含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用

含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用 含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树 突状细胞疫苗的体外杀伤作用 实用医学杂志2007年第23卷第7期 含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染 树突状细胞疫苗的体外杀伤作用 黄浩吴自勤尤长宣罗荣城YongLiuPaulL.Hermonat 摘要目的:观察研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)转染含癌胚抗原(CEA)片段的重组腺相 关病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用.方法:抽取HL表型为A11 的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟Dc,诱导特异性 T细胞.检测体外培养的DC和CTL活性,并使用M,rr法检测细胞毒性T细胞(CTL)对LOVO细胞的杀伤作用.结 果:转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40,CD86,IL.12,诱导的细胞毒性T细胞高表达IFN.;转染后 DC诱导特异性细胞毒性T细胞可有效识别并杀伤HLA.A11阳性的LOVO细胞.结论:重组腺相关病毒转染DC, 不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖,分化功能,可诱导自体细胞毒性T细胞增殖,含CEA片断的腺相关病 毒转染DC诱导自体细胞毒性T细胞对LOVO细胞有明显杀伤作用,Dc疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有 效补充. 关键词树突细胞癌胚抗原T淋巴细胞,细胞毒性 Thekillingeffect/nvitroofdendriticcellsvaccinetransfectedbyrecombinantadeno-associa tedviruswith cardnoembryonicgenefragmentHUANGHao,WUZi-qin,YOUChang-xuan,LUORong- cheng,YongLiu,PaulL. Hermonat.CancerCenter,NaufaugHospital,SouthernMedicalUniversity,Guaugzhou510515,China Correspondingauthor:ORong-chengE—mail:Irc@nJ:hoc.corn 【Abstract】 ObjectiveDendriticcellsvaccineisoneoftheimportantactiveimmunotherapiesforneoplasm.We observethekillingeffectinvitroofcytotoxicTlymphocytes(CTL),aspecificTcell,onthecolorectalcarcinomaLOVO andSW480cellsCTLisindueedbyhumanperipheralbloodmonocyte.originateddendriticcells(DC)whichhavebeen transfectedbyrecombinantadeno— associatedvirus(rAAV)withcarcinoembryonic(CEA)genefragment.Methods ImmatureDCsweregeneratedfromperipheralbloodmonocytesinhealthyvolunteerswithHLA.A11positive.andthen transfectedbyrAAVwithCEAgenefragment.CTLwasthereafterinduced.TheactivityofDCandCTLwasmeasuredand thekillingeffectofCTLonLoVocellswasdetectedusingM1Trassay.ResuItsThematureDCwhichweretransfectedor nothighlyexpressedCD40,CD86andIL一12.IFN一 washighlyexpressedintheCTLTheDC—inducedCTLcould effectivelyrecognizeanddestroytheLOVOcellswithHLA.A11positive.ConclusionDCtransfectedbyrAAVcan stimulatetheproliferationanddifierentiationoflymphocyteandalsoinducetheproliferationofCTL.andtheirown phenotypesarenotaltered.DCvaccinecaneffectivelybeusedasanadjuvantimmunotherapyforpatientswithcolorectal carcinoma. 【Keywords】DendriticcellCarcinoembryonicantigenT-lymphocytes,cytotoxic 癌胚抗原(carcinoembryonicantigen.CEA)是一 种重要的肿瘤相关抗原….文献报道,90%的胃肠道肿 瘤.80%的非小细胞肺癌.50%的乳癌都有CEA的高 表达[2].该类患者病死率高,原因之一是CEA的抗原 性很弱.机体的免疫系统不能识别肿瘤表面的CEA, 从而使肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤.本研究利用重 组的腺相关病毒(recombinatedadeno—associatedvirus) 将外源的CEA基因序列导人树突状细胞(dendritic .从而制备可有效提呈CEA的DC疫苗. cell.DC)中 并观测该疫苗对于直肠癌细胞株的体外杀伤作用. 1材料与方法 1.1细胞株和试剂直肠癌细胞株LOVO,SW480为 作者单位:510515广州市.南方医科大学南方医院肿瘤中心 通讯作者:罗荣城E.mail:lre@nfhoe.com 本实验室保存.AIM—V培养液购自Invitrogen公司, RPMI1640购自Gibco公司.M1_r购自Sigma公司. rhGM—CSF购自R&DSystems公司.rhlL一4(比活性13 U/ng)购自Promega公司,TNF—ot(50WU/mL),rhlL一2 (300WU/mg)购自北京军事医学科学院.淋巴细胞分层 液(Ficoll1.077g/mL)购白天津血研所.人AB血清购自 广州血站,小鼠抗人CD86-FITC,CD83一FITC,CD40-PE, CD80一PE.购自Biolegend公司.IL-12p70ELISA检查试 剂盒,IFN一ELISA检查试剂盒购自BD公司,AAV—CEA 病毒由美国阿肯色大学生物治疗中心刘勇教授惠赠. 1.2DC细胞的分离和培养取HLA表型为A11的 健康自愿供血者外周血50mL,肝素抗凝,用2倍体 积的RPMI1640无血清培养基稀释.每个15mL离心 管中加入5mLFicoll(1.077g/mL),倾斜离心管约 45o角.于液面上方1cm处加人细胞悬液,不破坏液 用医学杂志2007年第23卷第7期 面.以l500r/min.离心30min.吸出分界面的灰白 色细胞层,PBS洗涤1次,1500r/min,离心5min, 获得单核细胞,调节细胞浓度为2X106/mI,接种在6 孑L板中,37?,5%CO孵箱中培养4,6h,PBS洗涤6 孑L板.收集悬浮细胞作为效应T细胞培养,贴壁细胞 即为DC.在6孔板孔内加入AIM.V培养液(含GM CSF800U/mL),第2天实验组每组加入AAV—CEA 100p,L(109/孔),病毒作用8h后换液,隔天半量换液 1次.第4天加入IL一41000U/mL,第6天加入TNF一 仅刺激成熟,培养第8天收获悬浮细胞为成熟DC. 1.3DC成熟度鉴定和IL一12检测DC培养过程中, 留取培养第2天和第8天上清作IL一12p70ELISA检 测(按试剂盒操作),培养第7天,离心分离细胞,用 PBS洗涤2遍,分别加入15L鼠抗人CD86一FITC, CD83一FITC,CD40.PE,CD80一PE,常温避光孵育15,30 min.PBS洗2遍,送流式细胞仪检测. 1.4效应T细胞的培养和IFN.检测于DC培养 第0天贴壁6h后,收集6孔板中的悬浮细胞为效应 T细胞.调整细胞浓度为1O5106/mL,加入100mL培 养瓶中,用RPMI1640+10%人AB血清+IL一2(终浓 度为200U/mL)培养,隔天换液.于DC培养第8天, 收集T细胞,用RPMI1640+10%人AB血清+IL一2(终 浓度为200U/mL)+粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM—CSF)(终浓度为200U/mL)重悬,调整细胞浓度 为2.5X10'/mL,接种于24孔板中,800L每孔.收 集培养成熟的DC细胞,调整浓度为1X10/mL,倍 比稀释后.按DC:T分别为1:10,1:20,1:40加入 T细胞中.同时设置空白对照组,每组6复孔.继续培 养96h,留取上清用ELISA检测试剂盒检测其IFN— 含量. 1.5MTF法检测效应T细胞的细胞毒性作用取传 代后第2天的LOVO和SW480细胞作靶细胞,台盼 兰染色测定细胞活力,调细胞浓度1X10/mL,加入 96孔板中,100L/孔,作为靶细胞;用RPMI1640液 调整上述成熟的效应T细胞浓度为5X106/mL,按照 效靶比为1:1,10:1,20:1,50:1设置实验组,同时 将未经过DC共育的T细胞按10:1作为空白对照 组.每组6复孔,继续培养24h,每孔加入浓度为5 mg/mL的MTr20izL,继续培养4h,弃上清,加入 150p.L二甲亚砜.混合均匀,在HTS7000BioAssay Reader上选取490RII1波长测定每孔吸光度值( 值),细胞毒性=1一(实验组值一效应细胞/I值)/靶 细胞A值. 1.6统计学计量结果用面?S表示,采用SPSS 10.0软件对实验数据进行分析.数据作完全随机设计方 差分析,组间比较用LSD检验和Dunnett(双侧)检验. 2结果 2.IDC表达表面标志经AAV—CEA致敏后的DC 培养8d后高表达CD83,CD86,CD40,CD80.见图1. 謇善04匿藿110*102103lW1101021031 CD86FITCCD83FITC 图1DC表面分子标记检测 2.2DC释放IL-12检测成熟DC释放IL-12[(279.28 ?27.15)pg/mL]明显高于未成熟Dc[(59.75?9.08) pg/mL]. 2.3效应T细胞释放IFN—检测加DC共培养T 细胞释放IFN—明显高于未加DC共培养组,且随 DC比例的提高有所增加.见表1. 表1效应T细胞释放IFN一检测?s 注:与对照组比较,$P<0.05,$$P<0.01 2.4效应T细胞的细胞毒作用用重组腺相关病毒 制备的DC疫苗诱导出的效应T细胞对两种直肠癌 细胞株表现不同的抑制作用.对于HLA表型与志愿 者相同并高表达CEA的LOVO细胞株抑制作用明显 强于HLA表型不同并低表达CEA的SW480细胞株, 而且随着效靶比的升高,抑制作用明显提高.见表2. 表2细胞毒作用分析?s,% 注:与对照组比较,AP>0.05,AAP<O.01;LOVO组与SW480组 比较.$P<0.01 3讨论 DC是已知的体内抗原呈递功能最强的专职抗原 ,转导 递呈细胞(antigenpresentingcel1),以Dc为基础 特异的肿瘤抗原基因制备DC瘤苗,有望成为一种高 效低副作用的肿瘤治疗方法[.目前,已建立了多 种方法制备基于DC的肿瘤疫苗,如用肿瘤细胞裂解 物[s]或凋亡的肿瘤细胞[]等冲击致敏DC,肿瘤相关抗 原肽段直接致敏DCE,将肿瘤相关抗原基因通过电 穿孔或质粒DNA或病毒性载体直接转染DC等[引.本 研究利用含CEA基因序列的重组腺相关病毒将CEA 基因序列导入Dc细胞,制备特异性的DC疫苗,并将 其应用于CEA相关的结直肠癌细胞株的体外杀伤, 取得了明显的效果 DC表达主要组织相容性抗原复合物(MHC)一l 和MHC.11类分子及CDla,CD80,CD86,CD83, CD40,CD123和CD1lc等分子,其中CD83为其成熟 的标志,MHC—I和MHC.11类分子与CD3分子形成 第一信号系统,而CD80和CD86则与CD28分子形 成第二信号系统,二者在免疫应答中缺一不可[...因 此DC疫苗介导的效应T细胞的杀伤作用受到MHC 的限制.人类MHC即人类白细胞抗原(HLA),HLA参 与抗原的处理与递呈,约束免疫细胞之间的相互作 用,参与免疫应答的遗传调控及T细胞的活化,在免 疫调节中起重要的作用["].HLA是多态性最丰富的 一 个基因系统,拥有极大数量的等位基因,赋予人类 巨大潜力以适应多变的内外环境.由于MHC限制性, 理论上要求献血者HLA表型和肿瘤细胞株匹配,而 实际上想完全匹配是不可能的,实验中,我们选取最 重要的HLA.A配型,选择HIA.A基因型为A11的志 愿者的外周血培养DC,制备特异性的DC疫苗并诱 导T细胞,然后进行体外杀伤实验. 我们的前期研究表明,无论是否加入病毒感 染,均可培养出成熟的DC细胞,而将培养的DC与 T细胞混合.也可成功促进T细胞的增殖,并释放 IFN-[. LOVO细胞和SW480细胞均是研究常用的结肠 癌细胞株,但LOVO细胞高表达CEAE"],HIA.A基因 分型为All,同志愿者相符,而SW480细胞也可表达 CEAE14].HLA.A基因分型为A2,同志愿者明显不符. 而细胞毒实验的结果也表明:HLA.A为A11的加病 毒组DC诱导的细胞毒性T细胞对LOVO的杀伤百 分率随E/T的增加逐步增高,在E/T为50:l时杀伤 率最高,E/T为50:l,20:l,l0:l时均明显高于无病 毒组.对SW480的杀伤百分率则与对照组无明显差 异. 总之,我们成功地在体外培养出DC细胞,并使 用转染CEA后的DC细胞成功诱导出特异性的T细 胞,而特异性T细胞对于HLA—A基因型相符的高表 实用医学杂志2007年第23卷第7期 达CEA的结肠癌细胞株有特异性的杀伤作用,为进 一 步研究CEA相关的特异性的Dc疫苗打下了基础, 而Dc疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有效补 充. 4参考文献 [1]FakihMG,PadmanabhanA.CEAmonitoringincolorectalcancer. Whatyoushouldknow[J].Oncology(WillistonPark),2006,20 (6):579—587. [2]李锦洲,祁岩超,罗超权.CEA重组痘苗病毒对实验性CEA阳性 肝癌的预防和治疗作用[J].郑州大学:医学版,2005,4 (40):667—669. [3]尤长宣,罗荣城,苏瑾,等.腺相关病毒介导乳腺癌BA46基因 转移的实验研究[J].中华微生物与免疫学杂志,2004,24(9): 724—727. [41唐勇,尤慧勇.树突状细胞肿瘤疫苗临床应用的研究与进展[J]. 实用医学杂志,2002,18(5):545—547. [5]RosenblattJ,KufeD,AviganD.Dendriticcellfusionvaccinesfor cancerimmunotherapy[J].ExpertOpinBiolTher,2005,5(5): 703—7l5. [6]HayashiT,NakaoK,NagayamaY,eta1.Vaccinationwithdendritic cellspulsedwithapoptoticcellselicitseffectiveantitumorimmunity inmurinehepatomamodels[J].IntJOncol,2005,26(5):1313一 l319. 『71罗荣城,韩焕兴.肿瘤综合诊疗新进展[M].2版,人民军医出版 社,2006:497—499. [8]SunK,WangL,ZhangY.Dendriticcellastherapeuticvaccines againsttumorsanditsroleintherapyforhepatocellularcarcinoma [J].CellMolImmunol,2006,3(3):197-203. [9]PengX,HussainSF,PatersonY.TheabilityoftwoListeria monocytogenesvaccinestargetinghumanpapillomavirus-16E7tO induceanantitumorresponsecorrelateswithmyeloiddendriticcell function[J].JImmunol,2004,172(10):6030-6038. 『lO]罗荣城,韩焕兴.肿瘤生物治疗学[M].人民卫生出版社,2006: 248—255. [11]KoopmannJ0,HammerGJ,MomburgF.Generation,intracellular transportandloadingofprptidesassociatedwithMHCclassI molecules[J].CurtopinImmunol,1997,9(1):88—88. 『l21李鸣芳,罗荣城,尤长宣,等.角蛋白19致敏的DCCTL对MCF- 7体外抑瘤作用的实验研究[J].第一军医大学,2005,25 (10):l247—1250. 『l3]LointierP,WildrickDM,BomanBM.Growtheffectsoftamoxifen onLovocoloncarcinomacellsandculturedcellsfromnonn~colonic mucosa[J].AnticancerRes,1992,12(5):1523—1525. [14]AsanumaK,TsujiN,EndohT,eta1.SurvivinenhancesFasligand expressionviaup-regulationofspecificityproteinl—mediatedgene transcriptionincoloncancercells[J].JImmunol,2004,172(6): 3922—3929. (收稿:2006—09—13修回:2006—12一O1)