J】(中风与神经疾病杂志，2005， 22 1 :88(90( D，Yin EB，et factornuclear 【19】Stphenson Bis T，Smalstiga1(Transcriptionfactor-kappa activatedinneuronsafterfocalcerebral CerebBloodFlowMetab， 2000， ischemia[J](J 20 3 :592―603( PH(Freeradicalsinbrainmetabolism 【20】Evans and MedBull，1 pathology[J](Br993，49 3 : 577--58( ED(Centralnervous traumaand 【21】BraughlerJM，Hall system considerationfor radicalformationand RadicBiol oxygen Med， lipidperoxidation[J】(Free 1989，6 3 :289―301( EZ，WeinsteinPR，CarlsonS，et 【22】Longa a1(Reversiblemiddlecerebralocclusion artery without in 989，20:84-91( craniectomy rats[J](Stroke，1 【23】侯熙德(神经病学一匕京:人民卫生出版社，1996(197( J，Shirane A(Anewmodelofbilateral M，Suzuki 【24】Kameyama R，Ogawa hemispheric ischemiaintherat--threevesselocclusion 【25】杨锡强(静脉注射丙种球蛋白治疗自身免疫性疾病【J】(临床儿科杂 志，1995，13 6 : 392(393( Z(Fc andFc in [26】Hondaepsilon gammareceptorsignaling Semin diseases【J】(Springer Immunopathol，2006，28 4 -365-375( Cartron of 【27】LejeuneJ，ThibauitG G，OhresserM，Watier fortheFe H(Implicationsreceptors of mechanismofactionof portionlgG FcgammaRs in therapeuticantibodies[J](Bull Cancer(2010 1l-22( May;97 5 :5 【28】何兰英，罗勇(脑缺血再灌注损伤后神经元中核因子(1cB对靶基因 的转录调节[J】(神经疾 病与精神卫生，2007，7 1 :45(48( lett W,HowC，et inhuman 【29】StanimirovicD，Zhang a1(Inflammatory genetranscription to ofthenuclear Bandautocrine astrocytes stimulation exposedhypoxia:roles factor-kappa 1 【J】(Neuroimmunoi，2001，l 9 2 :365-76( 【30】RoutierF(H(，HounsellE(F(，RuddP(M(，et ofthe ofhuman a1(Quantitationoligosacharides serumfrom withrheumatoid lgG patients arthritis: acriticalevaluationofdiferent 1 Methods，1998，2 methods[J](1mmunol3 2 :375-386( WD，HessDC，Carrol 【31】Hill JE，eta1(The inhibitor NF―kappaB brain celldeathinatransientmiddlecerebral DDTC increases occlusionmodelof artery Res Bull，2001，55 31:375(386( ischemia[J](Brain SJ，Roberts J，eta1(Decreased EA，Hadingham nuclear DNA 【32】Irving factor-kappaBbinding focalcerebral activityfollowingpermanent ischemiain therat[J](Neurosci Lett，2000，288 1 :45-48( DM??Themolecularbasis andbrainedema:The 【33】lkedaY，Long ofbrain’injury role ofoxygen flee Euro 990，27:1( radicals[J](NSury，1 RB，Piuta S,eta1(Productionofreactive 【34】Mason RM，Walbridge after oxygenspecies 30 参考文献 invitroandin reperfusion effectofnitric vivo:protectine oxide[J]-J Neurosurg， 2000，93: 99-107( 【35】Demirkaya S,TopcuogluMA，AydinA，et and a1(Malondialdehyde，glutathione peroxidase dismutase blood superoxide of withacute inperiheralerythrocytes cerebral patients J ischemia[J](EurNeurol，2001，8:43(51( PH(Freeradical 【36】LewenA，MatzEChan inCNS pathways Neurotrauma, injury[J]J 2000，17 10 :871(9( 31 攻读学位期间的研究成果 攻读学位期间的研究成果 已发表 江斌，李广生，《炎症相关冈子与脑缺血再灌注损伤》赣南医学院报，2010 年6期 综述 综述 炎症相关因子与脑缺血再灌注损伤 江斌综述 李广生审校 摘要:近年来，脑缺血,再灌注过程中的炎症反应引起了越来越多学者的关注。 大量研究表明，炎症反应介导了脑缺血,再灌注损伤。伴随着细胞因子、粘附分 子表达和促发炎症的级联反应，白细胞粘附、聚集和迁移并产生大量的蛋白水 解酶、氧自由基及花生四烯酸代谢产物，破坏血脑屏障，导致血管源性水肿和 出血，加重继发性脑损伤。本文就脑缺血,灌注时炎性反应过程中的一些炎症因 子的最新研究进展作一综述。 关健词:脑缺血,再灌注，炎症，细胞因子，粘附分子，核转录因子 脑缺血再灌注时脑组织发生一系列的病理生理变化，研究发现，脑血流中 断和再灌注损伤是一个快速的级联反应，这个级联反应包括许多环节，如能量 障碍、炎症反应兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡 基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环最终 导致细胞凋亡或坏死?。其中炎症反应在脑缺血再灌注损伤的发生发展起了重要 作用口’3】。探讨炎症反应中各种炎症因子在脑缺血再灌注时的作用及它们之间的 相互关系，对临床防治脑缺血再灌注损伤具有十分重要的理论和应用价值。 1(白细胞介素一1 IL一1 IL(1又名淋巴细胞活化因子，由活化的单核巨噬细胞及小胶质细胞等产生， L-1 有lL―Ia，I 13和IL―Iy三个成员。与缺血有关系的主要为JL-1B，它是触 发炎症和免疫反应的重要介质，主要通过促进白细胞和内皮细胞粘附而激发炎 症反应。脑缺血再灌注后，产生的肿瘤坏死因子a TNF(a ，IL(6等炎性细胞因子 B。lL-1 激活了小胶质细胞和星形胶质细胞分泌大量的IL-1 B本身又存在自分 泌激素样功能H3。Bin等发现脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮层、神经元、星形胶质 Bm,'eA脚及蛋白质表达明显增加，而在侧脑室内注射 细胞和小胶质细胞中9[一I 13受体阻断剂，可减轻缺血性脑损伤晦’81。 抗cj[一邝中和抗体或哑一1 综述 2(白细胞介素一6 IL一6 IL一6的生物学功能具有多样性，尤其在免疫调节和炎症反应中发挥重要作 达，12h时显著增高口1。V(Ia啊1等研究认为，血清中IL-6水平的升高 与体温、血 糖、纤维蛋白原及梗死面积密切相关，回归分析表明血清中IL-6水平是早期临 床症状加重的独立因素。IL-6导致炎性损伤的病理机制可能与诱导最初的炎性 免疫瀑布发生及诱导趋化因子的表达有关。发生缺血性脑卒中后升高的JL一6水 平提示病情严重，患者12个月内的生存率降低阳一01:缺血性脑卒中急性期的某些 炎症反应标志物还与复发有关，较为肯定的有CRP，Fg，和IL-6n?。 3(肿瘤坏死因子一a TNF-a TNF(a是由单核巨噬细胞、星形细胞、小胶质细胞和神经元等产生的具有多 效性作用的促炎因子。TNF(a能通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱 导粘 附分子或其他炎性介质表达，增加血脑屏障的通透性，加重缺血性脑损伤n21。 胞，对毛细血管的直接毒性作用，可导致微小动脉痉挛，增加毛细血管通透性， 还可诱导血管内皮细胞产生凝血活性，引发血栓和出血。 2 影响血管舒缩活性 物质的表达，诱导强效血管活性物质释放，导致血管收缩，减少局部脑血流量， 并可增加毛细血管通透性，进一步加重血脑屏障的损害，促进脑缺血及水肿的 发生。 3 N激细胞问粘附分子(1 ICAM(1 表达增高，致使白细胞滚动、贴壁， 阻塞微血管，导致微血管迟发性低灌注，破坏基底膜，浸润