冷活性琥珀酸脱氢酶的特性_cropped

冷活性琥珀酸脱氢酶的特性_cropped ()2004 年 2 月 Feb. 2004 自然科学版北京师范大学学报 ( ) Journal of Beijing Normal U niversity Nat ural Science Vol . 40 No . 1 第 40 卷 第 1 期 3 冷活性琥珀酸脱氢酶的特性 )) 12† 辛明秀周培瑾 ( ) ) 1北京师范大学生命科学学院 ,100875 ,北京 ; 2中国科学院微生物研究所 , )100080 ,北京 ?第一作者 45 岁 , 男 , 副教授 ( ) ( 摘要 用常规酶学方法从嗜冷酵母 Y18中分离纯化有催化活性的琥珀酸脱氢酶 succinate ) dehydrogenase , SD H. 该酶的最适反应温度为 20 ?,0 ?仍然保持酶活性的 20 % , 40 ?处理 30 min 酶活性损失 90 . 4 % ,不同温度处理后酶在 280 nm 的紫外吸收明显改变 ,随温度升高在 280 nm 紫外吸收值增大 . 这些结果明所分离到的 SD H 是对温度敏感的冷活性酶. 纯化的 SD H 经 PA GE 3 ( ) 电泳显示单一条带 ,SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS2PA GE测出相对分子质量为60 ×10和 32 3 () () ×10的 2 条带 ,分别为黄素蛋白 flavop rotein , F P大亚基和铁蛋白 iro n2p rotein , IP小亚基. 通过 () 对 F P 的 1 491 个碱基的 DNA 序列分析表明 酿酒酵母 F P 基因全序列由 1 923 个碱基组成,菌株 Y18 与酿酒酵母具有很高的 DNA 序列同源性 ; Y18 与酿酒酵母 F P 一级结构包括酶的活性中心基本一致 ,但 Y18 的 F P 中 3 个位置的氨基酸变为 R 基较小的氨基酸 ,并有 3 个位置的氨基酸被在 β( ) 2转角处出现频率较高的氨基酸所取代 丝氨酸 、天冬氨酸和苏氨酸. 这些结构特性可能使 Y18 () SD H 的空间结构更具柔韧性 flexibilit y,有利于在低温条件下发挥催化功能. 关键词 嗜冷菌 ; 冷活性酶 ; 琥珀酸脱氢酶 ; 黄素蛋白 分类号 Q 554 . 9 ; Q 936 冷活性酶是由冷适应微生物产生的一类酶 ,这类酶具有较低的最适反应温度和在低温范 1 围内具有较高的催化活性. 研究极端环境温度细胞中的酶学特性 ,对于理解蛋白质结构与 功能的关系以及酶催化的分子机制具重要意义. 对冷活性酶的研究主要集中在一些胞外酶如 蛋白酶 、脂酶 、淀粉酶等 ,对胞内代谢酶类进行的研究较少. 胞内代谢酶类对嗜冷菌在低温条件 2 23 下完成其生命活动起重要作用. 近年来对胞内冷活性代谢酶类的研究正受到重视. ( ) 琥珀酸脱氢酶 SD H存在于原核生物的细胞膜和真核生物的线粒体内膜上 ,是一种和膜 紧密结合的蛋白质 、有氧呼吸链的一个重要组成部分 . 哺乳动物 、大肠杆菌和酿酒酵母中的 4 5 SD H 已被分离纯化 ,酿酒酵母 F P 的基因已被克隆,对光合紫细菌复合体 ?进行了研究, 6 ( ) 对原核生物和真核生物 SD H 的酶学特性进行了比较. 本文报道嗜冷酵母 Y18SD H 的酶学 特性及 F P 结构特性分析 . 1 材料和方法 ( 1 . 1 材料 嗜冷酵母 Y18 由作者从南极土壤样品分离. 羧甲基纤维素 CM22 上海化学试剂 ) ( ) ( 采购站试剂厂; 丙烯酰胺 、甲叉双丙烯酰胺 Sigma 公司; M T T 噻唑蓝 , 华美生物工程公 ) ( ) ( ) 司;分子量标准蛋白 Pro mege 公司; 等电点标准蛋白 Amersham Phar maia Biotech 公司; ( )3 国家自然科学基金资助项目 30170001 † 联系人 收稿日期 :2003208220 ) ( T EM ED Haver hii Suffolk ,英格兰. 其余试剂均为北京化工厂生产的分析纯试剂. 1 . 2 试验方法 ( 1 . 2 . 1 粗酶液的制备 活化菌种接种于酵母汁培养基并于 10 ?培养 60 h 以下操作均在 4 ) ( ?进行,离心收集细胞并用预冷无菌水洗涤 2 次 ,冰浴条件破碎细胞 ,离心 相对离心力 f =rc 3 4 ( ) ) 4 ×10,10 min,取上清再离心 f = 1 . 6 ×10,30 min,最终上清即为粗酶液. rc 1 . 2 . 2 酶的分离纯化 4 ?下操作 ,向粗酶液中缓缓加入硫酸铵使其质量浓度达到 250 g? - 1 4 ( ) ( ) ( L , 离心 f = 1 . 6 ×10,20 min,沉淀用柠檬酸 磷酸盐缓冲液 PB溶解 ,离心 f = 2 . 6 × rc rc 4 - 1 ) 10,30 min,上清留下一部处理. 将用蒸馏水浸泡过的羧甲基纤维素 CM22 经 0 . 5 mol L? - 1 () () NaO H2HCl2NaO H 处理转型后装柱 2 cm ×25 cm,用 150 mL PB 0 . 005 molL? , p H5 . 0平 - 1 - 1 () ρ衡 ,流速 3 mL m?in . 取 3 mL 酶液 蛋白质量浓度 = 12 gL? 上样后用上述缓冲液洗脱 , - 1 ( ) ( 当流出液的 D低于 0 . 05 时 第 11 管,开始进行线性梯度洗脱 PB ,0 . 005 molL? , p H5 . 280 - 1 - 1 - 1 ( ) ) 0 ; PB ,0 . 005 molL? , p H5 . 0 , 0 . 4 molL? NaCl,分部收集 3 mL 管? ,分别检测每管流 出 ( ) 液的 D 和 SD H 酶活性 z SD H,将有活性的收集峰汇合 ,浓缩酶液 ,测定蛋白质的体积 V 和 280 ( ) z SD H. 1 . 2 . 3 酶学研究方法 酶活性 z 的测定 、蛋白质含量的测定 、米氏常数 K的值测定 、酶的 m p H 范围和金属离子对 z 的影响 、PA GE 及 SDS2PA GE 、等电点测定等均按常规酶学或生化研 7 究方法. 酶活性染色按 Prasad Reddy的方法进行 . 制备电泳在电泳结束后 ,将凝胶置于活性 染色液中于 4,8 ?染色 10,30 min ,将有活性的条带切出 ,回收酶蛋白. ( ) 酶的温度范围和热稳定性 :于不同温度分别测定 z SD H,并将酶液于不同温度处理 30 () min 后于 280 nm 分别测定 SD H 的紫外吸收光谱 DU27 Spect rop hoto meter Backman,同时分 ( ) 别测定残存 z SD H. ( 根 据 对 4 种 生 物 酿 酒 酵 母 S accha rom yces ce rev isi ae , 1 . 2 . 4 SD H 的 F P DNA 序列分 析 ( ( ) ) ) M86906、普氏立克次氏体 R icket tsi a p row az eki i , M88696、牛心 bovine heart , M60879及 ( ) ( 恶性疟原虫 Pl as m odi u m f alci p a r u m , D865734 种生物的基因序列均来自国际核酸序列 ) 库的 F P DNA 序列的比较 , 找出同源序列 , 引物 P1 5′2A GA TCCCACAC T GT T GC T GC23′, P2 5′2A GCACCAC2 GGGA T TCC T T TC23′,以 Y18 的总 DNA 为模板进行 PCR GEM( ) 扩增 ,纯化的 PCR 产物与载体 P 连接后转化大肠杆菌 8 ( ) J M109 . DNA 同源性分析采用 Clustalw X 1166 进行匹 配排列. 2 结果 2 . 1 SD H 的纯化 SD H 可被 CM22 阳离子纤维素柱所吸 附 . 当梯度洗脱时随着 NaCl 浓度的增加 , 约在 55 , 64 管 SD H 被洗脱下来 . 收集酶液浓缩 , 通过制备电泳回收得到 () 纯化的 SD H ,经 PA GE 电泳显示单一条带 图 12a,经 SDS2 3 3 图 1 SD H 自然胶电泳( a) 和 ( PA GE 电泳分析 ,可观察到 60 ×10和 32 ×10的 2 条带 图 SDS2PAGE 凝胶电泳( b)) 12b,说明纯化的 SD H 由大小 2 个亚基组成. 酶的纯化过1 . mar ker , 2 . SD H. ()110 第 40 卷 北京师范大学学报 自然科学版 程归纳为表 1 . 表 1 冷活性琥珀酸脱氢酶( SD H) 的纯化 SD H 比活性 蛋白质量浓度 总活性 SD H - 1纯化步骤 纯化倍数 N 酶产率 Y / % - 1( ) μz SD H/kat ( ) (μ)z SD H/ kat g? tot ρ( ) ( )m 蛋白/ gL? 粗酶液 0 . 22 10 . 45 15 . 84 1 . 00 100 . 0 - 1250 gL? 硫酸胺 12 . 00 4 . 36 90 . 68 5 . 71 41 . 7 CM22 柱层析200 . 83 2 . 37 118 . 36 7 . 46 22 . 0 PA GE 1 . 00 1 . 41 703 . 14 44 . 30 13 . 0 ( ) SD H 的最适 p H 为 9 . 5 ,p H11 时仍保持较高的 z SD H, 以琥珀酸为底物时 2 . 2 酶的性质 ( ) 表明 SD H 为一碱性酶. 以琥珀酸为底物测得其最适反应温度为 20 ?图 2,在 0 ?时仍然保 ( ) ( ) 持最适温度时 z SD H的 20 %. 酶液于 30 ,35 和 40 ?分别处理 10,30 min 后测定 z SD H, θ图 2 温度 对 SD H 的酶活性 z( SD H) 的影响 图 3 SD H 的热稳定性 ( )发现 40 ?处理 30 min 时 , z SD H () 损失 90 . 4 % 图 3. 经不同温度处理 后 ,酶液在 280 nm 的紫外吸收光谱 发生明显的变化 ,随温度升高在 280 ( ) nm 紫外吸收 D 增大 图 4 . 这些 280 结果表明此酶是一个对热很敏感的 冷活性酶. 以不同浓度琥珀酸为底物于 20 ?测 出 SDH 的 K= 0107 mmol ?m - 1 L . 用聚丙烯酰胺凝胶等电点聚焦 测 SD H 的等电点 p I = 5 . 85 . 实验发 现 Ag , M n , Al 强 烈 抑 制 SD H 的 活 性 . Hg , Fe , Cu , Zn 和 Pb 也对其活性 有抑制作用. 适量的 K ,Na ,Mg 和 Ca 对 SD H 有激活作用 ,其中 Mg 和 Ca 最为明显. PCR 扩 增 得 到 一 个 1 . 5 kb 的 图 4 SD H 的紫外吸收光谱 1 . 对照 ; 2 . 30 ?; 3 . 35 ?; 4 . 40 ?; 5 . 45 ?; 6 . 50 ?. DNA 片段 , 序列分析表明此片 段 为 ()112 第 40 卷 北京师范大学学报 自然科学版 11 的. αβ2螺旋和2折叠对酶蛋白的空间结构和功能具有重要的意义. 多肽链中氨基酸的 R 基越 α小就越容易形成 2螺旋. 从表 2 看出引起改变的 4 种氨基酸中除缬氨酸变为天冬氨酸外 ,丝 氨酸 、甲硫氨酸和苏氨酸的 R 基分别比亮氨酸 、赖氨酸和甲硫氨酸的 R 基小. 虽然发生改变的 氨基酸所占的比例较小 ,但他们可能处在酶蛋白中的关键位置. 另一方面 ,发生改变的 6 个氨 () 基酸中 ,除赖氨酸变为甲硫氨酸外 ,其余几个氨基酸 丝氨酸 、天冬氨酸和苏氨酸都是在多肽 链转弯的位置出现频率较高的氨基酸 ,这些氨基酸和多肽链中转角的形成有密切关系. 由此推 测由于这几个氨基酸的改变使 SD H 的空间结构形成几个较小的区域 ,从而增加了酶蛋白的柔 9 210 () 韧性 flexibilit y. 这与其他关于冷活性酶的结构的论点是一种具柔韧性的结构是一致的. 酶蛋白的柔韧性结构有利于其在低温条件下发挥催化功能. 通过对冷活性 SD H 的研究得出以下结论 : 冷活性酶和中温酶的一级结构很相似 ,但酶的 高级结构不同 ,从而造成酶催化功能的不同 ; 处于冷活性酶关键位置的氨基酸变为 R 基较小 αβ的氨基酸 ,这样有利于冷活性酶在低温条件下形成 2螺旋并进一步形成高级结构 ; 由于 2转 角氨基酸的增多 ,使冷活性酶的空间结构形成更多小的区域 ,从而使冷活性酶的结构更具柔韧 性 ,有利于在低温条件下发挥催化功能. 4 参考文献 1 Feller G , Narinx E , Arpigny J L , et al . Enzymes form p sychrop hilic organisms J . F EMS Microbiol Rev , 1996 , 18 :189 L eila Birolo , L uisa Tutino M , Bianca F , et al . 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Eur J Biochem , 2001 , 268 :5074 THE C HA RACTERISTICS OF A COLD2ACTIVE S UCCI NATE D E HYD RO GENASE FROM A PSYC HROP HIL IC Y EAST Y18 ))12Xin Mingxiu Zho u Peijin ( ) 1Collage of Life Sciences , Beijing No r mal U niversit y , 100875 , Beijing , China ; ) )2Instit ute of Micro biology , Chinese Academy of Sciences , 100080 , Beijing , China Abstract As a first step to understand t he st ruct ural basis of cold adap tatio n and t he relatio nship bet ween t he st ruct ure and f unctio n of cold2active enzymes , The cold2active ho mology ( ) of succinate dehydrogenase SD H is io slated f ro m a p sychrop hilic yeast Y18 . The p urified enzyme is ho mogeneo us as deter mined by PA GE in native gels. SDS2PA GE of t he enzyme 3 3 revealed t wo subunit s wit h molecular weight s of 64 ×10and 32 ×10, respectively. The ) ( solublized SD H was p urified by grind t he cells wit h SiOat 0 4 ?, N HSOp recipitatio n , 2 4 2 4 CMC2cellulo se colume and PA GE elect rop ho resis. The op timal p H of t his enzyme is 9 . 5 and t he - 1 Kof t his enzyme is 0 . 07 mmolL? w hen deter mined at 20 ? wit h succinate as subst rate . Them enzyme is a cold2active enzyme , w hich has a high activit y at low temperat ure and wit h t he op timal temperat ure of 20 ?. The enzyme lo ses 90 . 4 % activit y af ter t reated at 40 ?fo r 30 min , and t he U V spect rum at 280 nm is changed rapidly w hen t reated at temperat ure above it s op timal temperat ure . These p roperties can explain t he temperat ure sensitivit y of t he enzyme . A 1 . 5 kb ( ) DNA f ragment of flavop rotein t he big subunit of SD Hby PCR is o btained. DNA analysis indicated t hat t his f ragment have high ho mology wit h t hat f ro m S accha rom yces ce rev isi ve . Alt ho ugh t he p rimary st ruct ure of amino acid of t his subunit speculated f ro m t he DNA sequence have high ho mology bet ween Y18 and S accha rom yces ce rev isi v , t here are still so me difference bet ween t hem. In Y18 , t hree amino acids beco me t hat wit h small R2gro up and t hree amino acids ) ( βSer , Asp , Thrare substit uted by ot hers w hich of ten appear in t he 2t ur n st ruct ure in p rotein . These characteristics may make t he space st ruct ure of SD H f ro m Y18 have mo re flexibility so as to f unctio n at low temperat ure . Key words p sychrop hiles ; cold2active enzyme ; succinate dehydrogenase ; flavop rotein