副溶血性弧菌检测 副溶血性弧菌的致病性及其快速检测

副溶血性弧菌检测 副溶血性弧菌的致病性及其快速检测 ?53? 副溶血性弧菌的致病性及其快速检测 宁喜斌 刘代新 张继伦 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是革兰阴性嗜盐性细菌,隶属弧菌科中的弧菌属,它是一种人畜共患病菌[1]。最早由Fujino等在1950年从日本1例食物中毒患者排泄物中初次分离得到,它主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类等海产品中,是引起食源性疾病的主要病原之一。人类会由于食用污染大量该菌而又未经良好加工处理的海产品而引发突发性食物中毒,可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和发烧等典型胃肠炎反应。它是日本、欧美和东南亚国家食物中毒和急性腹泻病的重要病原菌,约占日本全部食物中毒的40%,60%[2-6]。国家食源性疾病 1 监测网数据显示,显著变化,特别是在沿海省份,食物中毒,趋势,[7]。副溶血、、对虾和牙鲆等甲壳类水产动物致病,间接影响人类的健康[1]。 副溶血性弧菌的致病因子 研究表明,副溶血性弧菌的致病因子主要有溶血素、脲酶;其他与致病有关的致病因子也在研究中。 11溶血素 副溶血性弧菌主要致病作用在于它可以产生多种溶血素,它们是耐热直接溶血素 (thermostabledirecthemolysin,TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(TDH2relatedhemolysin,TRH)和不耐热溶血素(thermolabilehemolysin,TLH)。流行病学研究表明,临床上分离出的副溶血性弧菌几乎95%以上都会使特殊的我萋血琼脂培养基产生β溶血,被称为神奈川现象(kangawaphenomenon,KP)。Obara(1971)从KP阳性的细菌培养滤液中分离到耐热性溶血素,该毒素是不含糖或脂质的蛋白质,由2个相同的亚单位组成,由165个 [8] 氨基酸残基组成,相对分子质量(Mr)为42×103,此种溶血素在100?、10min仍保持活性,并在加入卵磷脂后不能增强其溶血活性,表明是直接作用于红细胞,故称为TDH。TDH由tdh基因编码,TDH阳性株含有2个tdh基因,即tdh1和tdh2。tdh1和tdh2编码的TDH仅有7个氨基酸不同,典型的KP+ 2 分离株的2种基因拷贝有9712%同源,其溶血活性相同,抗原性有交叉,不能区分,经Edman降解法得到的蛋白质序列比较发现KP+株tdh2具有表达优势[9211]。 等批KP,表明副溶血外,还有其他致病因子,从这1种溶血素,它可以引起红细胞溶血,但不耐热,且引起溶血的敏感动物红细胞的种类与TDH不同(对牛红细胞的溶血活性很高,对马红细胞无溶血活性),现命名为TRH。1O%,15%临床分离株产生TRH,这些分离株一般TDH阴性,TRH在60?以上10min即可灭活,其 Mr为48×10,是由2个Mr各为23×10的亚单位 3 3 组成,TRH与TDH的氨基酸序列有7O%同源,编码这2种毒素的基因trh和tdh的同源性为6811%,TRH与TDH的抗原性有部分交叉,两者免疫原性相 似。trh基因据其核酸序列的变化又可分为2个亚组:trhl和trh2基因,两者同源性为84%,分别编码蛋白TRH1和TRH2。Kishishita等[13]研究认为,trhl和trh2序列的不同会影响其蛋白质的特性,trhl的基因产物对人、鼠、羊和牛的红细胞均有溶血作用,而trh2基因产物只对人和兔的红细胞有溶血活性且溶血活性相对较弱。 TDH和TRH具有直接溶血活性,可使多种红细 3 胞发生溶血,溶血过程可以分为2步:首先,溶血素与宿主的红细胞膜结合,此过程呈温度依赖性并由受体介导,主要是神经节苷脂22(GM2),GM1也参与信号介导;而后,在红细胞膜表面成孔并最终导致红细胞胶样渗透溶解,此过程也呈温度依赖性。兔、狗、豚鼠和人类的红细胞对TDH较敏感。TDH还具 作者单位:上海水产大学食品学院,上海200090 通讯作者:宁喜斌,E2mail:xbning@shfu1edu1cn ?54? 有肠毒素活性和细胞毒活性,在兔动物模型中可导 致肠液积聚和肠道氯化物的外排。TDH还引起人类腹泻,其致病机制主要是,TDH被认为是一种孔蛋白,可使细胞膜上形成小孔通道,引起细胞外Ca2+浓度增加,从而引起Ca2+激活的Cl-通道开放,Cl-分泌增加。当TDH引起的这种细胞渗透压的改变超过细胞的代偿调节能力,将使细胞发生病理和形态学改变,导致细胞膨胀甚至死亡。TDH还具有心脏毒性和致死作用[14,15]。 近年来的研究发现,副溶血性弧菌除了产生TDH和TRH溶血素外,还可产生另1种溶血素,即TLH。Hatsumit等[16]于1985年研究发现无论是临床分离株还是环境分离株都含有tlh基因,并具有种的特异性,生化试验表明TLH是一种非典型的磷脂酶,需要卵磷脂的存在才具有溶血活性,但其功能和 4 致病性仍不十分清楚。TLH由tlh基因编码,国外已报道了编码TLH的基因序列,tlh位于染色体上,长约113kb。李志峰等[17]对tlh基因进行克隆和序列分析,显示TLH作为特异性诊断靶抗原,具有潜在的应用价值。 21脲酶 ,]分析发现,Ure,Ure+菌与TRH之间呈正相关性和trh基因都位于小的复制子上,且两者的基因序列位于染色体DNA相邻的编码区,利用长距和精确聚合酶链反应(PCR)测得ure和trh基因之间的距离小于815kb。研究还表明,在尿素缺乏时,副溶血性弧菌Ure的表达活性极低,只达1%,当有尿素作为介质时,其活性可提高100倍。综合以上因素,很多学者认为Ure可以作为快速检测副溶血性弧菌,尤其是KP-菌的一个生物学标志。Okuda等[19]对1979,1995年从美国西海岸分离的Ure+和Ure-副溶血弧菌进行检测,结果表明60株为Ure+株,59株(98%)携带trh(trhl和/或trh2),54株(90%)携带tdh;25株为Ure2株,20株(80%)携带tdh,但无1株携带trh基因。 31其他致病因子 通过兔肠绒毛上皮黏附试 导、鞭毛和细胞骨架可能在侵袭过程中发挥一定作用。Wang等[22]发现甲基转移酶基因位于副溶血性弧菌的22179kb致病岛,它的存在与弧菌的毒力因子的相关性超过98%。 致病性副溶血性弧菌的检测11核酸分子杂交法 5 (1)耐热直接溶血素基因(tdh)探针:1992年,Lee等[23]建立了1种检测副溶血性弧菌tdh的基因 探针方法,试验结果表明,该探针可特异地与89株副溶血性弧菌分离株的DNA杂交,对其他弧菌或其他肠道、非肠道菌(n=48)不反应。利用该探针可直接检测人工染菌的食品,无需进行增菌分离。 (2)耐热直接溶血素相关毒素基因(trh)探针:2006年,Raghunath等[24]用碱性磷酸酶标记的针对trh的寡聚核苷酸探针,trh+的副溶血性弧菌。,trh100%、灵敏5102,3),1h,该trh+的副溶血性(3)不耐热溶血素基因(tlh)探针:McCarthy等[25]应用碱性磷酸酶(AP)标记的基因探针检测副溶血性弧菌的tlh。在124株试验株中,AP标记的探针仅对26株副溶血性弧菌杂交,而对88株其他弧菌和l0株非弧菌细菌均不杂交,应用该探针和API20E鉴定系统检测了从牡蛎中分离的206株疑似副溶血性弧菌,两者检测结果97%相同。 21免疫学方法 目前,南方医科大学流行病学 系的研究者将tlh基因进行了克隆,并对其编码的TLH蛋白进行表达和纯化,利用已制备的TLH蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗TLH多克隆抗体,同时联合兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体建立酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法。其直接检测副溶血性弧菌的效果虽未,但是TLH具有种特异性,通过检测TLH可以为副溶血性弧菌的感染情况提供依据 6 [17,26]。 本实验室针用1株致病的副溶血性弧菌免疫兔子制备多克 隆抗体建立的间接ELISA法,具有很强的特异性和敏感性, 检测限可达104CFU/ml[27]。 31PCR方法 1999年,Yamaichi等[28]已经完成副溶血性 弧菌的基因组测序,VP的毒力基因序列得到进一步确定。针 对致病性副溶血性弧菌的较好PCR检测方法有多重PCR技 术和荧光定量PCR技术。 验,对副溶血性弧菌的黏附机制进行研究,菌毛与该菌 的黏附作用有关[20]。很多实验证实副溶血性弧菌具有侵袭 力,并且证实侵袭力是其毒力的一部分。Akeda等[21]通过药 敏试验,发现副溶血性弧菌对Caco22细胞产生侵袭作用,而 细胞松弛素D、诺考达唑能阻断副溶血性弧菌AQ4023对 Caco22细胞的侵袭力,这也表明酪氨酸蛋白激酶介导的信号 转 ?55? (1)多重PCR技术:Bej等[29]根据副溶血性弧菌 101OkudaJ,NishibuchiM1Manifestationofthekanagawa phenomenon,thevirulence2associatedphenotypeofvibriopa rahaemolyticusdependsonaparticularsinglebasechangeinthe promoterofthethemostabledirecthemolysingeneMicrobiolIm munol,l996,40:59,65 7 111NishibuchiM,KaperJB1Nueleotidesequenceofthermstable direct themolyain gene of vibrio parahaemolyticus1 Bacteriology,1985,162:558,564 121NishibuchiM,TaniguehiT,MizawaT1Cloningandnucleotide sequenceofthegene(trh)encodingthehemolysinrelatedtothethermostabledirecthemolysinofVibrioparahaemolyticus1InfectImmun,1989,57:2691,2697 131KishishitaM,MatsuokaN,KumagaiK,etal1Sequence variationinthethermostabledirecthemolysin2relatedhemolysin(trh) geneofVibrioparahaemolyticus1ApplEnvimam Microbiol,1992,58:2449,2457 141TangC,lidaT,YamamotoK1Analysisoffunctionaldomainof vibrioparahaemolyticusthermstablethemolyainusingm,199 8 7,150:289,R,,F,etal1Enterotoxicityand ofVibrioparahaemolyticusthermostabledirecthemolysininv itrosystems1InfectImmun,2000,68:3180,3191 161TaniguchiH,OhtaH,OgawaM,etal1Cloningandexpressio n inesherichiacoilofvibrioparahaemolyticusthermostabledire cthemolysinandthermolabilehemolysingenes1JBacteriol,198 5,162:5l0,5l5 171李志峰,聂军1副溶血弧菌tlh基因的克隆及序列分析1 编码不耐热溶血素的tlh基因、耐热直接溶血素的tdh基 因和相对耐热直接溶血素的trh基因设计引物,利用多重 PCR检测111份样品中的副溶血性弧菌,其敏感性高、特异 性强,而且能区分产毒株和非产毒株,远优于传统细菌学方 法。吴彩云等[30]建立了1种双重PCR方法,该方法可同时 检测携带有tl和tdh基因的副溶血弧菌毒力菌株。结果表明, 该法不但具有常规PCR的优点,而且还能节省耗材和时间, 可用于检测水产食品以及临床样品中的副溶血弧菌的毒力 菌株。 (2)荧光定量PCR技术:Blackstone等[31]建立了1种基于 TaqMan探针的快速定量检测含tdh的副溶血性弧菌的实时 PCR方法,特异性检测致病性副溶血性弧菌,该试验的DNA 灵敏度为lCFU/PCR体系,试验快速、准确,整个反应1h内就 9 可完成。该方法具有特异性、敏感性及精确性高的优点,同时 避免了PCR后续步骤,减少了产物污染的机会。 参 考 文 献 11LeeKK1Vibrioparahaemolyticusinandediblemollusk1,5485 21DouetJP,M,DA,etal1Studyofthe haemolyticprocessandreceptorsofthermostabledirecthaernolysinfromVibrioparahaemolyticus1ResMicrobiol,1996,147:687,696 31VongxayK1PrevalenceofvibrioparahaemolyticusinseafoodsandtheirprocessingenvironmentsasdetectedbyduplexPCR1SciFoodAgric,2006,86:1871,1877 41NairGB,RamamurthyT,BhattacharyaSK,etal1Global disseminationofvibrioparahaemolyticusserotypeO3:K6anditsserovariants1ClinMicrobioRev,2007,20:39, 4851SuYC,LiuCC1Vibrioparahaemolyticus:aconcernofseafood safety1FoodMicrobio,2007,24:549,558 61StephenieLD,AngeloD,Lee2AnnJ1Anoverviewofvibriovulnificusandvibrioparahaemolyticus1CompRevFoodSciFoodSaf,2007,6:120,144 71刘秀梅1食源性疾病监控技术的研究1中国食品卫生 10 中国人兽共患病杂志,2003,19:10,12 181ParkKS,IidaT,YarnaiehiY,eta11Geneticcharacterization ofDNAregioncontainingthetrhanduregenesofVibrioparahaemolyticus1InfectImmun,2000,68:5742, 5748191OkudaJ,IshibashiM,AbbottSL,etal1Analysisofthe thermostabledirecthemolysin(tdh)geneandthetdh2relatedhemolysin(trh)genesinurease2positivestrainsofVibrioparahaemolyticusisolatedonthewestcoastoftheUnitedStates.JClinMicrobiol,1997,35:1965,1971 201ChakrabartiMK,SinhaAK,BiswasT1AdherenceofVibrio parahaemolyticustorabbitintestinalepithelialcellsinvitro1FEMSMierobiolLett,1991,84:113,118 211AkedaY,NayamaK,YanaamotoK,etal1Invasivephenotype ofVibrioparahaemolyticus1JInfectDis,1997,176:822, 824221WangHZ,WangWM,O’TooleD,etal1Identificationofa DNAmethyltransferasegenecarriedonapathogenicityisland2likeelement (VPAI)inVibrioparahaemolyticusanditsprevalenceamongclinicalandenvironmentalisolates1ApplEnvironMicrobiol,2006 11 ,72:4455,4460 杂志,2004,16:3,9 81LevinRE1Vibrioparahaemolyticus,anotablylethalhumanpathogenderivedfromseafood:areviewofitspathogenicity,characteristics,subspeciescharacterization,andmolecularmethodsofdetection1FoodBiotech,2006,20:92, 12891NishibuchiM,KaperJB1Themostabledirecthemolysingeneofvibrioparahaemolyticusavirulencegeneacquiredbyamarinabacterium1Infectlrnmun,1995,63:2093,2099 ?56? 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