核抑制剂（Roscovitine）对促排周期人未成熟卵母细胞体外成熟安全性的初步研究

核抑制剂（Roscovitine）对促排周期人未成熟卵母细胞体外成熟安全性的初步研究 核抑制剂(Roscovitine)对促排周期人未成 熟卵母细胞体外成熟安全性的初步研究 第38卷第6期第768页 2009年12月 华中科技大学(医学版) ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Vo1.38No.6P.768 Dec.2009 核抑制剂(Roscovitine)对促排周期人未成熟卵母 细胞体外成熟安全性的初步研 李豫峰田红帅李舟刘群章汉旺任新玲魏玉兰 究* 胡娟朱桂金 华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心,武汉430030 摘要目的观察核抑制剂(Roscovitine)对人未成熟卵母细胞体外成熟(invitromaturation,IVM)安全性的影响. 方法获取促排周期的GV期未成熟卵随机分为两组,实验组(经二步法):未成熟卵母细胞先用含有200~mol/L Roscovitine的培养液培养6h,然后转入IVM成熟培养液培养24,36h;对照组:直接用IVM成熟培养液培养24,36 h.观察两组卵母细胞成熟情况并应用激光扫描共聚焦显微镜观察培养成熟后M?期卵母细胞纺锤体和染色体的形 态.结果实验组共获未成熟卵母细胞61个,经体外成熟培养后5O个卵成熟,其中39个卵可观察到纺锤体与染色体, 纺锤体的形态异常者为15个,染色体异常者11个;对照组共获未成熟卵母细胞6O个,经体外成熟培养后43个卵成熟, 其中32个卵可观察到染色体与纺锤体,纺锤体形态异常者14个,染色体异常者11 个.结论Roscovitine能可逆性抑 制体外培养的人卵母细胞的核成熟,但未对纺锤体及染色体形态产生不良影响. 关键词核抑制剂;未成熟卵母细胞;体外成熟;纺锤体;染色体 中图法分类号R32卜33D0I:10.3870/j.issn.1672—0741.2009.06.012 TheEffectofNuclearInhibiter(Roscovitine)onMaturationand SecurityinvitroinHumanImmatureOocytes LiYufeng,TianHongshuai,LiZhouetal CenterofReproductiveMedicine,TongjiHospital,TongJiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectsof200umol/Inuclearinhibiter(Roscovitine)onmaturationandsecurityn vitroinhumanimmatureoocytes.MethodsImmatureoocyteswereculturedwithatwo— stepculturesystem.Firstlyimmature oocyteswereculturedinmaturationmediumwithRoscovitinefor6h,theninmaturationmediumwithoutRoscovitinefor24— 36h.Iaserconfoca1scanningmicroscopywasusedtoexaminethemeioticspindleandchromosome.Theoocytesincontro1 groupwereculturedinTCM一 199maturationmedium.ResultsInexperimentalgroup61oocyteswereobserved.Afterinvitro maturation,50oocytesbecamematuration,and39ofthemhadspindleandchromosome.including15abnormalspindlesand11 abnormalchromosomes.Incontrolgroup60oocyteswereobserved.After"vitromaturation43becamematuration.and32of themhadspindlesandchromosomes.including14abnormalspindlesand11abnormalchromosomes.ConclusionRoscovitine canreversiblyinhibitnuclearmaturationofhumanooeytes,buthasnoadverseeffectsonspindleandchromosomeconfiguration. KeywordsRoscovitine;immatureoocytes;invitromaturation;spindle;chromosome 人类卵母细胞的成熟是一相当复杂的过程,虽 经多年的研究,对其机制尚未完全了解,而体外环境 对其成熟的影响更是研究的热点之一.目前在动物 实验中取得了一定的成果,而由于受相关因素的制 约,对人类卵母细胞的体外成熟机制的研究进展仍 十分缓慢.据文献报道体外成熟(invitromatura— tion,IVM)的临床妊娠率较低,仅为200A,35l1]. 卵母细胞的成熟及其质量与体外受精和胚胎移 植的成败密切相关].卵母细胞成熟包括胞核与胞 质成熟两方面,研究认为细胞质成熟落后于细胞核, 湖北省61然科学基金资助项目(No.2005ABA169) 李豫峰,男,1964年生,副教授,E—mail:yufengli64@yahoo.corn.cn 由于胞质未完全成熟,未完全合成维持胚胎进一步 发育的有关成分],因此研究最佳的体外培养条件 以促进细胞质与细胞核的同步成熟对卵母细胞 IVM尤为重要.本研究观察以200mol/L的核抑 制剂(Roscovitine)抑制核成熟后其对纺锤体和染色 体的影响,为进一步研究Roscovitine对人卵母细胞 发育能力的影响提供依据. 1资料与方法 1.1研究对象 选择武汉市同济医院生殖医学中心2007年4 月至2007年6月进行IVF/ICSI—ET治疗周期获取 李豫峰等.核抑制剂(Roscovitine)对促排周期人未成熟卵母细胞体外成熟安全性 的初步研究?769? 的121个未成熟卵为研究对象.女方患者年龄为 (32.0?7.5)岁,不孕年限为(3.5?6.3)年.经腹腔 镜,子宫输卵管造影(HSG),B超,内分泌检查及男 方精液检查证实,输卵管及盆腔因素,子宫内膜异位 症,男性轻度的少弱精症及无精症,多囊卵巢综合征 (PCOS)是不孕的主要病因.每位患者均被事先告 知并同意进入本研究,本研究的开展已获我院生殖 与遗传研究伦理委员会的批准. 1.2卵母细胞的获取 采用GnRH—a长方案降调或拮抗剂(Cetroti- de,Serono)+促性腺激素(Gonal—F,Serono和 HMG,丽珠制药)进行超促排卵,方法按本中心常规 进行.当最大卵泡平均直径达17,18mm时,于 22:00时注射HCG5000,10000U,34,36h后 严格按照无菌要求经阴道超声指导下采卵.IVF患 者先采直径大于14mm成熟的卵泡行常规体外受 精,第2天脱颗粒并观察受精情况;后采直径小于 14mm的卵泡,使用透明质酸酶和机械法脱颗粒, 保持4,6层颗粒细胞,在倒置显微镜下观察其分 期.ICSI患者采取所有卵泡,使用透明质酸酶和机 械法脱颗粒,并观察卵母细胞成熟度.将卵按拆卵 时的成熟度分为3组:I组,有第一极体,为M?期 卵(成熟卵);?组,无第一极体也无生殖泡,为M工 期卵;?组,有生殖泡(germinalvesicle,GV),为GV 期卵.成熟组的卵按临床常规行常规IVF或ICSI; 未成熟组的卵进行体外培养成熟. 1.3培养液的配置 1.3.1IVM成熟培养液配制方法TCM一199+ 99,FBS 2OFBS+0.275mg/ml丙酮酸钠(TCM一1 和丙酮酸钠,美国Sigma公司)+0.15U/mlHCG +0.0"75U/mlFSH(HCG和Gonal—F,瑞士Serono 产品),80万U/L青霉素及75mg/L链霉素. 1.3.2Roscovitine培养液的制备将Roscovitine (LCLaboratories,美国)溶解于二甲基亚砜(DM— SO,美国Sigma公司),以50mmol/L的浓度分装, 一 70?保存.使用前用成熟培养液将Roscovitine 的浓度稀释成200p.mol/L. 1.4实验分组及培养步骤 本实验共分实验组和对照组.实验组(采用二 步法):未成熟卵母细胞先用加有200umol/L Roscovitine的培养液培养6h,然后将卵母细胞移 入IVM成熟培养液继续培养24,36h;对照组将 采集的未成熟卵母细胞直接用]VM成熟培养液培 养24~36h.以第一极体的形成判定卵母细胞成 熟. 1.5卵母细胞的免疫染色和标本观察 把所有M?期成熟卵母细胞经2%甲醛固定, 经0.02Triton-X2100(美国Sigma公司)透化处 理后,进行免疫染色.将卵母细胞移入1:250的一 抗(单克隆抗2微管抗体,美国Sigma公司)中,在 37?下孵化1h后,移人1:5000的二抗(生物素结 合的抗鼠IgG抗体,美国Sigma公司)中,37?培养 箱中孵化1h,再移入1:50的三抗(由异硫氰酸酯 荧光素标记的特异性抗生物素蛋白,美国Sigma公 司)中,37?培养箱中避光孵化30min.2次孵化之 间用含有59/6人血白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)冲 洗标本.经10~g/ml的Hoechst33342(美国Sig— ma公司)进行染色后制片,采用LSM510型激光共 聚焦显微镜(德国ZEISS公司)观察纺锤体及染色 体. 1.6统计学方法 计数资料的比较采用检验,以P<0.05为 差异有统计学意义.所有数据均采用SPSS12.0统 计软件包处理. 2结果 2.1两组培养后成熟翠比较 59个周期共获得121个未成熟卵母细胞.实 验组61个,经体外成熟培养后获5O个卵母细胞,进 行免疫染色后,可观察到染色体与纺锤体的卵母细 胞有39个;对照组60个,经体外成熟培养后获43 个卵母细胞,进行免疫染色后,可观察到染色体与纺 锤体的卵母细胞有32个.实验组的培养成熟率高 于对照组(82VS72),但差异无统计学意义(P >0.05),结果见表1.. 表1两组卵母细胞成熟率比较 2.2两组纺锤体和染色体正常翠的比较 纺锤体分型:?正常纺锤体:纺锤体呈对称的桶 型,且极性存在;?异常纺锤体:纺锤体极性消失或 纵轴上微管减少,部分或全部微管断裂,但尚能观察 到微管结构;?纺锤体消失:纺锤体缺失,纺锤体或 微管结构完全消散. 染色体分型:?正常染色体:染色体正常,即染 色体紧密排列在赤道板;?异常染色体:轻度异常染 ? 77O?华中科技大学(医学版)2009年12月第38卷第6期 色体为单根染色体或染色单体从赤道板的盘状结构 中脱落,异常染色体为结构松散,凝结成块或模糊不 清. 实验组获得成熟的卵母细胞纺锤体的形态异常 者15个,染色体异常者11个.对照组获得成熟的 卵母细胞纺锤体的形态异常者14个,染色体异常者 11个.两者比较,差异无统计学意义(P>0.05),结 果见表2. 表2培养成熟后M?期卵母细胞纺锤体和染色 体形态 3讨论 3.1核抑制剂对卵母细胞体外成熟的影响 卵母细胞在体外培养的过程中,由于核成熟抑 制的解除,核的成熟加快,以致核成熟后,胞质尚未完全成熟,不能满足以后的发育需要,使其继续发育 能力下降,,因此抑制核成熟的物质被引入到培养 系统,以达到胞质与核同步成熟的目的.成熟促进 因子(maturationpromotingfactor,MPF)是促进卵 母细胞恢复减数分裂的关键因子,由细胞周期蛋白 B和细胞分裂周期基因的蛋白产物(cdc2)结合构 成.MPF的激活必须有新的蛋白质的合成和cdc2 依次的磷酸化及去磷酸化过程.一些嘌呤衍生物如 Roscovitine,可以可逆性竞争性抑制ATP与cdc2 的结合,阻碍其去磷酸化,从而抑制MPF的激活, 延缓胞核的成熟过程. 本研究中实验组卵母细胞在含有200/~mol/L Roscovitine的培养液中培养6h,再转入IVM成熟 培养液培养24,36h,与直接体外成熟组比较,未 成熟卵母细胞的培养成熟率稍增加(82VS72), 但差异无统计学意义(P>0.05). 研究发现,在体外培养体系中获得的成熟卵母 细胞形成的胚胎,其发育潜能较体内获得的成熟卵 母细胞差,比正常的胚胎更易发生卵裂阻滞和延迟, 以至不能继续发育到囊胚阶段而致着床失败..j. Roscovitine作为一种选择性的MPF抑制剂通过对 卵母细胞核成熟短暂性的抑制,改变胞质,核成熟的 动态过程,延长了胞质在核恢复减数分裂前的发育 时间,能在不同程度上改变卵母细胞胞质和核成熟 不一致的状态,改善了发育能力.Schoevers鲁引在 猪卵子体外成熟培养液中加入Roscovitine,促进胞 核与胞质同步成熟,使猪卵的发育潜力得到改善. 3.2核抑制剂对卵母细胞安全性的影响 随着辅助生殖技术和细胞生物学的发展,人们 深刻认识到纺锤体和染色体直接影响和决定了配子 的形成和继续发育.排卵前的卵母细胞停留在第2 次减数分裂的中期,此时染色体与纺锤体以微管相 连.纺锤体把染色体固定在其赤道板上,结构正常的 纺锤体使染色体紧密排列于赤道板上,一旦纺锤体 结构紊乱,将引起染色体松散等形态学改变,直接导 致第二极体排出后染色体不分离,发生非整倍体化 并可能进一步降低卵母细胞的受精能力和胚胎的继 续发育能力. 未成熟卵母细胞体外成熟培养及体外受精胚胎 移植后着床率低的原因之一,可能是体外成熟的卵 母细胞纺锤体和染色体排列发生了异常,引起胚胎 发育潜能降低』.Sanfins等]的一项研究发现,体 外成熟培养和体内成熟培养的小鼠卵母细胞的纺锤 体有很大差异.Roscovitine对MPF活性的抑制具 有选择性,即Roscovitine在抑制MPF活性时对细 胞内其它的重要激酶如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK),蛋白激酶C等影响很小.因此,Roscovi— tine在抑制卵母细胞核成熟的过程中,对细胞内其 它生理过程的影响也较小,与其它非选择性的成熟 抑制比较更有利于细胞的正常发育,从而提高体外 成熟卵母细胞的质量. 本研究中,实验组与对照组比较,Roscovitine 抑制培养对成熟的卵母细胞的纺锤体及染色体形态 无不良影响,两组差异无统计学意义(P>0.05). 综上所述,选择性抑制剂Roscovitine的应用有 望改善未成熟卵的发育潜力,且安全性不受影响. 但这方面的研究尚在起步阶段,还有诸多问题如胚 胎发育到足月的能力,Roscovitine对子代的影响等 均有待研究.对卵母细胞成熟抑制的研究,必将推 动卵母细胞减数分裂调控机制的研究进展,最终将 有助于卵母细胞发育潜力问题的解决,值得更加深 入的研究. 参考文献 [1]LEDUA,KADOCHIJ,BOURCIGAUXN,eta1.Invitroo— ocytematurationforthetreatmentofinfertilityassociated withpolycysticovariansyndrome:theFrenchexperienceEJ]. HumReprod.2005,20(2):420—424. (下转第774页) ? 774?华中科技大学(医学版)2009年12月第38卷第6期 增加,它对牛血清白蛋白的包封效率也增加].因 此,我们选择较高分子量(340kD)和脱乙酰度 (90)的壳聚糖进行试验. 壳聚糖中氨基的电离常数(pKa)为6.5,因此当 pH值为5.5时,壳聚糖中大多数氨基团(>9O9/6) 处于溶解状态.生理pH值状态下,绝大多数正离 子将被中和,因此壳聚糖变得难以溶解.这一特性 保证了在低pH值环境下形成的纳米粒子在生理 pH值环境下非常稳定,不会发生化学交联.本研 究中我们将壳聚糖纳米颗粒的制备条件控制在 55?和PH值5.5的环境下. 本研究表明:利用壳聚糖和ODN之间的静电 作用,在一定条件下,采用复凝聚法制备的壳聚糖一 ODN纳米粒子,在改善细胞对ODN的内摄作用和 保护ODN免于被核酸酶降解作用方面是有效的. 壳聚糖是反义治疗的有效载体,利用纳米技术抑制 分枝结核杆菌是完全可行的.同时,由于本研究是 体外研究,并未进行体内试验,因此该技术是否可用 于人体治疗结核病还需大量的研究. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 参考文献 LAMBERTG.FATTALE.COUVREURP.NanoDarticulate systemsforthedeliveryofantisenseoligonuc1eotides[J].Adv DrugDelivRev,2001,47(1):99112. MA()HQ,R()YK,TR0UNG—LEVI,eta1.ChitosanDNA nanoparticlesasgenecarriers:synthesis,characterizati0nand transfectionefficiency[J].JControlRelease,2001,7O(3): 399—421. FAHEYRC.Novelthiolsofprokary.tes[J].AnnuRevMi crobiol,2001,55(1):333—356. 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